水凝胶阵列可提高三维肿瘤模型中基质组分与治疗药物筛选的通量

该方法可使研究人员系统地探究基质信号如何影响三维培养中细胞的表型。我们以胶质母细胞瘤（GBM）细胞的培养为例演示该实验流程。该技术的主要优势在于其高通量实施能力，使我们能够筛选多种基质条件。

该技术可用于开发模拟组织的基质，以在细胞培养模型中保留特定功能，例如肿瘤细胞的耐药性，并有望用于发现新的治疗方法。演示该实验操作的是来自Seidlits实验室的本科研究人员Mary Epperson和Kelly Tamura。首先配制HEPES缓冲液，将HEPES粉末溶解于Hanks平衡盐溶液中，使其终浓度为20毫摩尔每升。

完全溶胀后，将pH值调节至7。在HEPES缓冲溶液中溶解巯基化透明质酸（thiolated HA），使每个葡萄糖醛酸上的羧基有6%至8%被巯基修饰，缓冲液中的浓度为10毫克/毫升。室温下使用磁力搅拌器以低于1,000转/分钟的速度搅拌，直至完全溶解，通常约需45分钟。

在 HA 溶解的同时，分别在微量离心管中配制以下溶液：100 毫克/毫升的 8arm PEG 降冰片烯溶液、100 毫克/毫升的 4arm PEG 巯基溶液、4 毫摩尔的半胱氨酸或含半胱氨酸的多肽溶液，以及 4 毫克/毫升的 LAP 溶液。此时，将所有需固定于同一水凝胶中的多肽配制成 4 毫摩尔的溶液。将 HA、PEG 降冰片烯、PEG 巯基以及含半胱氨酸巯基的多肽的各溶液混合，以达到最终水凝胶基质所需的各种终浓度。

在磁力搅拌板上以每分钟低于 1,000 转的速度搅拌至少 30 分钟，以充分混匀。将样品与照明装置对齐，使硅胶模具或 384 孔板单列中的每个间隔的 LED 对准样品。打开紫外 LED 参数设置，输入光强和照明参数值。

然后单击“完成”以开始光照。光照完成后，将孔板移至一个角落，再移动到下一个角落并重复操作。如需对孔板另一侧的孔进行光照，需将孔板从支架中取出，并旋转180度。

为了制备具有不同力学性能的水凝胶，首先使用胶带清洁载玻片和硅胶模具，以去除表面碎屑。将硅胶模具粘附在载玻片上，按压以确保密封良好，并排除任何气泡。接着，用移液器将 80 微升水凝胶前体溶液加入载玻片上每个硅胶模具中。

将玻璃载玻片放置在照明装置上，使其与单列中每隔一个的LED对齐。将水凝胶前体暴露于紫外光下照射15秒，以实现光交联。光照结束后，取出载玻片，并用细尖工具沿模具内周轻轻描画，使凝胶从模具上松脱。

用镊子或止血钳取下硅胶模具。在12孔板中加入两毫升DPBS。将刮刀润湿后，轻轻推动交联水凝胶使其从玻片上脱落，并转移至各自的孔板中。

将所需细胞制备成单细胞悬液。从T-75培养瓶悬浮培养物中收集直径约150微米的胶质母细胞瘤类球体，置于15毫升锥形管中。用5毫升DPBS冲洗培养瓶，以去除残留的细胞和培养基，并将冲洗液一并加入锥形管中。

将含有细胞的锥形管在室温下以200 × g离心五分钟。离心后，用5毫升血清移液管小心吸去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，并将细胞重悬于5毫升DPBS中。在室温下以200 × g再次离心五分钟，以洗涤细胞。

用五毫升血清移液管吸去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于两毫升细胞解离试剂中。室温孵育10至15分钟。加入三毫升完全培养基，轻轻吹打3至5次，使类球体解离为单细胞悬液。

在室温下以400 × g离心单细胞悬液5分钟，使细胞沉淀。用5毫升血清移液管小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用1毫升完全培养基重悬细胞。

用血细胞计数板计数时，取部分细胞进行计数。将该部分细胞与台盼蓝按1:1体积比稀释，台盼蓝可穿透活力受损的细胞。仅计数存活的、无色的细胞。

确定包封所需的细胞数量。将含有所需总细胞数的培养基转移至无菌的1.7毫升微量离心管中。在室温下以400 × g离心5分钟。

用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于水凝胶前体溶液中，使用1,000微升移液器上下吹打4至5次，充分混匀。将细胞悬液加入设定为每孔分配10微升的多通道移液器中。

为避免产生气泡和分配不均，可先用移液器向废液容器中额外排液一到两次以进行预润。使用多通道移液器，向384孔板的每个孔中加入10 µL悬浮在水凝胶溶液中的细胞。利用LED阵列，对每个含有细胞的孔照射15秒，以获得所需的机械性能。

向含有细胞的每个孔中加入 40 微升完全培养基。向凝胶周围非实验性的空孔中加入 50 微升 DPBS，以尽量减少因蒸发造成的损失。对于胶质母细胞瘤细胞，在包封后的第三天开始，加入 40 微升含药物的培养基，以达到最终所需浓度。

向每个含有细胞的孔中加入10 µL CCK8试剂。根据制造商说明书，孵育1至4小时。孵育结束后，于450 nm处测定所有孔的吸光度。

对单个水凝胶表面微米级区域进行原子力显微镜（AFM）检测表明，平均杨氏模量较软的水凝胶其模量范围也比较硬的水凝胶更小。将GS122细胞以每毫升2,500,000个细胞的密度接种进行三维培养，培养七天后其存活率显著高于以每毫升500,000个细胞密度接种的培养组。当基质中加入骨桥蛋白衍生肽时，GS122细胞在八千帕条件下表现出更高的存活率；而整合素结合糖蛋白或腱生蛋白C衍生肽的引入仅提供轻微的存活益处，例如含有姜源RGD肽的培养体系和基质。

相比之下，在0.8千帕的培养条件下，没有任何肽能带来生存优势。GS122和GS304细胞在软性或刚性水凝胶基质（包括含RGD的肽）中培养时均发生铺展。GS122细胞在0.8千帕和8千帕条件下与骨桥蛋白共培养时均表现出类似的铺展不足现象。

然而，GS122 仅在八千帕条件下表现出对替莫唑胺的增强抗性。最后，这种微型化三维培养平台还可用于培养其他肿瘤类型的人源细胞，包括终末分化的神经内分泌型前列腺癌细胞的有活性类器官。在完成该操作步骤后，可进一步采用单细胞 RNA 测序等技术，以更深入地表征细胞表型。