鸡颅神经嵴细胞培养物的制备与形态学分析

神经嵴细胞从胚胎的头部神经褶迁移出来，或在培养条件下发生迁移。这为分离原代迁移性神经嵴细胞提供了一种便捷的方法，无需进行细胞解离。虽然神经嵴细胞的迁移通常发生在三维胚胎环境中，但二维培养体系使得迁移相关过程的观察与研究成为可能。

尽管已有颅部神经褶培养方案，但该方法需要专门训练以及针对特定生物体的操作步骤。本视频展示了促进鸡胚颅部神经褶培养可重复制备的技术。初学者通常在神经褶的解剖与接种以及培养结果的评估方面存在困难。

遵循本文所述的解剖指南并应用形态测量分析，可获得一致且定量的结果。首先，将受精卵置于38摄氏度的湿润培养箱中，保持直立位置。从培养箱中取出卵后，用70%乙醇充分喷洒卵壳进行消毒，并使其干燥。

进行培养物的固定和染色时，将玻璃盖玻片放入多孔组织培养板中，并加入足量纤连蛋白溶液以覆盖孔底。接着盖上盖子，在38摄氏度的湿化培养箱中孵育至少一小时，同时进行神经褶的解剖。使用钝头镊子在距蛋壳长度1/4至1/3处戳一个小孔。

将钝头镊子小心插入小孔中，注意不要破坏蛋黄。然后沿蛋壳周围剪开，移除蛋壳顶部，并调整胚胎位置以便分离。用闭合的钝头镊子的平边轻轻擦拭覆盖在胚胎表面的蛋黄上的多余蛋白，以准备胚胎。

使用镊子将滤纸支撑架放置在胚胎上方，使胚胎位于支撑架的窗口内。轻轻按压滤纸，使其贴附于卵黄表面。用解剖剪沿滤纸支撑架的外缘进行剪切。

使用镊子或剪刀尖夹住滤纸框的边缘，轻轻将胚胎从卵黄上提起。将胚胎连同滤纸框一起，纸框面朝下放入盛有含青链霉素的林格氏液的60或100毫升培养皿中。若胚胎后续将用于对RNA或蛋白质敏感的下游实验，请将培养皿置于冰上保存。

将胚胎转移至含有林格氏青链霉素溶液的洁净培养皿中。轻轻前后晃动胚胎，以清除遮挡视野的卵黄，并在溶液变浑浊时更换林格氏青链霉素溶液或将胚胎转移至新的培养皿中。在解剖显微镜下，将胚胎背侧朝上、切片面朝上放置。

将胚胎保留在纸框上，以保持其伸展并固定位置。然后用镊子去除卵黄膜，暴露神经褶。所取组织应包括视泡扩展部位后方以及后脑前方的区域，即菱脑节缩窄刚开始出现的部位。

使用弹簧剪小心地切取中脑神经褶。注意在切取神经褶最背侧部分时，尽量减少神经管和非神经外胚层的污染，并使用P20移液器或经含卵黄的Ringer's青链霉素溶液冲洗过的无菌玻璃巴斯德移液管，将神经褶转移至含有Ringer's青链霉素溶液的洁净培养皿中。在继续解剖其他神经褶时，将已收集的神经褶置于冰上保存。

从培养箱中取出培养皿后，使用移液器或巴斯德移液管将纤连蛋白溶液从盖玻片、培养皿或孔中移除。用含青霉素-链霉素的林格氏液冲洗纤连蛋白包被的基质后，向培养皿或孔中加入适量的完全培养基。为阻断塑料表面并防止组织粘附，使用P20或P200移液器，并用含卵黄的林格氏青霉素-链霉素溶液冲洗移液器吸头。

然后，将分离的神经褶转移至经纤连蛋白包被的盖玻片中央，注意尽量减少林格氏青链溶液的转移量。待外植体沉降10至15分钟后，缓慢而小心地将含有神经褶的培养皿移入38摄氏度的湿化培养 chamber 中。用巴斯德吸管吸除培养基，并用滤膜除菌的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗孔板。

加入4%多聚甲醛，在室温下于摇床上孵育15分钟。孵育结束后，去除多聚甲醛，用PBS洗涤3次，然后加入含5%血清的PBST。接着，每张盖玻片在光滑表面滴加30微升200纳米浓度的Oregon Green标记鬼笔环肽。

使用镊子从含有5%血清的PBST中取出盖玻片，确保细胞面朝上。用盖玻片边缘轻轻接触擦镜纸，吸去多余液体。将每张盖玻片细胞面朝下轻轻放置在稀释的鬼笔环肽液滴上，室温孵育30分钟。

孵育结束后，将盖玻片从染色液中取出，放回培养皿中，并翻转使其细胞面朝上。确保用PBST覆盖盖玻片，置于平台摇床上避光振荡10分钟，期间保持盖玻片被液体覆盖且避光。移除PBST，再重复洗涤两次，共进行三次10分钟洗涤。

在显微镜载玻片上滴加一滴封片剂。将盖玻片细胞面朝下，以倾斜角度缓慢放下盖玻片至封片剂上，避免产生气泡，待封片剂固化后再进行成像。最后，对染色的细胞进行成像，并将其导出为TIFF文件。

神经嵴细胞在培养3至4小时后开始从贴壁的神经褶外植体中出现，迁移过程在约20小时后完成。使用HNK-1对迁移的神经嵴细胞进行标记，大多数细胞呈HNK-1阳性。通过用鬼笔环肽染色丝状肌动蛋白，可观察到已迁移的神经嵴细胞。

使用 ImageJ 对鬼笔环肽染色的细胞图像进行处理，生成阈值图像，其中细胞呈黑色，背景为白色。对阈值图像进行分析，并将各项测量结果以对比柱状图或小提琴图显示。例如，所分析的 69 个细胞的平均面积约为 802.11 平方微米，范围从 60.27 至 2,664.53 平方微米。

圆形度反映了细胞的突出程度，其数值范围为 0.101 至 0.875。较低的数值表示细长的形态，而数值为 1 则表示完美的圆形。大多数细胞呈现细长形态，这一点在小提琴图中最为明显。

该区域的迁移性神经嵴细胞平均长宽比约为2.13，而长宽比为1时表明细胞呈对称形态。精确切除并进行外植体接种对于成功培养至关重要。让神经褶切面朝下静置10至15分钟，然后缓慢转移至培养箱中，以促进细胞贴壁。

这些技术的变体包括在培养前进行瞬时基因操作以及在孵育期间进行延时成像。此外，本方案允许收集迁移前和迁移中的神经嵴细胞群体，用于组学水平的分析。