标签保留型扩展显微技术（LR-ExM）实现超分辨率成像与高效标记

扩展显微镜技术的一个主要局限在于，荧光在聚合和消化后会减弱。我们称之为LR-ExM的标签保留扩展显微镜技术，使用三功能锚定分子，这些分子可在聚合和消化过程中保持稳定。在使用三功能锚定分子后，我们在扩增步骤之后再引入荧光标记。

因此，在实现高分辨率的同时，我们仍能保持良好的信噪比。标记保留型膨胀显微镜可与其他任何先前报道的膨胀显微镜技术以及荧光显微镜技术联用，是一种非常稳健且用途广泛的实验方法。

对于高分辨率成像，获得增强的信号至关重要。首先，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将细胞接种于含完全培养基的16孔可拆卸腔室盖玻片中进行培养。当细胞数量达到约40,000时，在室温下用100微升含3.2%多聚甲醛（PFA）的PEM缓冲液固定细胞10分钟。

然后在室温下用100 µL通透缓冲液处理细胞15分钟。将细胞与用细胞封闭缓冲液稀释的链霉亲和素溶液在室温下孵育15分钟，随后用200 µL细胞封闭缓冲液短暂漂洗。接着，将细胞与100 µL用细胞封闭缓冲液稀释的生物素溶液在室温下孵育15分钟。

随后，将细胞与100微升一抗溶液（包含大鼠抗α微管蛋白抗体和兔抗网格蛋白重链抗体）在4°C孵育16小时，或在室温孵育1小时。然后，将细胞与100微升二抗溶液（包含三功能锚定分子、驴抗兔IgM-DIG MA和驴抗大鼠IgM-生物素MA）在室温孵育1小时。接着，将细胞与100微升0.25%戊二醛溶液在室温孵育15分钟，以将蛋白质锚定在水凝胶上。

使用剃刀刀片或任何合适的移除工具取下16孔板的上部结构，保留底部的盖玻片。将盖玻片放入培养皿中，并置于冰上。向每个孔中加入45 µL单体溶液，以对细胞进行预处理。

冰上孵育五分钟。配制凝胶溶液时，准备一个1.5毫升的微量离心管。混合单体、双蒸水和10%T med。

暂勿加入过硫酸铵。同时，将凝胶溶液管置于冰上。向凝胶溶液中加入10%过硫酸铵。

在将凝胶化溶液管置于冰上保存的同时，立即向每个孔中加入40微升凝胶化溶液。将孔板放在冰上继续孵育3分钟。为保持凝胶在37°C孵育过程中的湿度，用培养皿盖盖住培养皿，并在培养皿内加入几滴水。

在避光条件下，将盖玻片和10厘米的培养皿转移至37°C培养箱中孵育1.5小时，以完成凝胶化。凝胶化完成后，切割盖玻片以分离各个凝胶，将凝胶转移至6孔板中。

向每个孔中加入 2 毫升消化缓冲液。将样品在室温下孵育过夜，或在 37 摄氏度下孵育 4 小时。然后用至少为最终凝胶体积 10 倍以上的水洗涤凝胶，重复洗涤步骤 4 次，每次 20 至 30 分钟，凝胶在每个维度上大约膨胀 4 倍。

将凝胶在2毫升体积的链霉亲和素-地高辛标记染色缓冲液中孵育，加入2至5微摩尔的链霉亲和素染料和/或抗地高辛染料，在室温避光条件下孵育24小时。随后用大量水洗涤并膨胀凝胶2至4次，每次洗涤约需30分钟至1小时。

为了在荧光显微镜下更清晰地观察细胞，可在第三次洗涤过程中用 DAPI 对细胞进行染色。将 DAPI 储存液用洗涤液稀释 1 至 5,000 倍。将凝胶与 DAPI 溶液共同孵育 30 分钟至 1 小时。

然后用三毫升水再洗涤两次。用三毫升0.01%多聚赖氨酸包被六孔玻璃底成像培养皿，以固定凝胶样品。随后将凝胶样品转移至编码后的成像培养皿中，并使用任意所需的荧光显微镜对样品进行成像。

标记保留型膨胀显微技术相较于蛋白保留型膨胀显微技术或生物素标记膨胀显微技术样本，显示出更强的荧光标记效果。标记保留型膨胀显微技术的荧光信号强度约为蛋白保留型膨胀显微技术的六倍。LR-ExM 能够有效捕捉亚衍射极限分辨率的细微结构，例如网格蛋白包被坑。

使用功能锚定剂 NHS MA dig 和 NHS MA 生物素，对微管和网格蛋白包被小窝进行共免疫染色。类似地，使用三功能锚定剂（如 BG MA 生物素和 BC MA dig）的酶促蛋白标记方法，对网格蛋白包被小窝和线粒体进行标记。此外，将基于免疫染色的方法与酶促蛋白标记方法相结合，以展示核纤层蛋白 A/C 和核孔复合体的结构。

通过对小鼠脑组织进行突触前标志物Bassoon和突触后标志物Homer 1的共免疫染色，实施了标记保留膨胀显微技术。两种标记清晰且分离良好，表明该方法具有高分辨率和高效的标记能力。标记保留膨胀显微技术是一种多功能且稳健的方法，可与其他任何先前报道的膨胀显微技术相结合。

为了实现高分辨率成像，实现高效的标记至关重要，以便更好地捕捉分子尺度的结构。实验室保留型膨胀显微技术是一种有效且稳健的方法，可增强信号强度。