通过乙二胺四乙酸介导的去黏附实现饲养细胞上人多能干细胞快速、经济、无酶传代

本方案提供了一种快速、经济的无酶传代方法，适用于饲养层细胞上培养的人多能干细胞。该方案的优势在于无需昂贵的无饲养层培养基和生长基质，避免了酶解导致细胞完全解离的风险，同时降低了干细胞向始发态转变的可能性。本实验操作将由挪威人多能干细胞核心设施中心日常负责人Hege Brincker Fjerdingstad进行演示。

将0.5 × 10⁶个人类成纤维细胞（以下简称饲养细胞）接种于T75培养瓶中，加入20 mL含10% FBS的IMDM培养基（以下简称饲养细胞培养基）。当饲养细胞达到90%融合度时，吸除培养基，并用10 mL DPBS洗涤细胞三次，以避免培养基中的成分抑制胰蛋白酶活性。向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C、5% CO₂条件下孵育约5分钟，同时肉眼观察饲养细胞的脱落情况。

一旦开始脱离，需在显微镜下继续观察细胞解离情况，以确保所有细胞团块均解离为单细胞。接着，向培养瓶中加入5毫升新鲜的预温饲养层细胞培养基，以中和胰蛋白酶-EDTA，并通过移液轻轻重悬饲养层细胞。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，盖紧管盖后，在200 ×g 条件下离心5分钟。

小心移除上清液，避免扰动沉淀，然后将沉淀重悬于 4 mL 新鲜饲养细胞培养基中。确保饲养细胞充分重悬后，使用细胞计数板进行计数，并计算在 35 mm 组织培养皿中培养造血干细胞（HSCs）和人诱导多能干细胞（HI PSCs）所需的细胞数量。接下来，为进行γ射线照射诱导有丝分裂阻滞，将适量的饲养细胞转移至 50 mL 离心管中，并加入饲养细胞培养基，使总体积达到 5 mL。

立即将细胞在室温下运送至γ射线辐照仪进行辐照，以实现细胞有丝分裂阻滞。一旦在组织培养罩内完成饲养细胞的有丝分裂阻滞，用饲养细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.5 × 10⁵ 个/毫升。取2毫升饲养细胞悬液加入35毫米培养皿中，将培养皿置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育。

为使细胞均匀分布，将培养皿在培养箱搁架上缓慢而稳定地前后移动。然后暂停，再同样地左右移动，之后关闭培养箱门。24小时后，将饲养层细胞培养基更换为含10%血清替代物的IMDM培养基。

从含有有丝分裂阻滞饲养细胞的培养皿中，在克隆转移前30分钟，将含10%血清替代物的IMDM更换为1.2毫升预热的含碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）的HESC培养基。接着，移除含有HSC或HI PSC的培养皿中的培养基，并用1毫升DPBS洗涤克隆，以去除未贴壁的细胞和细胞碎片。加入1毫升0.5毫摩尔的EDTA，在37摄氏度下孵育1分钟。

然后使用1 mL移液器，将EDTA溶液替换为1 mL含有bFGF的hESC培养基。用同一支移液器轻轻吹打，使细胞集落从饲养层细胞上脱离，直至饲养层松动并卷曲成独立的细胞团块。用移液器吸头将饲养层细胞推至培养孔边缘。

使用一个新的1毫升移液器，将悬浮的克隆转移至含有饲养层细胞和添加bFGF的HESC培养基的新培养皿中，按1:5的比例进行传代。将培养皿放入培养箱，并轻轻左右晃动，以促进克隆的均匀分布。使用EDTA收获的HESC克隆在大小和形态上比机械法收获的更为均一。

经EDTA法和机械法收获并重新接种的克隆，其细胞密度相似。机械法收获的克隆更倾向于在中央区域出现坏死，而采用EDTA收获的克隆则呈现半透明状，边缘清晰。qPCR分析显示，经过20代传代后，采用机械法或EDTA法收获的克隆在mRNA水平上均稳定表达干细胞标志物。

使用机械法或基于EDTA的收获方法在传代20次后获得的集落中，通过免疫化学染色在蛋白质水平上也观察到了类似结果。由两种方法在传代20次后获得的HSCs所生成的类胚体，包含表达外胚层、中胚层和内胚层常见评估标志物的细胞混合物。此外，基于QPCR的常见基因组异常的遗传学分析显示，其与参考的二倍体染色体模式仅有轻微偏离。

EDTA 处理时间应限制在 1 分钟以内，过长的处理时间可能导致过度解离。此外，在将人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞转移至新的培养皿时，务必将饲养层细胞充分移开，以免阻碍操作。

过渡到使用EDTA的无菌培养和无饲料条件对于病原体而言是直接可行的，我们未发现细胞处理方式有任何改变。