Name: 通过乙二胺四乙酸介导的脱粘性快速、经济高效、无酶地传代人多能干细胞在饲养细胞上 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 了解利用乙二胺四乙酸介导的脱粘附技术，在饲养细胞上对人多能干细胞进行快速、经济高效的无酶传代方法。该技术可保持细胞干性并减少坏死风险。

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我们感谢 Lars Moen 在初步实验期间提供的帮助，以及奥斯陆大学医院挪威干细胞研究中心的挪威人类多能干细胞核心设施提供的设施支持&#160;。H9 人胚胎干细胞系来自 WiCell，HS429 人胚胎干细胞系来自卡罗林斯卡研究所的 Outi Hovatta。这两株细胞系的使用均符合材料转让协议的规定。NCS001 和 NCS002 人诱导多能干细胞系由挪威人类多能干细胞核心设施制备。重编程工作及本文报道的所有研究均获得挪威东南部地区伦理委员会的批准（批准号 REK 2017/110）。

有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. 人类成纤维细胞的培养及饲养细胞层的制备
<ol>
	<li>接种 0.5 × 106 人包皮成纤维细胞（下文简称 &#34;饲养层细胞&#34;每个T-75培养瓶（根据需要确定培养瓶数量）加入20 mL含10%胎牛血清（FBS）的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），以下简称 &#34;饲养层细胞培养基&#34;</li>
	<li>当饲养细胞达到90%融合度时，移除培养基，并用10 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）每瓶洗涤3次，以避免培养基中的成分抑制胰蛋白酶活性。每瓶加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶置于37 °C、5% CO₂培养箱中2 在培养箱中孵育5分钟，或直至饲养细胞从培养瓶脱离。在显微镜下观察细胞脱离情况，可见细胞呈悬浮的细胞团或单个细胞。</li>
	<li>向每个培养瓶中加入5 mL新鲜预热的饲养细胞培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA，并用移液器轻轻吹打悬浮饲养细胞。</li>
	<li>将饲养细胞转移至15 mL离心管中。盖紧管盖，于200 × g条件下离心，使饲养细胞沉淀成团。 g 5分钟。</li>
	<li>小心移除上清液，避免扰动饲养细胞沉淀。随后，将沉淀轻轻重悬于4 mL新鲜饲养细胞培养基中。在使用细胞计数板或其他细胞计数装置计数前，确保饲养细胞充分重悬。</li>
	<li>加入 0.5 × 106 将饲养细胞按所需数量接种至新的T-75培养瓶中进行扩增，每瓶加入20 mL新鲜饲养细胞培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2 孵育至饲养细胞达到90%融合度。 
	注意：饲养细胞至少可使用至第25代。</li>
	<li>根据将用于培养人胚胎干细胞（hESCs）/人诱导多能干细胞（hiPSCs）的35 mm组织培养皿数量，计算所需的饲养细胞数量。 
	注意：通常，3.0 × 105 每培养皿的饲养细胞数量足以形成一层汇合的饲养细胞层。</li>
	<li>为防止饲养层细胞增殖，需通过以下两种方法之一确保其有丝分裂被阻断。 
	注意：两种方法均可制备大量有丝分裂阻滞的饲养细胞，并分装冻存，以备后续使用。
	<ol>
		<li>通过γ射线照射进行有丝分裂阻滞：将所需全部饲养细胞转移至50 mL离心管中，并加入饲养细胞培养基至总体积5 mL。立即于室温下运送至γ射线照射仪，进行照射以实现饲养细胞的有丝分裂阻滞（300 kV，10 mA，照射20 min）。 
		注意：运输过程中的延迟可能导致饲养细胞意外贴附到50 mL离心管管壁上。若运输时间超过几分钟，须在运输过程中持续振荡管子，以确保饲养细胞保持悬浮状态。</li>
		<li>使用丝裂霉素C进行有丝分裂阻滞：将所需全部饲养细胞转移至50 mL离心管中，加入5 mL饲养细胞培养基，然后加入15 mL含20 μg/mL丝裂霉素C的饲养细胞培养基，混匀后于37°C孵育&#160; 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 3 小时。加入 20 mL 37 °C 的 PBS，于 200 × g 孵育5分钟，再用PBS洗涤两次，然后重悬于饲养细胞培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在饲养细胞经有丝分裂阻断后，返回组织培养超净台，将饲养细胞以 3.0 × 105 每35 mm组织培养皿接种细胞数如下：确保饲养细胞充分重悬，加入饲养细胞培养基，使饲养细胞浓度达到1.5 × 105 每毫升加入2 mL该饲养细胞悬液至每个35 mm组织培养皿中。</li>
	<li>将培养皿转移至 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 培养箱。为确保饲养层细胞均匀分布，将培养皿在培养箱搁架上缓慢而有力地前后移动3次，暂停片刻，再以同样方式左右移动3次。此后不再移动培养皿，并轻柔关闭培养箱门。</li>
	<li>24小时后，将培养基从饲养细胞培养基更换为含10%血清替代物（SR）的IMDM培养基，之后每三天更换一次该培养基。饲养细胞在培养的前3天后即可用于实验。</li>
</ol>
2. hESC 或 hiPSC 克隆的机械收获
<ol>
	<li>预热hESC培养基，其成分为80%达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、20% SR、1 mM 谷氨酰胺替代物（100倍浓度）、1 mM 非必需氨基酸（NEAA）、1 mM 青霉素/链霉素（P/S）、0.1 mM 2-巯基乙醇，以及10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。该hESC培养基用于在饲养细胞上培养hESC或hiPSC。</li>
	<li>取含有有丝分裂阻滞饲养细胞的新鲜35 mm组织培养皿，在转移hESC/hiPSC克隆前至少30分钟，将饲养细胞培养基更换为1.2 mL含bFGF的hESC培养基。</li>
	<li>将含有hESC/hiPSC克隆、并置于有丝分裂阻滞饲养细胞上的培养皿放入超净台内的显微镜下，使用10倍物镜观察。用无菌手术刀小心地沿每个克隆的边缘切割，然后将每个克隆切成5–6个大致相等的小块。用刀片尖端小心挑起克隆碎片，使其从饲养细胞层上脱离，并在培养基中自由漂浮。
	<ol>
		<li>尽量避免切割到含有分化细胞的区域，这些区域表现为克隆内出现较小细胞形成的岛状结构，其细胞核不如hESC/hiPSC清晰可辨。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1 mL移液器将自由漂浮的克隆转移至含有饲养细胞的新培养皿中。尽量使各克隆彼此分离，以防后续生长过程中相互融合。小心移动培养皿至细胞培养箱中，并在次日之前避免扰动培养皿。</li>
	<li>次日，小心加入600 µL含bFGF的hESC培养基，使终体积达到1.8 mL。此后每天更换含bFGF的hESC培养基，直至下一次传代（通常约1周后）。</li>
</ol>
3. 使用EDTA介导的去黏附法收获hESC或hiPSC克隆
<ol>
	<li>取含有有丝分裂阻滞饲养细胞的新鲜培养皿，在转移克隆前至少30分钟，将培养基从含10% SR的IMDM更换为1.2 mL预热的hESC + bFGF培养基。</li>
	<li>每次操作一个含有hESC或hiPSC克隆的培养皿。吸除hESC + bFGF培养基，用1 mL室温DPBS洗涤克隆，以去除可能存在的未贴壁细胞和细胞碎片。加入1 mL 0.5 mM EDTA，于37 °C孵育1分钟。若超净台配有加热板，为获得更好的解离效果，可在加热板上进行本步骤及第4节中的后续操作。</li>
	<li>孵育1分钟后，吸除EDTA溶液，用1 mL移液器小心加入1 mL hESC + bFGF培养基。使用同一移液器轻轻吹打，使克隆从饲养细胞层上脱离。继续小心吹打，直至饲养细胞层松动并卷曲成独立的团块，然后用移液器尖端将饲养细胞层移除。</li>
	<li>用新的1 mL移液器将悬浮的hESC/hiPSC克隆转移至含有饲养细胞和hESC + bFGF培养基的新培养皿中，按1:5的比例进行传代。克隆通常会在新培养皿中均匀分布，可通过轻轻左右晃动培养皿促进其分布。此后每天更换hESC + bFGF培养基，直至下一次传代（通常在1周后）。</li>
</ol>

<ol><li>Skottman, H., Hovet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).</li>
<li>Hovatta, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).</li>
<li>Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell+cultivation%3A+historical+perspective+and+evolution+of+xeno-free+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9(2015).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+polymer+coatings+for+long-term+growth+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).</li>
<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+superfamily+signaling+regulates+the+state+of+human+stem+cell+pluripotency+and+capacity+to+create+well-structured+telencephalic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids.</a> Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).</li>
<li>Inzunza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell+culture+methods+under+cGMP+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117(2020).</li>
<li>Castro-Viñuelas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+successfully+culturing+and+adapting+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).</li>
<li>Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

Joel C. Glover 是挪威人类多能干细胞核心设施的负责人，Hege Brincker Fjerdingstad 是该设施的日常管理者。作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

我们描述了一种快速且成本效益高的方法，用于收获在饲养细胞上培养的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）&#160;，该方法利用EDTA介导的去黏附作用，并主要将其与使用手术刀进行机械收获的传统方法进行了比较。我们还比较了基于EDTA的收获方法与酶法收获在操作速度方面的差异，但未比较所得克隆质量的相关特性。原因是酶法收获本身具有更高的变异性，且已被发现与更高频率的基因组异常相关5，这可能会掩盖不同方法之间的实际差异。
我们证明了&#160;基于EDTA的收获方法比其他两种方法更快、更高效，且产生的克隆较小、形态更均一，而机械法收获得到的克隆则形态较大。后一特性对细胞存活有利，因为机械收获产生的较大细胞团块容易发生中心坏死，而酶消化法往往产生单个分离的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），这些单细胞更容易发生凋亡，通常需要额外处理（例如使用ROCK抑制剂）才能存活。基于EDTA的收获方法可连续使用至少20代。在克隆细胞密度、干性基因的mRNA和蛋白表达、拟胚体中三胚层分化能力以及基因组异常等方面，基于EDTA的收获方法与机械法收获方法相当。如果目标是提高效率、获得更高产量、减少实验变异并更温和地处理hESCs和hiPSCs，则优先选择基于EDTA的收获方法。
我们还注意到，使用基于EDTA的方法收获培养在饲养细胞上的hESC和hiPSC是一种成本较低的方式，可维持更原始的状态，并在需要时实现从饲养细胞依赖培养向无饲养细胞培养的平稳过渡。
方案中的关键步骤 
EDTA介导的去黏附过程中最关键的步骤是方案第3部分（在EDTA溶液中孵育）和第4部分（吹打）。如果暴露于EDTA溶液的时间超过1分钟，组织完全解离为单个细胞的风险会增加。如果吹打时间过长或过于剧烈，也可能出现这种情况。后者受移液器吸头尺寸的影响。如本文所述，使用1 mL细胞培养移液管最为理想。使用吸头直径更小的其他类型移液器则存在风险。
故障排除 
如果饲养细胞持续增殖，说明有丝分裂阻断未奏效，必须更换新一批饲养细胞并重新开始操作。如果克隆无法从饲养细胞层上松解，需确保EDTA中不含Ca2+，并在加入EDTA前用PBS充分冲洗含有克隆的培养皿，以去除残留的细胞培养基。过度解离会导致产生过多的单个细胞或过小的细胞团，这通常由过度吹打引起，会影响新克隆的形成。吹打程度应通过预实验根据本方案进行经验性确定，以确认&#160;所得细胞团直径约为60 µm。如果饲养层在人类胚胎干细胞（hESCs）/人诱导多能干细胞（hiPSCs）尚未准备好收获前自发从培养皿脱落，可能是由于饲养细胞未在制备后约7天内使用所致。因此，应严格监控饲养细胞的使用时间窗口。如果饲养层在EDTA处理过程中发生解离（本研究中所使用的饲养细胞从未观察到此现象），则必须更换饲养细胞类型或其培养方法。
该技术的局限性 
该技术的主要局限在于需要通过肉眼观察去黏附过程，以获得成功的结果。这意味着操作者必须学会识别克隆何时从饲养层细胞脱离，以及饲养层细胞何时从基质上松动。然而，这一过程并不困难，根据我们的经验，新使用者通常在几次尝试后即可掌握该技术。
收获的 hESCs 或 hiPSCs 也可能存在被少量饲养细胞污染的固有风险。如果计划转移至无饲养层条件，或需要分离 hESCs 或 hiPSCs 用于检测，则此类污染将影响&#160;纯度。需要注意的是，本实验所使用的饲养细胞（人包皮成纤维细胞）即使经过酶消化处理也极难解离（未展示数据）。由于未解离的饲养细胞层会被整体移除，in toto，&#160;因此收获的 hESCs 或 hiPSCs 被污染的可能性极低。此外，由于饲养细胞已处于有丝分裂阻滞状态，任何残留的污染都会随着 hESCs 或 hiPSCs 的进一步传代而最终减少至无。
相对于现有方法的意义 
目前培养人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）的常规方法是在无饲养层条件下进行，而EDTA在传代过程中被广泛使用。无饲养层培养依赖于特殊配制的培养基和培养基质以确保细胞贴壁，这些试剂会带来额外费用，可能超出部分实验室的预算。此外，由于无饲养层培养基中缺乏某些特定因子，细胞容易从初始态向始发态转变，导致分化潜能发生改变。在有丝分裂阻滞的饲养层细胞上培养可避免这种状态转变，并将整体成本降低至可接受水平，从而促进多能干细胞在实验室研究中的更广泛应用。

hESCs 和 hiPSCs 的适当培养与维持 体外 是人类细胞生物学和发育生物学多个研究领域中一种基础且便捷的方法。由于人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）具有自发分化的内在倾向，维持其未分化状态 体外 需要特别的谨慎和关注。因此，开发成本效益高、方法学变异尽可能小的hESCs和hiPSCs培养与传代方案具有重要的普遍应用价值。
最初，hESCs 和 hiPSCs 被培养在不同类型的饲养细胞上，以协助长期培养并维持其未分化状态1,2,3。近年来，无饲养层条件下的培养已成为常态，因其完全避免了饲养细胞的使用4。然而，一些实验室和核心设施仍继续在饲养细胞上培养 hESCs 或 hiPSCs。无饲养层培养成本较高，因其需要使用特殊成分的培养基，以及对培养表面进行某种形式的包被处理，以确保细胞集落的贴附（主要为细胞外基质 [ECM] 成分、商用 ECM 化合物，或使用市售的预包被培养板）。这一成本不容忽视，可能成为有意开展 hESC 或 hiPSC 相关研究与开发工作的部分实验室面临的经济障碍。此外，无饲养层条件下的培养倾向于使 hESCs 和 hiPSCs 进入比在饲养细胞上维持的状态更不幼稚的状态5，这可能影响&#160;后续的分化能力，并导致遗传变异6。
传统上，培养在饲养细胞上的hESCs和hiPSCs传代依赖机械收获法——在显微镜下使用解剖刀切割克隆集落7&#160;——但后来该方法大多被酶消化法所取代，后者可结合轻柔刮擦以分离克隆集落或单细胞。机械收获法繁琐且需要精细的显微操作技术。酶消化法的效率可能因酶批次间的差异而波动，且倾向于导致细胞完全解离，从而引发细胞死亡，除非使用ROCK抑制剂加以抵消8,9，并增加核型异常的发生率9。
为了在利用饲养层细胞培养人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）时兼具成本较低和分化潜能更高的优势，同时避免机械法和酶法收获带来的缺点，我们建立了一种快速、高效、成本低且得率高的收获方法，该方法通过EDTA介导的去黏附作用，用于收获维持在人包皮成纤维细胞饲养层上生长的hESC和hiPSC克隆。我们对该方法的收获得率、变异程度及干细胞质量进行了评估，并与机械法收获的结果进行了比较（未与酶消化法进行比较，因其会引入额外的实验变异性）。我们注意到，若后续实验需要将细胞转移至无饲养层条件，EDTA介导的去黏附法同样适用于将克隆从饲养层依赖型培养体系转移至无饲养层培养体系。该方法实现了传代方式的一致性过渡，因为EDTA诱导的去黏附是目前无饲养层培养体系中广泛采用的一种技术。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-18B-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Brand B&amp;uuml;rker 计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>10628431</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀片 15 号</td><td>Susann-Morton</td><td>505</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca/Mg 的 DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Easy Grip 组织培养皿，35 × 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 移液器 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 移液器 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头 1,000 &amp;mu;L</td><td>Sarstedt</td><td>70.1186.210</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头 200 &amp;mu;L</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Cell 3000 ELAN 照射仪（或使用丝裂霉素 C 抑制细胞增殖）</td><td>Best Theratronics</td><td>BT/MTS 8007 GC3000E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型基质胶（Matrixgel）</td><td>Corning</td><td>734-0269</td><td></td></tr><tr><td>H9 人胚胎干细胞系</td><td>WiCell</td><td>WAe009-A</td><td></td></tr><tr><td>hPSC 遗传分析试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#07550</td><td></td></tr><tr><td>HS429 人胚胎干细胞系&amp;nbsp;</td><td>ECACC</td><td>KIe024-A</td><td></td></tr><tr><td>人包皮成纤维细胞 - CRL2429 细胞系</td><td>ATTC</td><td>CRL2429</td><td></td></tr><tr><td>IMDM (1x)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>iPSC 细胞系</td><td>挪威人多能干细胞核心设施</td><td>NCS001 &amp; NCS002</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>激光共聚焦显微镜或同等设备（我们使用 Zeiss 的 LSM 700）</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>CETI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素 C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140.035</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>血清替代物（SR）</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>0.22 µm 无菌滤器</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.102</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>ThermoScientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4 %）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，500 mL</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

通过乙二胺四乙酸介导的去黏附实现饲养细胞上人多能干细胞快速、经济、无酶传代

Rapid, Cost-Efficient, Enzyme-Free Passaging of Human Pluripotent Stem Cells on Feeder Cells by Ethylenediaminetetraacetic Acid-Mediated Dis-Adhesion

人类多能干细胞（人类胚胎干细胞，hESCs，以及人类诱导多能干细胞，hiPSCs）最初在长期培养中需依赖不同类型的饲养细胞以维持其未分化状态。这一方法目前已在很大程度上被无饲养细胞的培养方案所取代，但后者涉及更昂贵的试剂，并可能促进细胞向始发态转变，从而限制其分化潜能。无论在有饲养细胞或无饲养细胞的条件下，对hESC或hiPSC克隆进行收获以传代，都是扩增培养过程中必不可少的操作步骤。
为了提供一种在饲养细胞上培养的人胚胎干细胞（hESC）/人诱导多能干细胞（hiPSC）传代的简便且高效率方法，我们建立了一种利用钙螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）诱导细胞解离的收获方法。我们通过将该方法与传统的机械收获法进行比较，评估了传代后细胞的产量和质量；其中机械收获法是在显微镜下使用手术刀分离克隆（选择机械收获作为对照方法，以避免酶消化收获中试剂批次间的变异性）。
在一组实验中，两种不同的人胚胎干细胞（hESC）系被维持在人包皮成纤维细胞的饲养层细胞上。每种细胞系均通过基于EDTA的消化法或机械法传代多次，并评估其&#160;克隆大小和形态、细胞密度、多能性标志物表达、在拟胚体中向三个胚层的分化能力以及基因组异常情况。在另一组实验中，我们对两种不同的人诱导多能干细胞（hiPSC）系采用基于EDTA的消化法，获得了类似的结果。与机械法相比，EDTA诱导的细胞解离节省了时间，获得的克隆数量更多，且克隆大小更适宜、形态更均一。此外，该方法也比酶消化法更快，且不受酶批次间差异的影响。若后续实验或分析需要，EDTA诱导的解离法还可方便地将hESC/hiPSC细胞系从饲养层依赖的培养体系转移至无饲养层的培养条件。

在下文所述的实验与比较中，我们使用了两种人胚胎干细胞系（H9 和 HS429，分别来自 WiCell 和卡罗林斯卡研究所）以及两种人诱导多能干细胞系（NCS001 和 NCS002，均由挪威人多能干细胞核心设施中心建立）。图示和表格中的数据来自人胚胎干细胞系，但人诱导多能干细胞系获得了完全类似的结果。
在我们的实验中，机械收获法将集落分离为大约5至6个直径约为200–250 µm的团块，而采用EDTA诱导解离并辅以吹打的方法，则每个集落可被分离为约10至20个直径约为60 µm的团块。我们估计，每个经EDTA收获的团块所含细胞数约为20个。由于使用手术刀难以将集落切割成如此小的团块，因此在这一方面，EDTA诱导解离更具优势，因其产生的团块尺寸更有利于集落细胞的存活10,11。
使用EDTA收获的hESC/hiPSC集落与机械法收获的集落相比，在大小和形状上更加均一（图1A-F）。这是因为机械收获所需的切割操作会产生不规则的边缘和大小不一的细胞团块。为了对这一现象进行定量评估，我们采用ImageJ-win64方案12，在传代后第5天测定了集落的圆形度（作为衡量集落边缘圆整程度的指标；数值为1表示完美的圆形）。机械法收获的集落圆形度显著较低（机械法收获：0.61 ± 0.10；EDTA法收获：0.84 ± 0.01；n = 10，p &#60; 0.001，Mann-Whitney U检验，U = 10）。
收获后重新接种的克隆中细胞密度反映了收获后细胞间相互作用对克隆形成的影响，EDTA 法收获与机械法收获的细胞密度相似（表 1 和 图 1G、H）。机械法收获的克隆更倾向于在中央区域出现坏死（图 1J）。这可能是由于机械分离所得细胞团块在形状和尤其是大小上存在较大变异；当这些团块过大时，在转移至新培养皿过程中容易发生自我折叠。而使用 EDTA 收获的克隆则未出现此现象，其形态均一，呈半透明状，边缘清晰（图 1I）。
使用基于EDTA的收获方法，我们能够在2-3分钟内几乎收集到孔中形成的所有克隆。而采用机械法收获时，收集孔内全部克隆则繁琐且耗时。通常使用机械法仅能收集约30%（约20-25个克隆），且耗时约20分钟。同样，采用胶原酶消化后轻柔刮取的方法，通常也难以完全收获所有克隆，尽管整个过程仅需几分钟。因此，基于EDTA的收获方法在速度上等于或快于酶解法，在效率上则高于机械法和酶解法。
为了评估不同传代方法对干性和多能性的影响，我们首先对使用EDTA法或机械法传代20代后获得的细胞集落进行了qPCR分析（图2）以及针对干性标志物的免疫细胞化学染色（图3 和 图4）。两种方法获得的集落在mRNA和蛋白质水平上均表现出干性标志物的稳定表达。随后，我们通过拟胚体向三个胚层分化来评估多能性（图5 和 图6）。由经两种方法传代20代后获得的人胚胎干细胞（hESCs）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）所生成的拟胚体中，均包含表达外胚层、中胚层和内胚层常见标志物的细胞混合物。
最后，我们采用基于qPCR的遗传分析方法（参见材料表），评估了使用不同传代方法的hESC和hiPSC中基因组异常的发生情况。通过任一收获方法传代20次后获得的细胞集落均表现出某些相对于参考二倍体染色体模式的轻度偏离实例（所评估的异常是与hiPSC重编程常相关的类型，但也可能在hESC中出现）（图7）。然而，两种收获方法获得的集落中这些偏离的模式基本相同，表明这些异常与收获方法无关。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig01.jpg" /> 
图1：基于EDTA或机械法收获后的集落形态和细胞密度。 （A-F）采用（A-C）基于EDTA或（D-F）机械法收获方式，在无饲养层培养条件下传代20次后，H9人胚胎干细胞（hESC）集落在第5天的代表性明场图像。（G、H）传代20次后，采用（G）基于EDTA或（H）机械法收获方式建立的H9 hESC集落中细胞密度的代表性荧光图像。细胞核经DAPI染色。（I、J）传代20次后，采用（I）基于EDTA或（J）机械法收获方式建立的H9 hESC集落的代表性明场图像。注意机械法收获集落中央出现的坏死区域（J中的箭头所示）。所有图像均在第20次传代后的第5天采集。比例尺 = 100 µm。缩写：hESC = human embryonic stem cell（人胚胎干细胞）；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid（乙二胺四乙酸）；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig02.jpg" /> 
图2：经EDTA法或机械法收获后两种人胚胎干细胞系（H9和HS429）中干性标志物mRNA的表达。&#160;对经机械法传代一次、机械法传代20次以及EDTA法（1:5稀释）传代20次后的H9（上图）和HS429（下图）人胚胎干细胞中所示标志物进行定量实时聚合酶链式反应检测。表达水平相对于持家基因ACTB（β-肌动蛋白）进行归一化。误差线表示标准差。缩写：hESC = human embryonic stem cell；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig03.jpg" /> 
图3：不同收获条件下H9人胚胎干细胞系中干性标志蛋白的表达。&#160;代表性免疫荧光染色图像显示H9人胚胎干细胞集落在不同收获方式下的情况：机械法收获后（A-E），经20次传代后机械法收获（F-J），以及经20次传代后采用EDTA法收获（K-O）。比例尺 = 100 µm。缩写：hESC = human embryonic stem cell；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig04.jpg" /> 
图4：不同收获条件下HS429人胚胎干细胞系中干性标志蛋白的表达情况。&#160;HS429人胚胎干细胞集落在不同收获方式下的代表性免疫荧光染色结果：(A-E) 机械法收获后、进一步传代前；(F-J) 经20次机械法收获传代后；以及(K-O) 经20次EDTA法收获传代后。比例尺 = 100 µm。缩写：hESC = human embryonic stem cell；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig05.jpg" /> 
图5H9 人胚胎干细胞系经机械法或 EDTA 法收获后所形成拟胚体中三胚层标志物的表达&#160;代表性免疫荧光染色标记物用于（A 和 D 外胚层（ECTO，TUJI），（行）B 和 E 内胚层（ENDO，AFP）及（C 和 F 胚层（MESO，SMA）行）生成的拟胚体（EBs）A-C) 经过20次机械收获后或(D-F) 经过20次EDTA法传代后。比例尺 = 40 &#181;m缩写：hESC = 人胚胎干细胞；EDTA = 乙二胺四乙酸；EBs = 类胚体 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig06.jpg" /> 
图6HS429 人胚胎干细胞系经机械法或 EDTA 法收获后所形成类胚体中三胚层标志物的表达&#160;代表性免疫荧光染色标记物用于（A 和 D 外胚层（ECTO，TUJI），（行）B 和 E 内胚层（ENDO，AFP），以及（C 和 F 行）中胚层（MESO，SMA）。生成的EBs（A-C) 经过20次机械收获后（A-C）或（D-F) 经过20次EDTA法传代收获后。比例尺 = 40 &#181;m缩写：hESC = 人胚胎干细胞；EDTA = 乙二胺四乙酸；EBs = 类胚体 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63788/63788fig07.jpg" /> 
图 7：通过机械法或基于EDTA的收获方法在传代20次后，对HS9和HS429 ESC系及NCS002 iPSC系中常见基因组异常进行基于qPCR的遗传学分析。 数值为2的基线表示所有染色体标记位点均为正常的二倍体。数值为1或3分别表示所有细胞中所示染色体标记位点的缺失或增加。介于1与2之间或2与3之间的中间值表明部分细胞中存在所示标记位点的缺失或增加。请注意，在两种收获条件下，异常模式相似。缩写：ESC = 胚胎干细胞；EDTA = 乙二胺四乙酸；iPSC = 诱导性多能干细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63788/63788fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞密度（cells/mm2）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9</td>
			<td>均值</td>
			<td>标准差</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>传代前机械法收获</td>
			<td>3918</td>
			<td>263.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>机械法收获 20 次</td>
			<td>3868</td>
			<td>197.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 法收获 20 次</td>
			<td>4080</td>
			<td>127.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS429</td>
			<td>均值</td>
			<td>标准差</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>传代前机械法收获</td>
			<td>5249</td>
			<td>565.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>机械法收获 20 次</td>
			<td>5247</td>
			<td>726.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 法收获 20 次</td>
			<td>4963</td>
			<td>448.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过EDTA法或机械法收获后，两个hESC细胞系（H9和HS429）菌落中细胞密度的比较。细胞密度的评估分别在以下情况下进行：机械法收获后单次传代、机械法收获连续20次传代后，或EDTA法收获连续20次传代后（按1:5稀释）。所有情况下，n = 5个菌落。

为避免在饲养细胞上培养的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在酶法或机械传代过程中存在的局限性，我们建立了一种快速、高效、成本低且得率高的收获方法，该方法利用EDTA介导的去黏附作用，用于收获维持在人包皮成纤维细胞饲养层上生长的hESC或hiPSC克隆。

人类多能干细胞（人类胚胎干细胞，hESCs，和人类诱导多能干细胞，hiPSCs）最初培养于不同的……

本方案提供了一种快速、经济的无酶传代方法，适用于饲养层细胞上培养的人多能干细胞。该方案的优势在于无需昂贵的无饲养层培养基和生长基质，避免了酶解导致细胞完全解离的风险，同时降低了干细胞向始发态转变的可能性。本实验操作将由挪威人多能干细胞核心设施中心日常负责人Hege Brincker Fjerdingstad进行演示。将0.5 × 10⁶个人类成纤维细胞（以下简称饲养细胞）接种于T75培养瓶中，加入20 mL含10% FBS的IMDM培养基（以下简称饲养细胞培养基）。当饲养细胞达到90%融合度时，吸除培养基，并用10 mL DPBS洗涤细胞三次，以避免培养基中的成分抑制胰蛋白酶活性。向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C、5% CO₂条件下孵育约5分钟，同时肉眼观察饲养细胞的脱落情况。一旦开始脱离，需在显微镜下继续观察细胞解离情况，以确保所有细胞团块均解离为单细胞。接着，向培养瓶中加入5毫升新鲜的预温饲养层细胞培养基，以中和胰蛋白酶-EDTA，并通过移液轻轻重悬饲养层细胞。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，盖紧管盖后，在200 ×g 条件下离心5分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀，然后将沉淀重悬于 4 mL 新鲜饲养细胞培养基中。确保饲养细胞充分重悬后，使用细胞计数板进行计数，并计算在 35 mm 组织培养皿中培养造血干细胞（HSCs）和人诱导多能干细胞（HI PSCs）所需的细胞数量。接下来，为进行γ射线照射诱导有丝分裂阻滞，将适量的饲养细胞转移至 50 mL 离心管中，并加入饲养细胞培养基，使总体积达到 5 mL。立即将细胞在室温下运送至γ射线辐照仪进行辐照，以实现细胞有丝分裂阻滞。一旦在组织培养罩内完成饲养细胞的有丝分裂阻滞，用饲养细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.5 × 10⁵ 个/毫升。取2毫升饲养细胞悬液加入35毫米培养皿中，将培养皿置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育。为使细胞均匀分布，将培养皿在培养箱搁架上缓慢而稳定地前后移动。然后暂停，再同样地左右移动，之后关闭培养箱门。24小时后，将饲养层细胞培养基更换为含10%血清替代物的IMDM培养基。从含有有丝分裂阻滞饲养细胞的培养皿中，在克隆转移前30分钟，将含10%血清替代物的IMDM更换为1.2毫升预热的含碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）的HESC培养基。接着，移除含有HSC或HI PSC的培养皿中的培养基，并用1毫升DPBS洗涤克隆，以去除未贴壁的细胞和细胞碎片。加入1毫升0.5毫摩尔的EDTA，在37摄氏度下孵育1分钟。然后使用1 mL移液器，将EDTA溶液替换为1 mL含有bFGF的hESC培养基。用同一支移液器轻轻吹打，使细胞集落从饲养层细胞上脱离，直至饲养层松动并卷曲成独立的细胞团块。用移液器吸头将饲养层细胞推至培养孔边缘。使用一个新的1毫升移液器，将悬浮的克隆转移至含有饲养层细胞和添加bFGF的HESC培养基的新培养皿中，按1:5的比例进行传代。将培养皿放入培养箱，并轻轻左右晃动，以促进克隆的均匀分布。使用EDTA收获的HESC克隆在大小和形态上比机械法收获的更为均一。经EDTA法和机械法收获并重新接种的克隆，其细胞密度相似。机械法收获的克隆更倾向于在中央区域出现坏死，而采用EDTA收获的克隆则呈现半透明状，边缘清晰。qPCR分析显示，经过20代传代后，采用机械法或EDTA法收获的克隆在mRNA水平上均稳定表达干细胞标志物。使用机械法或基于EDTA的收获方法在传代20次后获得的集落中，通过免疫化学染色在蛋白质水平上也观察到了类似结果。由两种方法在传代20次后获得的HSCs所生成的类胚体，包含表达外胚层、中胚层和内胚层常见评估标志物的细胞混合物。此外，基于QPCR的常见基因组异常的遗传学分析显示，其与参考的二倍体染色体模式仅有轻微偏离。EDTA 处理时间应限制在 1 分钟以内，过长的处理时间可能导致过度解离。此外，在将人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞转移至新的培养皿时，务必将饲养层细胞充分移开，以免阻碍操作。过渡到使用EDTA的无菌培养和无饲料条件对于病原体而言是直接可行的，我们未发现细胞处理方式有任何改变。

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