流式细胞术分析用于检测人类精子功能缺陷的生物标志物

该技术提供了一种实用的方法，通过流式细胞术在不显著影响实验质量的前提下，对多个精子功能生物标志物进行评估，避免了因长时间等待所导致的实验质量下降。该技术可作为诊断不孕症和在实验研究与临床实践中评估精子功能的一种实用且可靠的工具，并可补充常规精液分析。本实验在Accuri C6平台上完成，但经过少量修改后也可应用于其他商用平台。

首先，将精液样本在37摄氏度下孵育，并完全液化一小时。为计数精子细胞，需充分混匀液化后的精液样本，然后取10微升精液加入精子计数板中，使用精子分析仪扫描载玻片。至少计数六个区域和400个精子，以估算精子浓度。

为检测精子凋亡，采用annexin-5 FITC PI染色法，取10的6次方个精子细胞加入1.5毫升离心管中。用500微升预冷的PBS洗涤细胞。然后离心精子细胞悬液，弃上清液，再将细胞重悬于200微升结合缓冲液中。

接下来，加入 2 µL FITC 标记的 Annexin V 和 2 µL 碘化丙啶（PI）。轻轻涡旋混匀细胞，室温避光孵育 15 分钟，然后置于流式细胞仪中进行分析。对于使用 JC-1 探针分析线粒体膜电位（MMP），将 2 × 10⁶ 个精子细胞加入 1.5 mL 离心管中并离心。离心后，将精子细胞沉淀重悬于 1 mL JC-1 工作液中。

轻轻涡旋混匀细胞，在37摄氏度避光孵育20分钟。再次离心悬浮液，弃去上清液，并用1毫升PBS将沉淀洗涤两次。然后，将染色的精子细胞重悬于1毫升PBS中，置于流式细胞仪管内，立即放入流式细胞仪中进行分析。

接下来，使用羰基氰化物-间氯苯腙（Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone，简称CCCP）作为阳性对照。将精子细胞重悬于1 mL CCCP工作液中，轻轻涡旋混匀，于室温孵育20分钟。孵育结束后，离心收集细胞悬液，弃去上清液，随后按照前述方法使用JC-1探针分析线粒体膜电位（MMP）。

进行精子染色质结构分析（SCSA）时，将精液样本在37摄氏度水浴中解冻，并用TNE缓冲液稀释至浓度为每毫升1至2×10⁶个细胞。接着，取200 µL稀释后的样本加入流式细胞仪检测管中，与400 µL酸性溶液混合。再用1.2 mL吖啶橙溶液对样本进行染色。

使用参考样品作为内部标准，用于流式细胞仪的设置和校准。用4°C的TNE缓冲液将样品稀释至每毫升1×10⁶到2×10⁶个细胞的浓度，并按照示范进行SCSA步骤。打开流式细胞仪软件并启动细胞仪。

为采集样本数据，将对照样本上样至流式细胞仪，然后点击“运行”以开始数据采集。创建点图以查看数据。选择XY轴参数，并设置为线性显示以指定数据。

然后，选择并应用多边形门控以圈定用于分析的精子群体。对于精子凋亡检测，将FL1设为X轴，FL2设为Y轴。接着，为了区分活的凋亡细胞或坏死细胞，点击并拖动象限门控，将精子群体进一步划分为四个特定的亚群。

对于线粒体膜电位（MMP），将FL1设为X轴，FL2设为Y轴，然后创建一个多边形门，将精子群体划分为两个特定的亚群。对于精子染色质结构分析（SCSA），将FL4设为X轴，FL1设为Y轴。

设定门控，调整45度角以排除细胞碎片信号。每份样本计算10,000个精子细胞，用于精子凋亡、线粒体膜电位（MMP）和精子染色质结构分析（SCSA）检测；设置运行上限以指示停止收集数据的时机，根据细胞数量设定流速和阈值，以消除碎片和噪声。所有样本均应用相同的设置。

如有必要，设置颜色补偿以校正荧光溢出。上机前轻轻反复吹吸混匀样本，然后输入样本名称并点击运行。

运行完成后，通过输入文件名将样本数据保存为 FCS 文件，以便进一步分析。此处展示了使用膜联蛋白 V-FITC/PI 染色法检测精子凋亡的结果。该分析包含了未染色精子细胞的阴性对照，用于设定补偿参数和象限划分。

在存在精子凋亡的样本中，结果以活细胞、早期凋亡或凋亡细胞、晚期凋亡细胞以及坏死细胞所占的百分比表示。此处显示了线粒体膜电位（MMP）高和低的精子亚群。高质量的精液样本表现出较强的橙色荧光和较弱的绿色荧光。

相反，质量较差的精液样本表现出较低的橙色荧光和较高的绿色荧光。此处展示了来自一名生育力正常男性和一名不育男性的SCSA细胞图谱。精子细胞群体被鉴定为正常，具有较高的DNA稳定性和DNA碎片指数，以及较多的细胞碎片。

精液样本必须在37摄氏度下孵育，并完全液化，时间最长为一小时。