Name: 鸡颅神经嵴细胞培养物的制备及形态学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习从鸡胚胎颅神经褶中分离神经嵴细胞并进行二维培养的方法，用于可视化细胞迁移和形态学分析。该技术为发育生物学研究提供了可重复的原代细胞培养方案。

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我们感谢 Corinne A. Fairchild 和 Katie L. Vermillion，她们参与了我们版本的鸡颅部神经褶培养方案的开发工作。

可使用多种Gallus gallus品种，包括白来航鸡、金羽伴性品系或罗得岛红鸡。本研究中使用的鸡胚来自不同品种，且取自多个来源，包括本地农场和孵化场。
1. 溶液与材料的准备
<ol>
	<li>通过混合 123.3 mM NaCl、1.53 mM CaCl2、4.96 mM KCl、0.809 mM Na2HPO4 和 0.147 mM KH2PO4 配制任氏液（参见材料表）。调节 pH 至 7.4，并过滤除菌后分装至 100 mL 瓶中。存放于洁净干燥处。切勿用肥皂清洗瓶子（按组织培养玻璃器皿处理）。</li>
	<li>将纤连蛋白（FN）溶于无菌任氏液中，配制成 1 mg/mL 的储存液（参见材料表），分装为 100 µL 每份，于 -80 °C 保存（至少可稳定保存 4 年）。</li>
	<li>通过在 L15 培养基中添加 0.8% L-谷氨酰胺、0.08% 青霉素/链霉素、10% 胎牛血清（FBS）和 10% 鸡胚提取物12，配制完全培养基。分装为 3 mL 每份，于 -20 °C 或 -80 °C 保存。 
	注意：若培养物需在 CO2 培养箱中孵育，则需用 DMEM/F12 替代适用于空气缓冲的 L15 培养基。</li>
	<li>用 1× PBS 配制 4% 多聚甲醛溶液，调节 pH 至 7.4。分装为 10 mL 每份，于 -20 °C 保存。 
	警告：多聚甲醛必须在通风橱中操作。</li>
	<li>制备滤纸支撑架（约 1 cm × 1.5 cm 的矩形纸片，沿长轴方向有两个或三个重叠的打孔）。
	<ol>
		<li>使用标准三孔打孔器在大片滤纸上沿边缘打孔，将打孔边缘剪成条状，再在孔之间剪切成约 1.5 cm 长的矩形。使用前对滤纸进行高压灭菌（可选）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备解剖工具，包括精细镊子（#5）、钝头镊子、解剖剪、弹簧剪以及 sharpened tungsten needles16。</li>
</ol>
2. 胚胎孵育
<ol>
	<li>从上述任一来源获取受精卵。</li>
	<li>将受精卵竖直放置（蛋的长轴垂直，尖端朝下，钝端朝上），置于38 °C（100 °F）的加湿培养箱中。</li>
	<li>孵化至形成4到7个体节（8+-9期）17，约需35小时。 
	注意：孵化时间可能因鸡的品系、母鸡年龄、季节等因素而有显著差异，需通过实验确定。使用可编程电源定时器在夜间启动孵化，有助于获得理想的时间安排。</li>
	<li>从培养箱中取出后，用70%乙醇充分喷洒蛋壳，并静置晾干以消毒。 
	&#8203;注意：胚胎可立即收集，但让鸡蛋冷却至室温可降低卵黄和胚胎在收集过程中的脆弱性，减少胚胎损失。</li>
</ol>
3. 培养皿的制备
<ol>
	<li>选择适合下游应用的神经褶培养皿（参见材料表）。
	<ol>
		<li>对于需要固定和染色的培养，将玻璃盖玻片放入多孔组织培养板中使用。 
		注意：与孔大小匹配的盖玻片在液体混合时移动较少，可减少外植体移位，并更有利于其附着于盖玻片而非培养皿底部。</li>
		<li>对于使用倒置显微镜进行活体成像，选择玻璃底单室或分隔室培养皿（参见材料表）。</li>
		<li>对于在直立式或体视显微镜上进行活体成像，使用光学性能合适的6孔、12孔或24孔组织培养板。</li>
		<li>对于大量收集迁移性神经嵴细胞以进行高通量分析，选择塑料组织培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向100 mL无菌林格氏液中加入10 U/mL青霉素和10 µg/mL链霉素（例如，加入100 µL浓度为10,000 U/mL的青霉素和10,000 µg/mL的链霉素），配制林格氏P/S液。林格氏P/S液需在1周内使用完毕。</li>
	<li>将一份1 mg/mL的FN溶液置于冰上解冻，用林格氏P/S液稀释至终浓度为10–100 µg/mL的FN。</li>
	<li>用移液器加入足量FN溶液以覆盖孔或皿的底部。例如，24孔板每孔加100 µL，35 mm培养皿加500 µL。</li>
	<li>盖上盖子，将含有FN溶液的培养皿或板置于湿润培养箱中（或置于装有经蒸馏水浸湿的纸巾的加盖托盘中），在38 °C（100 °F）条件下孵育至少1小时，同时进行神经褶解剖。</li>
</ol>
4. 鸡胚的分离
<ol>
	<li>注意保持卵的方位（在孵化过程中，胚胎会漂浮到卵黄的上方）。使用剪刀或钝头镊子在蛋壳上戳一个小孔，位置大约在蛋长度的1/4至1/3处。
	<ol>
		<li>小心地将剪刀或钝头镊子的尖端插入小孔中，确保不破坏卵黄，然后沿蛋壳周围剪开，移除蛋壳顶部（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整胚胎位置以便分离。 
	注意：如果胚胎在蛋壳杯中的位置不理想，可用钝头镊子小心转动卵黄，使胚胎位于上方。或者，将卵黄倒入戴手套的合拢手掌中，注意不要弄破卵黄，并让蛋白自然流走（图2B）。随后可通过在双手之间移动卵黄来调整胚胎位置。</li>
	<li>用闭合的钝头镊子的平边轻轻擦拭覆盖在胚胎区域卵黄表面残留的多余蛋白，以准备胚胎（图2C）。也可使用精细擦拭纸轻轻按压去除多余的蛋白。 
	注意：清除蛋白后，卵黄表面应呈现纹理状而非光滑状。若未充分去除蛋白，将影响第4步中滤纸支撑架的粘附效果。</li>
	<li>用镊子将滤纸支撑架放置在胚胎上方，使胚胎位于支撑架的窗口区域内。轻轻按压滤纸，使其粘附在卵黄表面。</li>
	<li>用解剖剪沿滤纸支撑架外缘剪下（图2D）。用镊子或剪刀尖夹住支架边缘，轻轻提起胚胎，使其脱离卵黄（图2E）。以一定角度提起有助于干净地将胚胎从卵黄上分离。</li>
	<li>将胚胎连同滤纸支架一起，纸面朝下（即胚胎腹面朝上）放入盛有Ringer's P/S溶液的60 mm或100 mm培养皿中（图2F）。若后续实验对RNA或蛋白质敏感，应将装有胚胎的培养皿置于冰上保存。 
	&#8203;注意：若未将胚胎腹面朝上放置，可能导致其从滤纸支架上脱落。多个胚胎可收集后置于Ringer's P/S溶液中，在进行神经褶解剖步骤前最多可保存1小时。</li>
</ol>
5. 解剖神经褶
<ol>
	<li>将胚胎转移至含有Ringer's P/S溶液的洁净培养皿中，用镊子夹住滤纸框，轻轻前后晃动，以洗去遮挡胚胎视野的卵黄。若溶液变浑浊，应更换Ringer's P/S溶液或将胚胎转移至新的培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下将胚胎背侧/滤纸框朝上放置。保持胚胎附着在滤纸框上以使其充分伸展并固定，用镊子去除卵黄膜，暴露神经褶。 
	注意：若胚胎从滤纸框上脱落，可将其平铺于培养皿中，或固定于硅胶涂层培养皿18上进行解剖。</li>
	<li>使用弹簧剪刀或 sharpened 钨针，小心切除中脑神经褶。应包括视泡膨大区域后方至后脑前方的组织，此处菱脑节（rhombomere）的缩窄结构刚开始出现（心形区也是一个有用的解剖标志，图3B、C）。切除时应注意尽可能保留神经褶最背侧的部分，并尽量减少神经管及非神经外胚层组织的污染（图3C）。</li>
	<li>使用P20移液器或经含卵黄Ringer's P/S溶液冲洗过的无菌玻璃巴斯德移液管，将神经褶转移至含有Ringer's P/S溶液的洁净培养皿中（该预处理可阻断移液管表面，防止组织粘附）。在继续解剖其他神经褶期间，将已收集的组织置于冰上保存。</li>
</ol>
6. 接种神经褶
<ol>
	<li>解冻一份完全培养基（第1节，步骤3）。加入100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，并过滤除菌。在进行其他步骤时，将配制好的培养基保持在37–38 °C。</li>
	<li>从培养箱中取出培养皿（第3节，步骤5）。使用移液器或巴斯德吸管，从盖玻片、培养皿或孔板中移除FN溶液。用Ringer's P/S冲洗FN包被的基质后，向培养皿或孔板中加入适量的完全培养基（24孔板每孔500 µL，35 mm培养皿或6孔板每孔2 mL）。 
	注意：较小体积可节省昂贵的试剂（例如24孔板每孔低至200 µL），但需确保培养皿内湿度足够，以避免蒸发。</li>
	<li>使用P20或P200移液器时，首先用含卵黄的Ringer's P/S冲洗移液枪头，以封闭塑料表面并防止组织粘连。然后将分离的神经褶转移至FN包被的盖玻片上，注意尽量减少Ringer's P/S的带入。将神经褶置于FN包被盖玻片的中央区域。 
	注意：可在19 mm孔内的12 mm盖玻片上接种一个或少数几个神经褶，35 mm培养皿上最多可接种50个。</li>
	<li>让外植块静置10–15分钟后，缓慢而小心地将接种有神经褶的培养皿放入38 °C（100 °F）的湿润培养室中。此操作可最大限度减少神经褶在孔内的移动，确保其保持分散状态并附着于盖玻片上。 
	注意：若使用L15培养基（而非DMEM），外植块培养皿也可置于孵卵器中，采用加盖托盘并垫有湿润纸巾的方式进行培养。</li>
	<li>将神经褶培养物置于湿润培养箱中孵育，持续至活跃迁移阶段结束（总计约16–20小时，图4）。</li>
</ol>
7. 用于形态学分析的培养迁移性神经嵴细胞的固定与染色
<ol>
	<li>用巴斯德吸管移除培养基，并用滤膜除菌的1×PBS冲洗孔板。</li>
	<li>加入4%多聚甲醛，在室温下固定15分钟。 
	注意：固定时间可能需要根据实验条件优化。也可先将多聚甲醛直接加入培养基中（体积比50:50）固定10分钟，随后移除并替换为未稀释的4%多聚甲醛再固定10分钟，以更好地保留较脆弱的细胞结构。</li>
	<li>移除多聚甲醛，并用1×PBS冲洗三次。</li>
	<li>使用适当的染料对固定的神经嵴细胞（NCC）进行染色，以进行形态学评估。以下以Oregon Green标记的鬼笔环肽染色为例进行说明。 
	注意：利用鬼笔环肽19对肌动蛋白细胞骨架进行可视化，可清晰显示迁移性神经嵴细胞的结构复杂性，且染色强度相对均匀；但鬼笔环肽可能无法完全标记所有细胞区域。也可使用标记细胞膜（如麦芽凝集素WGA或DiI）或细胞质的染料，但在明亮的细胞体背景下，这些方法可能使细微突起的成像更加困难。此外，可同时进行免疫荧光染色，以HNK-1标记神经嵴细胞，或确定目标蛋白的亚细胞定位7,20。
	<ol>
		<li>移除最后一次PBS冲洗液，加入含0.5% Triton X-100（PBST）和5%血清（FBS或其他适用于共染抗体的动物血清）的PBS溶液，覆盖盖玻片，于室温在摇床上孵育10分钟。</li>
		<li>将Oregon Green标记的鬼笔环肽（用PBST + 5%血清稀释至200 nM）按每张盖玻片的用量滴加到光滑表面（如柔性石蜡封膜）上。对于12 mm的盖玻片，每滴体积为30 µL。</li>
		<li>用镊子将盖玻片从PBST + 5%血清中取出，确保细胞面朝上。将盖玻片边缘轻轻接触一张洁净擦拭纸，以吸去多余液体。</li>
		<li>将每张盖玻片细胞面向下轻轻放置于稀释的鬼笔环肽液滴上，于室温避光孵育30分钟（可用铝箔包裹的培养皿覆盖或置于抽屉中避光）。</li>
		<li>在孵育期间，向培养板的各孔中加入PBST（24孔板每孔加750 µL）。</li>
		<li>孵育结束后，将盖玻片从染色液中取出，翻转后放回培养板中，使细胞面朝上。确保盖玻片被PBST完全覆盖，并置于摇床上避光振荡洗涤10分钟。移除PBST后重复此步骤两次，共进行三次10分钟的洗涤。</li>
		<li>在载玻片上滴加一滴封片剂（见材料表），每张盖玻片使用约25 µL，适用于12 mm盖玻片。</li>
		<li>最后一次PBST洗涤后，将盖玻片边缘轻轻接触洁净擦拭纸，去除多余液体，并注意保持对细胞面的识别。</li>
		<li>将盖玻片细胞面向下，缓慢倾斜地将其放下至封片剂上，避免产生气泡。待封片剂固化后再进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 培养的迁移性神经嵴细胞的形态学评估
<ol>
	<li>对染色的细胞进行成像，并以 .tiff 文件格式导出。 
	注意：40倍物镜适用于培养物的成像，但也可使用10倍（用于捕获迁移性神经嵴细胞的整体视野）至100倍（单个神经嵴细胞）范围内的物镜进行形态学评估的图像采集。本研究中的图像采用倒置多模态成像平台采集（见 材料表).</li>
	<li>将图像上传至图像分析软件（ImageJ）21，参见 材料表）。点击 图像 &#62; 重复 为每张图像创建一份副本用于分析，从而保留原始图像未经编辑，因为大多数图像处理操作无法撤销。</li>
	<li>点击 图像 &#62; 调节 &#62; 亮度/对比度 使用滑动条调节图像的亮度或对比度。</li>
	<li>按照以下步骤将图像转换为灰度图像。
	<ol>
		<li>如果图像以 RGB 格式导出，则将以合并通道的形式上传为 RGB。要分离图像，请点击 图像 &#62; 颜色 &#62; 拆分通道 以获取单通道灰度图像。</li>
		<li>如果图像已分离，则进入 图像 &#62; 类型 &#62; 8位 将文件转换为灰度图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 图像 &#62; 调节 &#62; 阈值 转换为二值图像，其中像素被识别为细胞（前景；黑色）或背景（白色）。使用滑动条和/或点击 自动 选择阈值设置，以清晰地区分细胞与背景。
	<ol>
		<li>如果细胞存在重叠或染色不连续，可能需要进一步使用Watershed或Fill Holes功能进行处理22这将使细胞彼此分离，或填充待分析细胞内的间隙。点击 过程 &#62; 二元的 &#62; 制作二进制文件 首先将图像转换为8位二进制格式，然后点击 过程 &#62; 二元 &#62; 分水岭 或 填补孔洞. 
		注意：软件将尽可能对需要分离或填充的信号进行最佳拟合，如有必要，可进一步使用插件进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择要采集的测量参数。点击 分析 &#62; 设置测量参数 并勾选用于分析圆形度（Circ.）、长宽比（AR）、圆整度（Round）和实心度（Solidity）的形状描述符选项。 
	注意：根据所需的分析类型，还可包含其他测量参数，如面积和周长。</li>
	<li>点击 分析 &#62; 分析颗粒，并从 &#34;分析颗粒&#34; 菜单
	<ol>
		<li>下 &#34;大小&#34;，大致估计目标细胞或颗粒在像素中的大小，因为如果大小参数保持设置为0至无穷大，则背景信号或较小的细胞碎片也会被包含在内（例如，可设置为500至无穷大） 图5). 
		注意：将尺寸调整为更窄的范围可能会排除比分析所需更小或更大的颗粒。</li>
		<li>在……下方 &#34;圆形度&#34;，将参数保持在0-1.0范围内，以测量图像中所有细胞的形态。</li>
		<li>下 &#34;显示&#34;，选择 裸露轮廓 从下拉菜单中选择以检查所选的细胞轮廓 &#34;分析颗粒&#34; 功能。扫描轮廓以确保重叠的细胞被区分开，但细胞不会被不必要地分割。同时，检查菜单框中的选项 &#34;显示结果&#34;, &#34;总结&#34;，以及 &#34;添加到管理器&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有参数设置完毕后，点击 好的. 
	注意：将弹出四个独立窗口，分别显示（1）图像中已识别细胞的轮廓，（2）图像中已计数的细胞，（3）每个细胞的测量结果，以及（4）细胞总数及其平均测量值的汇总。
	<ol>
		<li>如果计数时将碎片计入，重叠的细胞被计为一个，单个细胞被计为多个，或许多细胞被遗漏，则返回原始未编辑的图像，重新复制一份，并进行调整 &#34;阈值&#34; 或其他参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

本文所述技术提供了一种可调节的方法，用于分离鸡胚神经褶并将其接种培养，从而获得迁移性颅神经嵴细胞（NCC）的培养物。此类培养物为鸡胚神经嵴细胞的迁移和形态学分析提供了简化的二维条件，可作为技术上更具挑战性的鸡胚内（in ovo）成像方法的补充24,25,26。尽管该体外（in vitro）方法相对简单，但获得稳定结果依赖于高质量的种蛋和试剂。此外，由于培养体系本身存在固有的变异性，实验的可重复性需要通过重复实验和定量分析来实现。
神经褶与纤连蛋白（FN）的黏附对于体外培养中神经嵴细胞（NCC）的迁移至关重要。有时外植体无法正常黏附，导致神经褶漂浮或几乎不产生迁移的NCC。这种情况可能发生在头颅神经褶未以切面朝下的方向放置时；因此，在孵育前应尽量将外植体在培养容器中正确摆放，并在移动前静置10–15分钟使其充分沉降。然而，由于转移至培养箱过程中液体混合，部分神经褶...

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎中一种短暂存在的细胞群体。NCCs在神经板的边缘区域被确定，并经历上皮-间质转化（EMT），从背侧神经管迁移而出1。EMT发生后，NCCs广泛分散于整个胚胎中，最终分化并参与形成多种结构，包括颅面骨骼、心脏流出道以及大部分周围神经系统2。细胞极性、细胞骨架以及黏附特性的改变是NCCs从前迁移状态转变为迁移状态的基础3。研究NCC的EMT过程和迁移行为有助于揭示细胞运动的基本机制，并为预防和治疗先天性畸形及癌症转移提供理论依据。
尽管在胚胎环境中，体内分析对于理解神经嵴细胞（NCC）发育过程至关重要，但体外方法提供了更直观的可视化和物理可及性，从而拓展了额外的实验途径。在简化的二维环境中，可对NCC的形态、细胞骨架结构以及迁移距离进行评估。此外，还可分析基因或可溶性因子扰动对运动性NCC迁移行为的影响4,5,6,7,8,9,10。同时，可分离并收集处于迁移前或迁移阶段的NCC，经汇集后用于高通量方法，通过蛋白质组学、转录组学和表观基因组学分析来研究NCC的发育调控机制7,11。尽管已有多种方法可用于从不同的发育模式生物中获取头面部NCC12,13,14，本文旨在介绍针对初次学习培养鸡胚头面部NCC的研究人员所采用的技术操作细节。
本方案描述了一种制备鸡颅神经嵴细胞（NCC）培养物的通用技术（图1）。由于神经嵴细胞（NCCs）可从移植的神经褶迅速迁移至培养基质上，鸡胚NCCs能够自然地从胚胎组织中分离出来，因而易于建立原代培养。当中脑NCCs迁移时 大规模 来自颅部神经褶（与躯干部逐个细胞脱离的方式不同）15），这些培养物主要由迁移性颅神经嵴细胞组成，而通过最初切除神经褶可获得未迁移的神经嵴细胞（NCCs）的收集方法。本文详细介绍了鸡胚颅神经褶分离与培养的基本方法，并提供了该方法在不同应用中的改进与变体建议。
<img alt="神经分化过程示意图，展示细胞提取及在培养皿中培养的过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：鸡胚颅神经褶培养方案的示意图概述。（A,B）从具有五个体节的鸡胚中切除颅神经褶（以蓝色标出，A为背侧视图）。灰色区域：心脏新月区。（C）当接种于纤维连接蛋白上时，迁移性神经嵴细胞从神经褶中出现并扩散至基质表面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>配备由 ZEN 3.0 SR 软件控制的 LSM710 共聚焦扫描头的 AxioObserver 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>使用 alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 物镜</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（玻璃底，单室或分隔式）</td><td>MatTek；Cell Vis</td><td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)&lt;br/&gt; X000NOK1OJ (Cellvis)</td><td>单室 35 mm 或四室 35 mm</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td><td>圆形，厚度 0.13&amp;ndash;0.17 mm，直径范围 12–25 mm 可选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td>L15 培养基的替代选择</td></tr><tr><td>孵蛋器</td><td>Sportsman</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40008A</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td></td><td>3MM 级层析滤纸</td></tr><tr><td>镊子（钝头）</td><td>Fisher Scientific；Thomas Scientific</td><td>08-890 (Fisher)；1141W97 (Thomas)</td><td></td></tr><tr><td>镊子（精细）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Image J</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td><td>免费图像分析软件</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>L15 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>封片剂（Vectashield 或 ProLong Gold）</td><td>Vector Laboratories；ThermoFisher Scientific</td><td>H-1700 (Vectashield)；P36930 (ProLong Gold)</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>10,000 单位/mL 青霉素；10,000 mg/mL 链霉素</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR（或类似品牌）</td><td></td><td>60 mm，100 mm</td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>提供多种荧光标记物</td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>用于钨针（可替代弹簧剪）</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>2.5 mm 刃口（可替代钨针）</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Krayden</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Millex-GV 注射器滤器，0.22 &amp;micro;m，PVDF 材质，33 mm，经伽马射线灭菌</td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td>35 mm 培养皿，用于大量神经褶培养</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>钨丝</td><td>多种来源</td><td></td><td>直径 0.01&quot;，用于制作钨针（可替代弹簧剪）</td></tr></tbody></table>

鸡颅神经嵴细胞培养物的制备与形态学分析

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

在脊椎动物发育过程中，神经嵴细胞（NCCs）广泛迁移并分化为多种细胞类型，参与颅面骨骼和周围神经系统等结构的形成。尽管在三维胚胎背景下理解NCC迁移至关重要，但在二维培养中分离迁移细胞有助于实现细胞的可视化和功能表征，从而补充胚胎研究。本实验方案介绍了一种分离鸡胚颅部神经褶以建立原代NCC培养的方法。将神经褶外植体接种于纤连蛋白包被的基质上后，迁移中的NCCs会从中迁移而出。由此获得分散且贴壁生长的NCC群体，可通过染色和定量形态学分析进行评估。该简化培养方法具有高度可适性，可与其他技术结合使用。例如，可通过延时成像分析NCC的迁移行为，或通过引入抑制剂、基因表达干预手段（如DNA、吗啉寡核苷酸或CRISPR电穿孔）进行功能研究。由于其多功能性，该方法为研究颅部NCC的发育提供了强有力的实验体系。

本方案的总体流程见图1。将孵育的鸡蛋打开，轻轻倒入戴手套的手掌中，分离出表面带有胚胎的卵黄（图2A，B）。清除蛋白后（图2C），将滤纸框置于包围胚胎的卵黄膜上，以辅助切割并提起胚胎；一旦卵黄膜被切开，卵黄即开始流出（图2D，E）。
<img alt="六步提取卵膜过程：破壳、去蛋黄、分离膜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2<strong...

该多功能实验方案描述了通过切除鸡胚头部神经褶来分离迁移前神经嵴细胞（NCCs）的方法。将神经褶外植体接种并培养后，迁移期的神经嵴细胞会从中迁移而出，从而可在简化的二维环境中对细胞形态和迁移行为进行评估。

在脊椎动物发育过程中，神经嵴细胞（NCCs）广泛迁移并分化为多种细胞类型，参与形成诸如……等结构

神经嵴细胞从胚胎的头部神经褶迁移出来，或在培养条件下发生迁移。这为分离原代迁移性神经嵴细胞提供了一种无需细胞解离的便捷方法。虽然神经嵴细胞的迁移通常发生在三维胚胎环境中，但二维培养体系使得迁移相关过程的观察和研究成为可能。尽管已有颅部神经褶培养方案，但该方法需要专门训练以及针对特定生物体的操作步骤。本视频展示了促进鸡胚颅部神经褶培养可重复制备的技术。初学者通常在神经褶的解剖与接种以及培养结果的评估方面存在困难。遵循本文所述的解剖指南并应用形态测量分析，可获得一致且定量的结果。首先，将受精卵置于38摄氏度的湿润培养箱中，保持直立位置。从培养箱中取出卵后，用70%乙醇充分喷洒卵壳进行消毒，并使其干燥。对于培养物的固定和染色，使用放置在多孔组织培养板中的玻璃盖玻片，并加入足量纤连蛋白溶液以覆盖孔底。接着盖上盖子，在38摄氏度的湿润培养箱中孵育至少一小时，同时进行神经褶的解剖。用钝镊子在鸡蛋长度的1/4至1/3处戳一个小孔。将钝头镊子小心插入小孔中，注意不要破坏蛋黄。然后沿蛋壳周围剪开，移除蛋壳顶部，并调整胚胎位置以便分离。用闭合的钝头镊子的平边轻轻擦拭覆盖在胚胎表面的蛋黄上的多余蛋白，以准备胚胎。使用镊子将滤纸支撑架放置在胚胎上方，使胚胎位于支撑架的窗口内。轻轻按压滤纸，使其贴附于卵黄表面。用解剖剪沿滤纸支撑架的外缘进行剪切。使用镊子或剪刀尖夹住滤纸框的边缘，轻轻将胚胎从卵黄上提起。将带有滤纸框的一面朝下，把胚胎放入盛有含青链霉素的林格氏液的60或100毫升培养皿中。若胚胎后续将用于对RNA或蛋白质敏感的下游实验，请将培养皿置于冰上保存。将胚胎转移至含有林格氏青链霉素溶液的洁净培养皿中。轻轻前后晃动胚胎，以清除遮挡视野的卵黄，并在溶液变浑浊时更换林格氏青链霉素溶液或将胚胎转移至新的培养皿中。在解剖显微镜下，将胚胎背侧朝上、框架侧朝上放置。将胚胎留在纸框上，以保持其伸展并固定位置。然后用镊子去除卵黄膜，暴露神经褶。所取组织应包括视泡扩展部位后方、后脑前方的区域，即菱脑节缩窄刚开始出现的部位。使用弹簧剪小心地切取中脑神经褶。注意切取神经褶最背侧的部分，尽量减少对神经管和非神经外胚层的污染，并使用 P20 移液器或用含卵黄的任氏青链溶液冲洗过的无菌玻璃巴斯德移液器，将神经褶转移至含有任氏青链溶液的洁净培养皿中。在继续解剖其他神经褶时，将已收集的神经褶置于冰上保存。从培养箱中取出培养皿后，使用移液器或巴斯德吸管将纤连蛋白溶液从盖玻片、培养皿或孔中移除。用含青霉素-链霉素的林格氏液冲洗纤连蛋白包被的基质后，向培养皿或孔中加入适量的完全培养基。为阻断塑料表面并防止组织粘附，使用P20或P200移液器，并用含卵黄的林格氏青霉素-链霉素溶液冲洗移液器吸头。然后，将分离的神经褶转移至纤维连接蛋白包被的盖玻片中央，注意尽量减少林格氏青链溶液的转移量。待外植体沉降10至15分钟后，缓慢而小心地将含有神经褶的培养皿移入38摄氏度的湿化培养 chamber 中。用巴斯德吸管吸除培养基，并用滤膜除菌的PBS缓冲液冲洗孔板。加入4%多聚甲醛，在室温下置于摇床上孵育15分钟。孵育结束后，去除多聚甲醛，用PBS洗涤3次，然后加入含有5%血清的PBST。接着，每张盖玻片在平滑表面滴加30微升200纳米浓度的Oregon Green标记鬼笔环肽。使用镊子从含有 5% 血清的 PBST 中取出盖玻片，确保细胞面朝上。用盖玻片边缘短暂接触擦镜纸，吸去多余液体。将每张盖玻片细胞面朝下轻轻放置在稀释的鬼笔环肽液滴上，室温避光孵育 30 分钟。孵育结束后，将盖玻片从染色液中取出，放回培养皿中，并翻转使其细胞面朝上。确保用PBST覆盖盖玻片，置于平台摇床上避光振荡10分钟，期间保持盖玻片被液体覆盖且避光。移除PBST，再重复洗涤两次，共进行三次、每次10分钟的洗涤。在显微镜载玻片上滴加一滴封片剂。将盖玻片细胞面朝下，以倾斜角度缓慢放下盖玻片至封片剂上，避免产生气泡，待封片剂固化后再进行成像。最后，对染色的细胞进行成像，并将其导出为TIFF文件。神经嵴细胞在培养3至4小时后开始从贴壁的神经褶外植体中出现，迁移过程在约20小时后完成。使用HNK-1对迁移的神经嵴细胞进行标记，大多数细胞呈HNK-1阳性。通过鬼笔环肽染色纤维状肌动蛋白，可观察到已迁移的神经嵴细胞。使用 ImageJ 对鬼笔环肽染色的细胞图像进行处理，生成阈值图像，其中细胞呈黑色，背景为白色。对阈值图像进行分析，并将各项测量结果以对比柱状图或小提琴图显示。例如，所分析的69个细胞的平均面积约为802.11平方微米，范围从60.27至2,664.53平方微米。圆形度反映了细胞的突出程度，取值范围为 0.101 至 0.875。较低的数值表示细胞呈细长形态，而数值为 1 时则代表完美的圆形。大多数细胞呈现细长形态，这一点在小提琴图中最为明显。该区域的迁移性神经嵴细胞平均长宽比约为 2.13，而长宽比为 1 表示细胞呈对称形状。精确切除并进行外植体接种对于成功培养至关重要。让神经褶切面朝下静置 10 至 15 分钟，然后缓慢转移至培养箱，以促进细胞贴附。这些技术的变体包括在培养前进行瞬时基因操作以及在孵育期间进行延时成像。此外，本方案还允许收集迁移前和迁移期的神经嵴细胞群体，用于组学水平的分析。

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发育生物学

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制备鸡胚提取物以培养小鼠神经嵴干细胞

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利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

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