Name: 梳理自然杀伤细胞和伤害感受神经元之间的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解自然杀伤细胞与伤害感受神经元相互作用的共培养方法，用于研究神经免疫调控机制。该方法通过流式细胞术分析NK细胞功能，揭示炎症和肿瘤免疫中的细胞互作关系。

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本工作得到了以下机构的支持：&#160;加拿大研究新前沿基金（NFRFE201901326）、加拿大卫生研究院（162211、461274、461275）、加拿大创新基金会（37439）、加拿大研究主席计划（950-231859）、加拿大自然科学与工程研究理事会（RGPIN-2019-06824）以及魁北克自然与技术研究基金会（253380）。

蒙特利尔大学机构动物护理与使用委员会（#22053，#22054）批准了所有动物实验程序。有关本实验方案中所用溶液及其成分的列表，请参见表1；有关材料、设备和试剂的列表，请参见材料表。
1. NK细胞的分离、培养与刺激
<ol>
	<li>通过将lox-stop-lox-白喉毒素小鼠（DTAfl/fl）与TRPV1cre/wt小鼠杂交，获得伤害感受神经元完整（同窝对照；TRPV1wt::DTAfl/wt）和消融（TRPV1cre::DTAfl/wt）的小鼠。</li>
	<li>使用CO2吸入法对一只未经处理的同窝对照小鼠（TRPV1wt::DTAfl/wt）实施安乐死。</li>
	<li>将脾脏收集至含有500 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>使用研磨杵匀浆脾脏组织。</li>
	<li>用1 mL无菌PBS稀释细胞悬液。</li>
	<li>将混合液通过50 µm细胞筛网过滤至15 mL锥形管中。</li>
	<li>用无菌PBS补足体积至10 mL。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>离心细胞（500 × g，5分钟），弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于补充培养基的RPMI 1640培养基中，调整浓度为108个细胞/mL。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用小鼠NK细胞分离试剂盒通过磁珠分选法纯化脾脏NK细胞。通过流式细胞术确认NK细胞纯度11。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>离心细胞（500 × g，5分钟），弃去上清液。</li>
	<li>将NK细胞重悬于含IL-2和IL-15的补充RPMI 1640培养基中。</li>
	<li>将2 × 106个NK细胞/mL接种于96孔U型底培养板中，培养48小时。</li>
</ol>
2. 背根神经节神经元的分离与培养
<ol>
	<li>在NK细胞刺激结束前24 h（步骤1.15），用100 µL/孔的层粘连蛋白（1 ng/mL）包被96孔板，37 °C孵育45 min。</li>
	<li>孵育后，移除溶液，让孔板在室温下自然干燥&#160;生物安全柜</li>
	<li>使用 CO2 吸入，安乐死，伤害感受神经元完整（同窝对照；TRPV1）野生型::DTAfl/wt）或消融（TRPV1cre::DTAfl/wt）小鼠。 
	注意：CO2 吸入法优于颈椎脱位法，因其可避免损伤与背根神经节（DRG）相连的脊神经。</li>
	<li>将小鼠俯卧位固定于解剖板上，提起皮肤，沿背部中线切开皮肤。详细操作视频参见 Perner 等人12.</li>
	<li>剪断腰骶关节，用剪刀将骶骨与腰椎分离。</li>
	<li>沿脊柱两侧向颅侧方向切断肌肉和肋骨，分离脊柱，直至到达颅底。</li>
	<li>使用剪刀在枕寰关节处剪断脊柱。</li>
	<li>去除脊柱上的肌肉和脂肪组织。</li>
	<li>用大头针固定并打开脊柱，以取出脊髓并暴露背根神经节（DRG）。在椎间孔处寻找DRG，其通过背根与脊髓相连，但与脑膜分离。</li>
	<li>将DRG收集至含有10 mL冰上预冷的添加物DMEM的15 mL锥形管中。</li>
	<li>离心样品（200 × g，5 分钟，室温）并移除上清液。</li>
	<li>加入含有胶原酶 IV（1 mg/mL）和 Dispase II（2.4 U/mL）的 PBS 250 µL。</li>
	<li>将背根神经节与胶原酶IV/分散酶II（C/D）溶液共同孵育（37 °C，80分钟，轻度振荡）。若合并来自多只小鼠的神经节，需维持每神经节125 µL C/D溶液的比例。</li>
	<li>为灭活酶，加入5 mL添加了补剂的DMEM培养基。</li>
	<li>离心溶液（200 × g，5 分钟）后，用移液器小心吸去上清液。</li>
	<li>为避免不必要的细胞损失，残留约100 µL上清液。</li>
	<li>加入1 mL含补充物的DMEM培养基。</li>
	<li>使用移液枪和三支尺寸依次减小的玻璃巴斯德吸管，轻轻吹打背根神经节（DRG），每次更换吸管上下吹打约10次，直至形成单细胞悬液。</li>
	<li>在生物安全柜中，将牛血清白蛋白（BSA）用无菌 PBS 稀释至终浓度为 15%。分装为 1 mL 每份，于 −20 °C 保存。</li>
	<li>在15 mL锥形管中，加入2 mL无菌PBS，然后缓慢将1 mL 15% BSA溶液加至管底，形成BSA梯度。移除移液器时应轻柔操作，避免破坏梯度。</li>
	<li>使用 P200 移液器，将经研磨的神经节悬液（含有神经元）缓慢地沿管壁加入梯度液中。</li>
	<li>离心含有神经元的BSA梯度溶液（200 × g，12 分钟，室温）。将离心机的加速度和减速度设置为最低速度。 
	注意：离心后，神经元将位于管底，而细胞碎片则会被截留在BSA梯度中。</li>
	<li>使用移液器轻轻吸出所有上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于500 µL Neurobasal培养基中。</li>
	<li>10号培养皿4 每孔（每孔200 µL神经基础培养基）接种于经层粘连蛋白包被的平底96孔板中。 
	注意：通常情况下，每只小鼠平均可填充约8个孔。</li>
	<li>将神经元在37 °C下培养过夜，以促进贴壁。</li>
</ol>
3. 共培养与流式细胞术
<ol>
	<li>缓慢移除神经元培养物中的Neurobasal培养基。</li>
	<li>经IL-2和IL-15刺激48小时后（见步骤1.14–1.15），重悬NK细胞，并将105个NK细胞/孔加入神经元培养物中（96孔平底板）。 
	注意：平均而言，每只小鼠可处理约6个孔。</li>
	<li>在添加补充物的Neurobasal MX培养基中共同培养细胞（37 °C，48小时）。</li>
	<li>收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。</li>
	<li>弃去上清液，用Viability Dye eFlour-780（1:1,000，15分钟，4 °C）对细胞进行染色。</li>
	<li>收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。</li>
	<li>使用CD16/32封闭细胞上的非特异性结合位点（1:100，15分钟，4 °C）。</li>
	<li>收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。</li>
	<li>用BV421标记的抗NK-1.1抗体（1:100）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗NKp46抗体（1:100）以及藻红蛋白（PE）标记的抗GM-CSF抗体（1:100）对细胞进行染色（15分钟，4 °C）。</li>
	<li>收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于FACS缓冲液（500 µL）中，通过流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析11。免疫分群策略见图1A。</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

Davies 等人11 发现受损神经元会上调 RAE1。 通过 细胞间接触后，表达 NKG2D 的 NK 细胞能够识别并清除 RAE1+ 神经元，进而限制慢性疼痛11鉴于自然杀伤细胞也表达多种神经肽受体，而这些神经肽以其免疫调节能力著称，研究自然杀伤细胞与伤害感受神经元之间的相互作用显得愈发重要 体外在此，我们设计了一种简单的共培养方案，使研究者能够探究神经元如何调控自然杀伤细胞（NK细胞）的功能，以及NK细胞反过来如何调节背根神经节（DRG）神经元的功能。采用流式细胞术对神经元调控NK细胞活化的过程进行免疫表型分析。此外，研究者也可使用qPCR或RNA测序技术检测经FACS分选纯化的细胞中的转录变化，或利用ELISA分析细胞分泌的细胞因子或神经肽等分泌因子的释放情况。原始数据已存入并免费提供于www.talbotlab.com。
本研究发现，TRPV1+ 伤害感受神经元在辣椒素作用之后，可抑制自然杀伤细胞（...

感觉神经元的胞体起源于背根神经节（DRG）。DRG位于周围神经系统（PNS）中，介于脊髓的背角与周围神经末梢之间。DRG神经元的假单极结构使其能够将来自外周分支的信息（支配靶组织）传递至中枢分支，后者将躯体感觉信息传送到脊髓1。通过特化的离子通道受体，初级神经元可感知病原体、过敏原和污染物带来的威胁2，从而引起阳离子（Na+、Ca2+）内流并产生动作电位3,4,5。
这些神经元还会向周围组织传递逆向动作电位，即最初发生危险感知的部位，从而导致神经肽在局部释放1,4。因此，伤害感受神经元起到一种保护机制的作用，可提醒机体注意环境中的危险4,5,6,7。&#160;
为了与二级神经元进行通信，伤害性感受器会释放多种神经递质（例如谷氨酸）和神经肽（例如降钙素基因相关肽（CGRP）、P 物质（SP）和血管活性肠肽（VIP））6,7。这些肽类作用于毛细血管，促进血浆外渗、水肿以及局部免疫细胞的浸润和调节2,4,7。
躯体感觉系统和免疫系统利用由细胞因子和神经肽及其相应特异性受体组成的共同通讯系统4。这种双向通讯在帮助机体抵御危险和维持稳态的同时，也可能参与疾病病理生理过程的调控4。&#160;
自然杀伤细胞（NK细胞）属于先天性淋巴细胞，专门负责清除病毒感染的细胞。NK细胞的功能由一系列激活性和抑制性受体的平衡所调控，其中包括激活性受体NKG2D8。NKG2D的内源性配体——视黄酸早期诱导因子1（RAE1）——在发生应激（如肿瘤发生和感染）的细胞中表达8,9。
最近的研究表明，外周神经损伤会促使感觉神经元表达诸如stathmin 2（STMN2）和RAE1等适应不良分子。因此， 通过 细胞间接触后，表达 NKG2D 的自然杀伤细胞通过与表达 RAE1 的神经元相互作用而被激活。随后，自然杀伤细胞能够清除受损的伤害性感受神经元，并抑制通常与神经损伤相关的疼痛过敏反应10除了NKG2D-RAE1轴外，自然杀伤细胞还表达多种伤害感受器产生介质的相应受体。因此，这些介质可能调节自然杀伤细胞的活性。本文介绍了一种共培养方法，用于研究伤害感受器神经元与自然杀伤细胞相互作用的生物学特性。该方法将有助于深入理解伤害感受器神经元如何调节先天免疫细胞对损伤、感染或恶性病变的反应。

<table><tbody><tr><td>抗小鼠 CD16/32</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Cat no: 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Cat no: 009669</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）培养级</td><td>World Precision Instruments</td><td>Cat no: 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 抗小鼠 NK-1.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: 12430112</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（50 &amp;mu;m）</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: A3160702</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: 15140148</td><td></td></tr><tr><td>白喉毒素&lt;sup&gt;fl/fl&lt;/sup&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>分散酶 II</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat no: 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 小鼠 NK 细胞分离试剂盒</td><td>Sigma</td><td>Cat no: CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>Cat no: C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 NKp46</td><td>Sigma</td><td>Cat no: L2020</td><td></td></tr><tr><td>平底 96 孔板</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 03690</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>Sigma</td><td>Cat no: 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）</td><td>VWR</td><td>Cat no: 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Cedarlane</td><td>Cat no: 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>Cat no: A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>小鼠重组 IL-15</td><td>Gibco</td><td>Cat no: 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>小鼠重组 IL-2</td><td>Gibco</td><td>Cat no: 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>神经生长因子（NGF）</td><td>Life Technologies</td><td>Cat no: 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>PeproTech</td><td>Cat no: 210-15</td><td></td></tr><tr><td>研磨棒</td><td>Stem Cell Technology</td><td>Cat no: 19855</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 108732</td><td>克隆 PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 137606</td><td>克隆 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1&lt;sup&gt;Cre&lt;/sup&gt;</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 505406</td><td>克隆 MP1-22E9</td></tr><tr><td>镊子和解剖工具</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>圆底 96 孔板</td><td>Biolegend</td><td>Cat no: 101319</td><td></td></tr><tr><td>活率染料 eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

剖析自然杀伤细胞与伤害感受性神经元之间的相互作用

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

躯体感觉神经元已进化出检测有害刺激并激活防御反射的能力。通过共享通讯机制，伤害感受神经元还能通过调控免疫系统的活性来调节机体防御功能。这些系统间的通讯大多具有适应性，有助于维持稳态，但也可能引发或促进慢性疾病的发生。这两个系统共同进化，使得局部相互作用成为可能，例如存在于初级和次级淋巴组织以及黏膜中的相互作用。近期研究表明，伤害感受器能够直接检测并响应外来抗原、免疫细胞分泌的细胞因子以及微生物。
伤害感受器的激活不仅会导致疼痛过敏和瘙痒，还会降低伤害感受器的放电阈值，从而引起局部神经肽的释放。由伤害感受器外周末梢产生并释放的这些肽类物质能够抑制淋巴细胞的趋化性和极化，调控炎症的定位、持续时间及类型。近期证据表明，感觉神经元与先天免疫细胞之间存在相互作用。 通过 细胞间接触，例如激活自然杀伤（NK）细胞上的2D组（NKG2D）受体。
鉴于自然杀伤细胞（NK细胞）表达多种伤害感受器产生介质的相应受体，伤害感受器可能通过神经肽来调控NK细胞的活性。在此，我们设计了一种共培养方法，用于在体外研究伤害感受神经元与NK细胞之间的相互作用。利用该方法，我们发现腰段伤害感受神经元可降低NK细胞的细胞因子表达。总体而言，这种简化的方法有助于研究肿瘤支配神经元如何调控NK细胞的抗癌功能，以及NK细胞如何参与受损神经元的清除过程。

采用磁珠分选法从同窝对照小鼠（TRPV1wt::DTAfl/wt）脾细胞中分离纯化NK细胞，并用IL-2和IL-15刺激48小时。随后将NK细胞单独培养，或与来自伤害感受性神经元完整（同窝对照；TRPV1wt::DTAfl/wt）或消融（TRPV1cre::DTAfl/wt）小鼠的背根神经节（DRG）神经元共培养。之后，细胞暴露于TRPV1激动剂辣椒素（1 µM）或其溶剂中。共培养24小时后，通过FACS分离NK细胞，并采用流式细胞术对其活化水平进行免疫表型分析（图1A）。
单独培养时，NK细胞表达基础水平的GM-CSF和NKp46。当与来自伤害性感受器完整（TRPV1wt::DTAfl/wt）小鼠的背根神经节（DRG）神经元共培养时，辣椒素刺激降低了NK细胞中GM-CSF的表达。而当与来自伤害性感受器被消融（TRPV1cre:...

伤害感受神经元与自然杀伤细胞在炎症环境中会主动相互作用。通过共培养方法可实现对此类相互作用的研究。

体感神经元已进化出检测有害刺激并激活防御反射的能力。通过共享通讯机制，伤害感受神经元还……

鉴于伤害感受性神经元会分泌多种神经肽，而自然杀伤细胞（NK细胞）表达这些神经肽的受体，我们决定设计一种共培养方法，以研究NK细胞与伤害感受性神经元之间的相互作用。这种简化的研究方法有助于探讨伤害感受性神经元如何调控NK细胞的抗肿瘤功能，同时也可用于研究NK细胞如何调控受损神经元的清除过程。本实验操作将由我实验室前硕士研究生Ali Ahmadi进行演示。开始自然杀伤（NK）细胞的分离与培养时，将小鼠脾脏收集至含有500微升无菌PBS的1.5毫升微量离心管中，然后使用研磨杵充分匀浆脾脏组织。接着，加入1毫升无菌PBS稀释细胞悬液，并通过50微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。最后，用无菌PBS将滤过的匀浆液体积补足至10毫升。使用血细胞计数板对10微升稀释后的匀浆液进行细胞计数。将剩余细胞在500 × g条件下离心5分钟，并弃去上清液。然后将细胞重悬于补充型RPMI 1640培养基中，调整细胞密度至每毫升10的8次方个细胞。使用小鼠NK细胞分离试剂盒通过磁珠法纯化脾脏NK细胞，并通过流式细胞术确认NK细胞纯度。使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后以500 × g离心5分钟，弃去上清液。为刺激沉淀中的NK细胞，将细胞重悬于添加了IL-2和IL-15的RPMI 1640培养基中。在96孔圆底板中以每毫升2×10⁶个NK细胞的密度培养48小时。在NK细胞刺激前24小时，用层粘连蛋白以每孔100 µL的量包被96孔板，并在37°C下孵育45分钟。孵育结束后，移除溶液，并在生物安全柜中让各孔自然晾干。接下来，将已实施安乐死的小鼠俯卧位固定在解剖板上。提起皮肤，沿背部中线切开皮肤。剪断腰骶关节，并用剪刀将骶骨与腰椎分离。然后沿颅侧方向剪开两侧的肌肉和肋骨，直至到达颅底，从而分离脊柱。使用剪刀在枕寰关节处剪断脊柱。接着，去除脊柱上的肌肉和脂肪组织。固定并打开脊柱以取出脊髓，然后才能接触到通过背根与脊髓相连的椎间孔内的背根神经节（DRG）。接着，将分离出的DRG收集到一个含有10毫升冰上预冷的含补充物DMEM培养基的15毫升锥形管中。随后在室温下以200 × g离心5分钟，并弃去上清液。加入250 µL含有1 mg/mL胶原酶IV和2.4 U/mL分散酶II的PBS。将背根神经节（DRG）与胶原酶-分散酶溶液在轻度振荡条件下孵育80分钟。为灭活酶活性，加入5 mL添加了补剂的DMEM培养基，并在200 ×g离心5分钟。离心后，用移液器小心吸除上清液，保留约100 µL上清液以避免细胞意外丢失。随后，向细胞中加入1 mL添加了补剂的DMEM培养基，使用移液器及三支口径依次减小的玻璃巴斯德吸管轻轻吹打，将DRG机械解离为单细胞悬液。在生物安全柜中操作时，将牛血清白蛋白（BSA）用无菌 PBS 稀释至终浓度为 15%，并将一毫升分装液储存于 -20 摄氏度。在 15 毫升锥形管中制备 BSA 梯度时，先加入 2 毫升无菌 PBS，然后缓慢将 1 毫升 15% BSA 溶液加至管底。移液管应轻柔取出，避免破坏梯度。使用P200移液器，将含有神经元的匀浆后神经节悬液沿管壁加入梯度液中。然后将加速度和减速度调至最低，以200 ×g离心12分钟，使含BSA梯度的神经元分离。离心后，用移液器吸除全部上清液，并将细胞重悬于500 µL Neurobasal培养基中。将每微升含10,000个神经元的细胞悬液接种至经层粘连蛋白包被的平底96孔板中，每孔接种一个样本。为了促进神经元的贴附，将96孔板在37摄氏度下孵育过夜。开始共培养时，缓慢移除神经元培养中的Neurobasal培养基。用IL-2和IL-15刺激48小时后，重悬NK细胞，并向神经元培养孔中每孔加入10的5次方个NK细胞。将细胞在添加补充物的 Neurobasal MX 培养基中于 37 摄氏度共培养。48 小时后，用 PBS 收集细胞并洗涤三次，随后在 4 摄氏度下以 500 ×g 离心五分钟。弃去上清液，再于 4 摄氏度下用 1:1,000 稀释的活细胞染料 eFluor 780 染色 15 分钟。按照上述方法洗涤并离心细胞，随后在4摄氏度下用CD 1632处理细胞15分钟，以阻断细胞上的非特异性结合位点，接着用PBS洗涤细胞三次并收集细胞。完成下一轮洗涤和离心后，使用BV421、抗NK-1.1、异硫氰酸荧光素标记的抗NKp46以及藻红蛋白标记的抗GM-CSF抗体对细胞进行染色，染色时间为15分钟。再次用PBS洗涤细胞三次，收集细胞后离心并弃去上清液，然后将细胞重悬于500微升FACS缓冲液中，通过流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析。单独培养时，NK细胞表达基础水平的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和NKp46。当与来自伤害感受器完整小鼠的背根神经节（DRG）神经元共培养时，辣椒素刺激降低了NK细胞GM-CSF的表达。然而，当与来自伤害感受器消融小鼠的DRG神经元共培养时，辣椒素对NK细胞活化无影响。NKp46 水平未受影响。本方案的关键步骤在于背根神经节的解离与分离。其核心在于通过避免产生气泡并使用合适尺寸的移液器，以最大限度保持神经元的活性。实验方案完成后，研究者可采用RNA测序或qPCR检测经FACS纯化的细胞中转录水平的变化，或使用ELISA检测细胞因子或神经肽的分泌情况。这种相互作用表明，NK细胞功能可能受到伤害感受性神经元的调节。此类双向交流可能在从神经损伤、细菌和病毒感染到恶性肿瘤等多种生物过程中发挥重要作用。

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