水凝胶阵列可提高 3D 肿瘤模型中基质成分和治疗药物筛选效果的通量

这种方法使研究人员能够系统地探测基质线索如何影响3D培养物中细胞的表型。我们使用GBM细胞培养物演示该过程。这种技术的主要优点是高通量实现，这使我们能够筛选许多矩阵条件。

该技术可用于开发组织模拟基质，以保留细胞培养模型中的特定功能，例如肿瘤细胞的耐药性，并可能鉴定新的治疗方法。来自Seidlits实验室的本科研究人员Mary Epperson和Kelly Tamura将展示该程序。首先通过在Hanks平衡盐溶液中以20毫摩尔溶解HEPES粉末来制备HEPES缓冲溶液。

完全吸附后将pH值调节至7。在HEPES缓冲溶液中，溶解硫醇化HA，使每种葡萄糖醛酸上的6~8%羧酸残基在缓冲溶液中以每毫升10毫克的浓度用硫醇修饰。在室温下使用磁力搅拌板以低于每分钟1， 000次旋转的速度搅拌，直到完全溶解，通常约为45分钟。

当HA溶解时，在微量离心管中制备每毫升100毫克8臂PEG降冰片烯，每毫升100毫克4臂PEG硫醇，半胱氨酸或含半胱氨酸肽的四毫摩尔和每毫升LAP的四毫克溶液。此时，准备所有肽的四毫摩尔溶液以拴在单个水凝胶中。混合HA，PEG降冰片烯，PEG硫醇和含半胱氨酸硫醇肽的单个溶液，以达到最终水凝胶基质的最终浓度。

在磁性楼梯板上以低于每分钟1， 000圈的速度搅拌至少30分钟，以充分混合。将样品与照明设备对齐，每隔一个LED在硅胶模具或384孔板的单列中对齐。打开 UV LED 参数并输入强度和照明值。

然后单击"完成"开始照明。照明后，当放置在一个角时，将孔板移动到下一个角并重复。要照亮板另一半上的孔，请将板从支架中取出并旋转180度。

要产生具有不同力学原理的水凝胶，首先使用胶带清洁载玻片和硅胶模具以清除碎屑。将硅胶模具粘在载玻片上，向下按压以确保良好的密封性，并置换任何气泡。接下来，将80微升的水凝胶前驱体溶液移液到载玻片上的每个硅胶模具中。

将载玻片放在照明设备上，该设备与单列中的所有其他LED对齐。将水凝胶前体暴露在紫外线下15秒以进行照片交联。照明停止后，取回载玻片，并通过用细尖描摹模具的内圆周将凝胶从模具中松开。

用镊子或镊子取下硅胶模具。在12孔板中填充两毫升DPBS。通过润湿刮刀并将其从载玻片上轻轻推开，将交联水凝胶移动到单个孔板中。

将所需细胞制备为单细胞溶液。从T-75烧瓶悬浮培养物中收集直径约150微米的胶质母细胞瘤球体到15毫升锥形管中。用五毫升DPBS冲洗培养瓶以除去任何残留的细胞和培养基，并将该体积加入锥形管中。

在室温下将含有细胞的锥形管以200倍G离心五分钟。离心后，用五毫升血清移液管除去上清液，注意不要干扰细胞沉淀并重悬于五毫升DPBS中。在室温下以200倍G离心5分钟以洗涤细胞。

用五毫升血清学移液管吸出上清液，注意不要干扰细胞沉淀，然后将细胞重悬于两毫升细胞解离试剂中。在室温下孵育10至15分钟。加入三毫升完整的培养基，轻轻移液三到五次，将球体分解成单细胞悬浮液。

将单细胞悬浮液以400倍G离心5分钟，以在室温下沉淀细胞。用五毫升血清移液管吸出上清液，注意不要干扰细胞沉淀。将细胞重悬于一毫升完整的培养基中。

使用血细胞计数器取出一部分细胞进行计数。用台盼蓝将这部分稀释两倍，其渗透细胞活力受损。只计算活的无色细胞。

确定封装所需的电池数量。将含有所需细胞总数的培养基体积转移到无菌的1.7毫升微量离心管中。在室温下以400倍G旋转五分钟。

用微量移液管吸出上清液，注意不要干扰细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于水凝胶前体溶液中，通过用1， 000微升微量移液管上下移液四到五次来充分混合。将细胞加载到重复的移液器中，以分配10微升。

为避免气泡和不均匀的分配，通过在废物容器中再分配一到两次来预处理重复移液器。在384孔板的每个孔中，从重复移液器中分配10微升悬浮在水凝胶溶液中的细胞。使用LED阵列，照亮每个含有细胞的孔15秒钟，以达到所需的机械性能。

向每个含有细胞的孔中加入40微升的完整培养基。向凝胶周围的非实验性干井中加入50微升DPBS，以最大限度地减少蒸发造成的损失。对于胶质母细胞瘤细胞，加入40微升含培养基的药物以达到最终所需的浓度，在包封后三天开始。

向每个含有细胞的孔中加入10微升CCK8试剂。根据制造商的说明孵育一到四个小时。孵育后所有孔的450纳米处读取吸光度。

AFM对单个水凝胶表面微米级区域的询问表明，平均杨氏模量较软的水凝胶的模量范围也比较硬的水凝胶小。与以每毫升500， 000个细胞的密度接种的GS122细胞相比，在培养7天后评估时，以每毫升2， 500， 000个细胞的密度接种的GS122细胞的3D培养物表现出显着更高的活力。当骨桥蛋白衍生的肽包含在基质中时，GS122细胞在8千帕斯卡条件下显示出存活率增加，而整合素结合的sialop蛋白或tenascin C衍生肽的掺入提供了最小的生存益处，例如与生姜RGD肽的培养和基质。

相反，没有肽在0.8千帕斯卡培养条件下获得生存率。GS122和GS304细胞在软或硬水凝胶基质（包括含RGD的肽）中培养时扩散。GS122细胞在骨桥蛋白的0.8和8千帕斯卡中都显示出类似的缺乏扩散。

然而，GS122仅在8千帕斯卡条件下显示出对替莫唑胺的增强抵抗力。最后，这种小型化的3D培养平台可用于从其他肿瘤类型中培养人类细胞，包括终末分化的神经内分泌前列腺癌细胞的活体类器官。在此程序之后，可以使用诸如单细胞RNA测序之类的进一步技术来进一步表征细胞表型。