剖析自然杀伤细胞与伤害感受性神经元之间的相互作用

鉴于伤害感受性神经元会分泌多种神经肽，而自然杀伤细胞（NK细胞）表达这些神经肽的受体，我们决定设计一种共培养方法，以研究NK细胞与伤害感受性神经元之间的相互作用。这种简化的研究方法有助于探讨伤害感受性神经元如何调控NK细胞的抗肿瘤功能，同时也可用于研究NK细胞如何调控受损神经元的清除过程。本实验操作将由我实验室前硕士研究生Ali Ahmadi进行演示。

开始自然杀伤（NK）细胞的分离与培养时，将小鼠脾脏收集至含有500微升无菌PBS的1.5毫升微量离心管中，然后使用研磨杵充分匀浆脾脏组织。接着，加入1毫升无菌PBS稀释细胞悬液，并通过50微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。最后，用无菌PBS将滤过的匀浆液体积补足至10毫升。

使用血细胞计数板对10微升稀释后的匀浆液进行细胞计数。将剩余细胞在500 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。然后将细胞重悬于补充型RPMI 1640培养基中，调整细胞密度至每毫升10的8次方个细胞。

使用小鼠NK细胞分离试剂盒通过磁珠法纯化脾脏NK细胞，并通过流式细胞术确认NK细胞纯度。使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后以500 × g离心5分钟，弃去上清液。为刺激沉淀中的NK细胞，将细胞重悬于添加了IL-2和IL-15的RPMI 1640培养基中。

在96孔圆底板中以每毫升2×10⁶个NK细胞的密度培养48小时。在NK细胞刺激前24小时，用层粘连蛋白以每孔100 µL的量包被96孔板，并在37°C下孵育45分钟。孵育结束后，移除溶液，并在生物安全柜中让各孔自然晾干。

接下来，将已实施安乐死的小鼠俯卧位固定在解剖板上。提起皮肤，沿背部中线切开皮肤。剪断腰骶关节，并用剪刀将骶骨与腰椎分离。

然后沿颅侧方向剪开两侧的肌肉和肋骨，直至到达颅底，从而分离脊柱。使用剪刀在枕寰关节处剪断脊柱。接着，去除脊柱上的肌肉和脂肪组织。

固定并打开脊柱以取出脊髓，然后才能接触到通过背根与脊髓相连的椎间孔内的背根神经节（DRG）。接着，将分离出的DRG收集到一个含有10毫升冰上预冷的含补充物DMEM培养基的15毫升锥形管中。随后在室温下以200 × g离心5分钟，并弃去上清液。

加入250 µL含有1 mg/mL胶原酶IV和2.4 U/mL分散酶II的PBS。将背根神经节（DRG）与胶原酶-分散酶溶液在轻度振荡条件下孵育80分钟。为灭活酶活性，加入5 mL添加了补剂的DMEM培养基，并在200 ×g离心5分钟。离心后，用移液器小心吸除上清液，保留约100 µL上清液以避免细胞意外丢失。随后，向细胞中加入1 mL添加了补剂的DMEM培养基，使用移液器及三支口径依次减小的玻璃巴斯德吸管轻轻吹打，将DRG机械解离为单细胞悬液。

在生物安全柜中操作时，将牛血清白蛋白（BSA）用无菌 PBS 稀释至终浓度为 15%，并将一毫升分装液储存于 -20 摄氏度。在 15 毫升锥形管中制备 BSA 梯度时，先加入 2 毫升无菌 PBS，然后缓慢将 1 毫升 15% BSA 溶液加至管底。移液管应轻柔取出，避免破坏梯度。

使用P200移液器，将含有神经元的匀浆后神经节悬液沿管壁加入梯度液中。然后将加速度和减速度调至最低，以200 ×g离心12分钟，使含BSA梯度的神经元分离。离心后，用移液器吸除全部上清液，并将细胞重悬于500 µL Neurobasal培养基中。将每微升含10,000个神经元的细胞悬液接种至经层粘连蛋白包被的平底96孔板中，每孔接种一个样本。

为了促进神经元的贴附，将96孔板在37摄氏度下孵育过夜。开始共培养时，缓慢移除神经元培养中的Neurobasal培养基。用IL-2和IL-15刺激48小时后，重悬NK细胞，并向神经元培养孔中每孔加入10的5次方个NK细胞。

将细胞在添加补充物的 Neurobasal MX 培养基中于 37 摄氏度共培养。48 小时后，用 PBS 收集细胞并洗涤三次，随后在 4 摄氏度下以 500 ×g 离心五分钟。弃去上清液，再于 4 摄氏度下用 1:1,000 稀释的活细胞染料 eFluor 780 染色 15 分钟。

按照上述方法洗涤并离心细胞，随后在4摄氏度下用CD 1632处理细胞15分钟，以阻断细胞上的非特异性结合位点，接着用PBS洗涤细胞三次并收集细胞。完成下一轮洗涤和离心后，使用BV421、抗NK-1.1、异硫氰酸荧光素标记的抗NKp46以及藻红蛋白标记的抗GM-CSF抗体对细胞进行染色，染色时间为15分钟。再次用PBS洗涤细胞三次，收集细胞后离心并弃去上清液，然后将细胞重悬于500微升FACS缓冲液中，通过流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析。

单独培养时，NK细胞表达基础水平的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和NKp46。当与来自伤害感受器完整小鼠的背根神经节（DRG）神经元共培养时，辣椒素刺激降低了NK细胞GM-CSF的表达。然而，当与来自伤害感受器消融小鼠的DRG神经元共培养时，辣椒素对NK细胞活化无影响。

NKp46 水平未受影响。本方案的关键步骤在于背根神经节的解离与分离。其核心在于通过避免产生气泡并使用合适尺寸的移液器，以最大限度保持神经元的活性。

实验方案完成后，研究者可采用RNA测序或qPCR检测经FACS纯化的细胞中转录水平的变化，或使用ELISA检测细胞因子或神经肽的分泌情况。这种相互作用表明，NK细胞功能可能受到伤害感受性神经元的调节。此类双向交流可能在从神经损伤、细菌和病毒感染到恶性肿瘤等多种生物过程中发挥重要作用。