光呼吸突变体中光合效率的叶绿素荧光分析评估

该方法的目的是利用低浓度CO2筛选来鉴定光呼吸途径中的突变体。本文介绍了一种在低CO2条件下暴露后鉴定干扰光呼吸过程突变体的方法。该方法的优势在于可对幼苗进行高通量筛选，且耗时相对较短。

以下部分将详细介绍种子准备与消毒、植物生长与低 CO2 处理、荧光成像系统的配置、处理样品的量子产率测定、代表性结果及结论。种子准备与消毒：种子准备包括种子吸胀和种子消毒。

需要注意的是，所有这些步骤均在层流罩内进行，以保持无菌条件。所有必需的材料、试剂和培养基均经过高压灭菌。所用的种子品系为 plgg1-1、abcb26 以及 WT 或野生型。

在超净工作台中用无菌水浸泡种子，然后在黑暗条件下于 4 摄氏度进行春化处理两天。在无菌条件下，配制 10 毫升体积分数为 50% 的次氯酸钠消毒液，并加入约 20 微升吐温 20。去除浸泡后种子中的水分，向微量离心管中加入 1 毫升消毒液，在室温下孵育 5 分钟。

用移液器吸除漂白液。用一毫升无菌水冲洗种子以重悬。待种子沉降至底部后，吸除水分。

将种子重悬于无菌的0.1%琼脂糖溶液中。用于种子接种时，采用含1%MS培养基（含维生素）和1%琼脂的基础培养基平板来培养测试突变体。用剃须刀片切去200微升移液器吸头的尖端。

使用移液器将一颗种子放置于每个待测突变体或基因型对应指定方格的中央。此处使用带有 1 cm × 1 cm 网格的方形培养皿。这有助于保持每株幼苗之间的间距一致，避免重叠，对于后续的荧光成像与分析尤为重要。

将种子接种后，用医用胶带围绕培养皿盖子密封，然后将其放入生长培养箱中。植物培养及低浓度 CO2 处理：在 20 摄氏度条件下，以每平方米每秒 120 微摩尔的光照强度进行 8 小时光照，随后在 18 摄氏度下进行 16 小时黑暗处理，持续培养 7 至 9 天。

在接种后的第六天检查植株，以确定其是否已生长到适合成像的大小。接种后第八天，将植株暴露于低 CO2 条件下。将处理组植株置于生长室内的密闭盒子中，光照强度为 200 微摩尔每平方米每秒，持续 12 小时。

低 CO2 条件通过使用一个密闭透明容器构建，容器底部放置 100 克苏打石灰。该容器置于与对照组相同的生长室中。对照组植物在环境 CO2 浓度下，接受 120 微摩尔每平方米每秒的光照，持续 12 小时。

配置荧光成像系统。将测试板置于荧光成像系统中，在固定距离下使测试板中心位于相机正下方。在仪器软件中，进入实时窗口并勾选“闪光”选项，以开启非作用光测量闪光。

点击缩放和对焦工具，直到看到完整且清晰的图像。将EL快门值设为零，并调整灵敏度，使荧光信号处于200至500数字单位范围内。将光度计放置在与调整相机设置时相同的位置。

在实时窗口中，勾选 Super 复选框以启动持续 800 毫秒的饱和脉冲。使用滑块调节 Super 脉冲的相对光强百分比，直至光度计读数为 6,000 至 8,000 微摩尔每平方米每秒。测定处理样品的量子产率。

处理后立即用铝箔将培养板覆盖，暗适应15分钟。去除铝箔，使用脉冲振幅调制式荧光仪测定光系统II的量子产额。然后将幼苗培养板直接置于相机下方，运行我们GitHub仓库中提供的量子产额检测程序。

从 GitHub 下载量子产率实验方案。使用荧光仪软件，点击文件夹图标并导航至文件所在位置，以打开程序文件。点击红色闪电图标，运行量子产率实验方案。

完成实验方案后，进入预分析窗口。通过在培养皿图像上选中每株幼苗的所有像素，将培养皿分割为单个幼苗。单击“背景排除”以去除任何被选中的背景像素，仅保留幼苗区域。

单击“分析”以生成平板图像上每株幼苗的荧光数据。手动调整荧光值范围，使所有平板之间的最小值和最大值保持一致。在“实验”标签页中，单击“导出”，然后选择“数值”。

单击“数值平均”以生成一个文本文件，其中包含每株幼苗的量子产率。打开该文本文件和电子表格进行分析。电子表格包含区域编号、像素大小、Fm、Ft、Fq 和 QY。首先，我们需要将区域编号与其对应的基因型对应起来，即野生型或待测突变体，结果。

以下是野生型和测试突变体在常温空气及低 CO2 条件下筛选所获得的平板原始图像和荧光图像。每个平板均以区域编号标记，并附有相应的荧光读数，即光化学量子产额（quantum yield，QY）。数据以文本文件形式导出，可在电子表格软件中打开进行分析。野生型和突变体经暗适应后的 Fv/Fm 量子产额效率通过箱线图（box and whisker plots）进行可视化展示。

为了检验野生型与待测突变体之间的统计学差异，采用成对T检验，P值小于0.05。在此，我们使用光呼吸突变体品系（其量子产额Fv/Fm降低）作为待测突变体，以验证筛选方法的效率。结果显示，与野生型相比，待测突变体的量子产额效率显著降低。

这表明我们的筛选方法能够利用低CO2条件筛选出光呼吸突变体。结论：使用本实验方案时需注意，拟南芥幼苗应生长至足够大以进行荧光测定，但又不能过大，以免成像时植株相互重叠。建议在幼苗长出第一对真叶时进行成像，以尽量保持叶片大小和叶角度的一致性。

该方案可用于幼苗的高通量筛选。每块培养板的成像过程相对较快，每天有潜力筛选超过 1,000 株幼苗。通过叶绿素荧光分析，我们能够利用低 CO2 筛选条件鉴定出光呼吸突变体，这对于维持光呼吸效率具有重要意义。

该实验方案不仅限于拟南芥，还可用于非生物胁迫响应实验。