Name: 标签保留扩展显微镜 （LR-ExM） 可实现超分辨率成像和高效标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解标签保留扩展显微镜（LR-ExM）技术，利用三功能锚定分子实现高效荧光标记，信号强度比传统蛋白保留扩展显微镜提高六倍。该技术适用于细胞培养和小鼠脑组织等多种生物样本的超分辨率成像研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（R00 GM126136，授予 X.S.）、美国国家科学基金会（DMS1763272，授予 S.P.）和西蒙斯基金会（594598，授予 S.P.）资助。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>使用在含10% FBS的McCoy's 5A培养基中、37 °C、5% CO2条件下培养的U2OS细胞。</li>
	<li>将细胞接种于16孔可拆卸式腔室盖玻片（培养面积0.4 cm2）中，便于操作。</li>
</ol>
2. 固定与通透处理
注意：固定和通透条件取决于优化的免疫染色方案。以下是用于共免疫染色微管和网格蛋白包被小窝（CCPs）的固定和通透方案。
<ol>
	<li>当细胞计数达到约 0.04 x 106 时，在室温下用 100 µL 含 3.2% 多聚甲醛（PFA）的 PEM 缓冲液（100 mM PIPES、1 mM EGTA 和 1 mM MgCl2，pH 6.9）固定细胞 10 分钟（表 1）。 
	注意：使用 PFA 的固定操作需在经认证的安全通风橱中进行。</li>
	<li>用 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在室温下用 100 µL 透化缓冲液对细胞进行透化处理，持续 15 分钟（表 1）。 
	&#8203;注意：应尽快进行标记操作，以避免靶蛋白、RNA 或 DNA 降解，并获得最佳结果。然而，若有必要，固定后的样品可在 4 °C 的 PBS 缓冲液中长期保存（最长可达一个月）。需补充蒸发损失的 PBS，并防止样品发生光漂白。</li>
</ol>
3. 内源性链霉亲和素和生物素的封闭
<ol>
	<li>将细胞与用细胞封闭缓冲液稀释的链霉亲和素溶液（100 µL）在室温下孵育 15 分钟（表 1）。</li>
	<li>用 200 µL 细胞封闭缓冲液短暂漂洗。</li>
	<li>将细胞与用细胞封闭缓冲液稀释的生物素溶液（100 µL）在室温下孵育 15 分钟。 
	&#8203;注意：当使用自标记标签方法（如 SNAP 或 CLIP 标签）时，跳过步骤 4，直接进行步骤 5.1：自标记标签方法。</li>
</ol>
4. 一抗孵育
<ol>
	<li>将细胞与大鼠抗α-微管蛋白抗体（1:500 稀释）和兔抗网格蛋白重链抗体（1:100 稀释）在 100 µL 细胞封闭缓冲液中孵育，4 °C 孵育 16 小时，或室温孵育 1 小时。组织样本的孵育时间加倍。</li>
	<li>用 200 µL PBS 洗涤样本 4 次，每次 5 分钟。</li>
</ol>
5. LR-ExM 特异性二抗染色
<ol>
	<li>将IgG抗体与三功能连接子（如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-甲基丙烯酰胺（MA）-生物素或NHS-MA-地高辛（Dig））进行偶联（图1B）。三功能锚分子的合成及二抗的偶联方法此前已在Shi等1中介绍。自标记标记方法：将IgG抗体与三功能连接子（如MA-苄基鸟嘌呤（BG）-生物素或MA-苄基胞嘧啶（BC）-Dig）进行偶联（图1B）。三功能锚分子的合成及二抗偶联方法此前已在Shi等1中介绍。</li>
	<li>在100 µL细胞封闭缓冲液中，室温下用驴抗兔-Dig-MA（1:100稀释）和驴抗大鼠-生物素-MA（1:100稀释）二抗孵育细胞，孵育1小时。组织样本的孵育时间加倍。</li>
	<li>用200 µL PBS洗涤样本4次，每次5分钟。</li>
</ol>
6. 额外固定
<ol>
	<li>将细胞与0.25%戊二醛（GA）在PBS中（100 µL）于室温孵育15分钟，以将蛋白质锚定在水凝胶上。或者，可使用25 mM甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）进行锚定，建议在室温下孵育1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤样品三次，每次5分钟。</li>
</ol>
7. 凝胶化
注意：膨胀速度由盐和水扩散出或进入凝胶的时间决定；因此，制备较薄的凝胶可加快膨胀时间。
<ol>
	<li>取下16孔凝胶板的上部结构。向每个孔中加入40 µL单体溶液，于冰上孵育5分钟以对细胞进行预处理。
	<ol>
		<li>单体溶液的配制方法见表2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上配制凝胶溶液。将双蒸水和10% N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）促凝剂加入单体溶液中（10% TEMED : 单体溶液 = 1:47）；此时暂不加入引发剂（表3）。</li>
	<li>对于面积为0.4 cm2的细胞培养腔室，每孔使用约40 µL凝胶溶液。每孔应准备45 µL凝胶溶液。</li>
	<li>向凝胶溶液中加入10%过硫酸铵（APS），在冰上孵育，并立即用移液器将40 µL凝胶溶液加入冰上的硅胶垫圈各孔中。继续在冰上孵育3分钟（10% APS : 10% TEMED : 单体溶液 = 1:1:47）。</li>
	<li>将样品避光，并将10 cm培养皿中的盖玻片转移至37 °C培养箱中孵育1.5小时以完成凝胶化。为保持凝胶在37 °C孵育过程中的湿度，需用培养皿盖盖住培养皿，并在培养皿内加入数滴水。</li>
</ol>
8. 消化
<ol>
	<li>凝胶化后，移除玻璃以分离凝胶，并将凝胶转移至6孔板中。使用2 mL消化缓冲液（表1）在室温下过夜或在37 °C下消化4小时，以消化包埋的细胞。消化缓冲液的用量应至少为凝胶体积的10倍以上。</li>
	<li>使用至少为最终凝胶体积10倍以上的水对凝胶进行洗涤。重复洗涤步骤四次，每次20至30分钟。凝胶在每个维度上大约膨胀两倍。 
	&#8203;注意：凝胶样品可在4 °C的PBS缓冲液中保存长达1个月。需补充蒸发的水分以避免干燥，并在储存期间避免光照。为防止三功能锚定剂降解，建议在消化和洗涤后尽快进行染色。</li>
</ol>
9. 消化后荧光染色
<ol>
	<li>将凝胶在含有 2 至 5 µM STV-染料和/或抗 DIG-染料的 2 mL 体积的链霉亲和素（STV）/地高辛（DIG）染色缓冲液中室温孵育 24 小时。样品需避光保存。</li>
</ol>
10. 扩增
<ol>
	<li>每次使用过量水（2–3 mL）清洗并膨胀凝胶，每次30分钟至1小时，共重复4次。</li>
	<li>为了在荧光显微镜下更清晰地观察细胞，可在五次清洗中的第三次加入DAPI对细胞进行染色。将DAPI储备液（5 mg/mL，4 °C保存）按1:5,000的比例稀释于清洗用水中。将凝胶与DAPI水溶液（2 mL）共同孵育30分钟至1小时。</li>
	<li>再用3 mL水额外清洗两次。</li>
	<li>将凝胶置于足够容纳样品的平底培养皿中进行膨胀。在0.4 cm2面积盖玻片上制备的膨胀凝胶可很好地适配玻璃底6孔板。 
	注意：膨胀后染色的样品可在4 °C的PBS缓冲液中保存长达4个月。需加入足量水以防止干燥，并避免样品发生光漂白。成像前需重复膨胀及DAPI染色步骤。为避免荧光染料降解，样品应尽快成像。</li>
</ol>
11. 成像
<ol>
	<li>用0.01%多聚-L-赖氨酸（每孔3 mL）包被6孔玻璃底成像培养皿，以固定凝胶样品。</li>
	<li>将凝胶样品转移至包被好的成像培养皿中。</li>
	<li>使用任意所需的荧光显微镜对样品进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retention+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-retention expansion microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+expansion+microscopy+with+structured+illumination+microscopy+for+analyzing+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes.</a> Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super+resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size+adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy.</a> Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, 73775(2021).</li>
<li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

LR-ExM 的关键创新在于使用三功能锚定分子有效标记目标蛋白并提高图像质量。该方法受限于三功能锚定分子，而这类分子目前尚不易被研究人员获得。然而，&#160;三功能锚定分子可根据请求与其他研究人员共享，类似产品如 Chrometa 公司的 ExM 探针也已实现商业化供应。
在本方案中，一抗和二抗染色步骤均在室温下孵育1小时。然而，这些步骤也可在4 °C下过夜孵育，据观察，过夜染色可降低背景噪声。
为了防止水凝胶各向异性膨胀导致的结构畸变，使用蛋白酶进行彻底的蛋白质消化至关重要3。然而，以往的扩展显微技术显示，在聚合和蛋白质消化步骤后，超过50%的荧光标记会丢失，从而导致图像质量下降3,4。为解决这一问题，已开发出LR-ExM技术，该方法通过在消化后引入荧光标记，最大限度地减少了信号损失1。
<p class...

自膨胀显微技术（ExM）首次被提出以来，研究人员已将其作为一种便捷的方法，用于在常规显微镜（如落射荧光显微镜和共聚焦显微镜）上实现超分辨率成像1,2,3,4,5,6,7。利用ExM，即使使用普通的共聚焦显微镜，也能实现约70 nm的横向分辨率。当ExM与超分辨率成像技术结合时，分辨率可进一步提高。例如，与结构光照明显微镜（SIM）结合时，分辨率可达约30 nm；与随机光学重建显微镜（STORM）结合时，分辨率可达约4 nm1,5。
然而，标记效率低是标准扩展显微技术（ExM）方法中的一个关键问题。荧光损失的程度可能因荧光基团的类型和消化时间的不同而有所变化。然而据报告，平均而言，在ExM的聚合和蛋白质消化步骤后，超过50%的荧光分子会丢失，这会对成像质量产生不利影响3,4。
因此，已开发出标签保留型膨胀显微技术（label-retention expansion microscopy, LR-ExM），该方法可高效保留标记物并减少信号损失1。LR-ExM 的关键创新在于使用一组三功能锚定分子，而非标准 ExM 流程中仅使用荧光染料来标记目标蛋白。这些三功能连接分子包含三个部分：（1）连接基团（例如 N-羟基琥珀酰亚胺，NHS），用于与抗体结合；（2）锚定基团（例如甲基丙烯酰胺，MA），用于将蛋白锚定至聚合物网络；（3）报告基团（例如生物素或地高辛，DIG），用于与有机荧光染料偶联。三功能锚定分子可在聚合反应和蛋白消化步骤中保持稳定，从而防止荧光基团丢失。
此外，该方法具有巨大潜力，因其可与SNAP或CLIP等自标记酶标签兼容。相较于免疫染色方法，酶标签技术在高特异性和标记效率方面具有一定优势8,9,10。
本文展示了LR-ExM的详细操作流程。LR-ExM是一种高效且灵活的方法，可实现高空间分辨率并提高标记效率。

<table><tbody><tr><td>丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9099&amp;nbsp;</td><td>ExM 凝胶</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG（AffiniPure）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 711&amp;ndash;005-152</td><td>抗体</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG（AffiniPure）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>H+L, 712&amp;ndash;005-153</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记链霉亲和素</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-540-084</td><td>荧光探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 标记链霉亲和素</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-580-084</td><td>荧光探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记链霉亲和素</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-600-084</td><td>荧光探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>过硫酸铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A3678&amp;nbsp;</td><td>ExM 凝胶</td></tr><tr><td>抗 H3K4me3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗 H3K9me3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab176916</td><td>抗体</td></tr><tr><td>DAPI 二乙酸盐</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D3571</td><td>荧光探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 488 标记抗地高辛/地高辛（DIG）抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7488</td><td>荧光探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DyLight 594 标记抗地高辛/地高辛（DIG）抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>DI-7594</td><td>荧光探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>324626-25GM</td><td>固定缓冲液</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>EDTA</td><td>消化缓冲液</td></tr><tr><td>10% 电镜级戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-262-13</td><td>锚定</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureWell 可拆卸腔室盖玻片</td><td>Grace Bio-Labs&amp;nbsp;</td><td>GBL112358-8EA</td><td>细胞培养腔室</td></tr><tr><td>Grace Bio-Labs CultureWell 拆卸工具</td><td>Grace Bio-Labs&amp;nbsp;</td><td>GBL103259</td><td>拆卸工具</td></tr><tr><td>盐酸胍&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G3272&amp;nbsp;</td><td>消化缓冲液</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266-1KG</td><td>固定缓冲液</td></tr><tr><td>McCoy's 5a 培养基</td><td>ATCC</td><td>30&amp;ndash;2007</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯，98%&amp;nbsp;（MA-NHS）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>730300-1G</td><td>锚定</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗 Nup153 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab24700</td><td>抗体</td></tr><tr><td>N,N&amp;prime; 亚甲基双丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>ExM 凝胶</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime; 四甲基乙二胺&amp;nbsp;（TEMED）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T7024&amp;nbsp;</td><td>ExM 凝胶</td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-980-487</td><td>固定缓冲液</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757-25G</td><td>固定缓冲液</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td>腔室包被</td></tr><tr><td>蛋白酶 K&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850-5ML</td><td>消化缓冲液</td></tr><tr><td>兔抗网格蛋白重链抗体</td><td>Abcam</td><td>ab21679</td><td>抗体</td></tr><tr><td>大鼠抗&amp;ndash;&amp;alpha;-微管蛋白抗体，酪氨酸化，克隆 YL1/2</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB1864-I</td><td>抗体</td></tr><tr><td>丙烯酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>408220</td><td>ExM 凝胶</td></tr><tr><td>链霉亲和素/生物素封闭试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2002</td><td>封闭缓冲液</td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>AM9855&amp;nbsp;</td><td>消化缓冲液</td></tr><tr><td>U2OS 细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>6 孔玻璃底培养板</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>成像板</td></tr></tbody></table>

标签保留型扩展显微技术（lr-exm）实现超分辨率成像与高效标记

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling

膨胀显微技术（ExM）是一种样品制备技术，可与大多数光学显微方法结合使用，以提高分辨率。在将细胞或组织包埋于可膨胀的水凝胶后，样品相对于原始尺寸可在线性尺寸上物理膨胀三至十六倍。因此，任何显微镜的有效分辨率均随膨胀倍数相应提高。早期引入的ExM技术存在一个主要局限性，即在聚合和消化步骤后荧光信号减弱。为克服这一局限，已开发出信号保留型膨胀显微技术（LR-ExM），该技术采用一组新型三功能锚定分子，可防止信号丢失并显著提高标记效率。该技术使得在纳米尺度下研究细胞或亚细胞结构时，在荧光信号损失极小的情况下实现更高分辨率。LR-ExM不仅可用于免疫荧光标记，还可与自标记蛋白标签（如SNAP标签和CLIP标签）联用，从而实现更高的标记效率。本文介绍了基于免疫染色的该技术操作流程及故障排除方法，并讨论了LR-ExM中自标记标签策略作为替代方案的应用。

使用三功能锚定分子对网格蛋白包被凹陷（CCPs）进行免疫染色（图1B），并按照图1A所述方法进行LR-ExM。与蛋白保留型扩增显微技术（proExM，图2A）或生物素-ExM（图2B）相比，LR-ExM（图2C、E）显示出更高的荧光强度；LR-ExM的信号强度约为proExM的六倍（图2D）。LR-ExM能够有效捕获CCPs等微小结构，其尺寸甚至小于衍射极限（图2F、G）。
通过免疫染色方法展示了LR-ExM的一些代表性结果。微管和网格蛋白包被小窝（CCPs）使用三功能锚定分子NHS-MA-DIG和NH...

本文演示了一种标签保留型扩增显微镜技术（LR-ExM）的实验方案。LR-ExM采用了一种新型的三功能锚定分子，与此前报道的扩增显微镜技术相比，具有更高的标记效率。

标签保留型扩展显微技术（LR-ExM）实现超分辨率成像与高效标记

膨胀显微技术（ExM）是一种样本制备技术，可与大多数光学显微方法结合使用，以提高分辨率。在……

扩展显微镜技术的一个主要局限在于，荧光在聚合和消化后会减弱。我们称之为LR-ExM的标签保留扩展显微镜技术，使用三功能锚定分子，这些分子可在聚合和消化过程中保持稳定。在使用三功能锚定分子后，我们在扩增步骤之后再引入荧光标记。因此，在实现高分辨率的同时，我们仍能保持良好的信噪比。标记保留型膨胀显微镜可与其他任何先前报道的膨胀显微镜技术以及荧光显微镜技术联用，是一种非常稳健且用途广泛的实验方法。对于高分辨率成像，获得增强的信号至关重要。首先，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将细胞接种于含完全培养基的16孔可拆卸腔室盖玻片中进行培养。当细胞数量达到约40,000时，在室温下用100微升含3.2%多聚甲醛（PFA）的PEM缓冲液固定细胞10分钟。然后在室温下用100 µL通透缓冲液处理细胞15分钟。将细胞与用细胞封闭缓冲液稀释的链霉亲和素溶液在室温下孵育15分钟，随后用200 µL细胞封闭缓冲液短暂漂洗。接着，将细胞与100 µL用细胞封闭缓冲液稀释的生物素溶液在室温下孵育15分钟。随后，将细胞与100微升一抗溶液（包含大鼠抗α微管蛋白抗体和兔抗网格蛋白重链抗体）在4°C孵育16小时，或在室温孵育1小时。然后，将细胞与100微升二抗溶液（包含三功能锚定分子、驴抗兔IgM-DIG MA和驴抗大鼠IgM-生物素MA）在室温孵育1小时。接着，将细胞与100微升0.25%戊二醛溶液在室温孵育15分钟，以将蛋白质锚定在水凝胶上。使用剃刀刀片或任何合适的移除工具取下16孔板的上部结构，保留底部的盖玻片。将盖玻片放入培养皿中，并置于冰上。向每个孔中加入45 µL单体溶液，以对细胞进行预处理。冰上孵育五分钟。配制凝胶溶液时，准备一个1.5毫升的微量离心管。混合单体、双蒸水和10%T med。暂勿加入过硫酸铵。同时，将凝胶溶液管置于冰上。向凝胶溶液中加入10%过硫酸铵。在将凝胶化溶液管置于冰上保存的同时，立即向每个孔中加入40微升凝胶化溶液。将孔板放在冰上继续孵育3分钟。为保持凝胶在37°C孵育过程中的湿度，用培养皿盖盖住培养皿，并在培养皿内加入几滴水。在避光条件下，将盖玻片和10厘米的培养皿转移至37°C培养箱中孵育1.5小时，以完成凝胶化。凝胶化完成后，切割盖玻片以分离各个凝胶，将凝胶转移至6孔板中。向每个孔中加入 2 毫升消化缓冲液。将样品在室温下孵育过夜，或在 37 摄氏度下孵育 4 小时。然后用至少为最终凝胶体积 10 倍以上的水洗涤凝胶，重复洗涤步骤 4 次，每次 20 至 30 分钟，凝胶在每个维度上大约膨胀 4 倍。将凝胶在2毫升体积的链霉亲和素-地高辛标记染色缓冲液中孵育，加入2至5微摩尔的链霉亲和素染料和/或抗地高辛染料，在室温避光条件下孵育24小时。随后用大量水洗涤并膨胀凝胶2至4次，每次洗涤约需30分钟至1小时。为了在荧光显微镜下更清晰地观察细胞，可在第三次洗涤过程中用 DAPI 对细胞进行染色。将 DAPI 储存液用洗涤液稀释 1 至 5,000 倍。将凝胶与 DAPI 溶液共同孵育 30 分钟至 1 小时。然后用三毫升水再洗涤两次。用三毫升0.01%多聚赖氨酸包被六孔玻璃底成像培养皿，以固定凝胶样品。随后将凝胶样品转移至编码后的成像培养皿中，并使用任意所需的荧光显微镜对样品进行成像。标记保留型膨胀显微技术相较于蛋白保留型膨胀显微技术或生物素标记膨胀显微技术样本，显示出更强的荧光标记效果。标记保留型膨胀显微技术的荧光信号强度约为蛋白保留型膨胀显微技术的六倍。LR-ExM 能够有效捕捉亚衍射极限分辨率的细微结构，例如网格蛋白包被坑。使用功能锚定剂 NHS MA dig 和 NHS MA 生物素，对微管和网格蛋白包被小窝进行共免疫染色。类似地，使用三功能锚定剂（如 BG MA 生物素和 BC MA dig）的酶促蛋白标记方法，对网格蛋白包被小窝和线粒体进行标记。此外，将基于免疫染色的方法与酶促蛋白标记方法相结合，以展示核纤层蛋白 A/C 和核孔复合体的结构。通过对小鼠脑组织进行突触前标志物Bassoon和突触后标志物Homer 1的共免疫染色，实施了标记保留膨胀显微技术。两种标记清晰且分离良好，表明该方法具有高分辨率和高效的标记能力。标记保留膨胀显微技术是一种多功能且稳健的方法，可与其他任何先前报道的膨胀显微技术相结合。为了实现高分辨率成像，实现高效的标记至关重要，以便更好地捕捉分子尺度的结构。实验室保留型膨胀显微技术是一种有效且稳健的方法，可增强信号强度。

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