基于质谱法鉴定磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白的方法

PIB-MS 是一种用于从细胞和组织中富集内源性磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白的新型技术。该技术通过基于质谱的蛋白质组学方法对这些蛋白进行鉴定和定量。该方法无需外源表达带有标签的磷酸化蛋白磷酸酶，从而避免了可能对蛋白活性或定位造成的干扰。

此外，该方法不使用可能缺乏特异性或无法区分特定同工型的抗体。这种研究PPPM的方法可进行规模调整，适用于从细胞到临床样本的各种样本类型。首先，在室温下以277 ×g离心两分钟，收集细胞沉淀。

吸去培养基，用 5 毫升 PBS 洗涤细胞。按照文本方案中的描述配制裂解缓冲液，并置于冰上保存。向样品中加入 1 毫升预冷的裂解缓冲液，然后通过超声处理裂解样品，每次超声脉冲间隔期间将样品置于冰上。

将裂解液转移至新的1.5毫升离心管中。在4摄氏度下，以21,130 ×g离心超声处理后的样品15分钟。取部分裂解液用于通过二辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay）定量总蛋白浓度。

此步骤对于确保每个样品中蛋白质浓度相等至关重要。对于磷酸化蛋白磷酸酶抑制剂对照，应为每个样品制备两份等蛋白浓度的分装样品。可使用裂解缓冲液稀释样品，使每管样品的蛋白质浓度相等。

向一份等分试样中加入一微摩尔的游离微囊藻毒素-LR，向另一份中加入等体积的DMSO。涡旋混匀样品，并在冰上孵育15分钟。磷酸酶抑制剂磁珠的制备应提前完成，或在样品制备部分所述的孵育步骤期间进行。

每毫克蛋白质使用10微升固态磷酸酶抑制剂磁珠（PIB树脂），并将其加入1.5毫升离心管中。用0.5毫升裂解缓冲液对PIB进行三次洗涤，每次涡旋混匀后，在室温下以376 × g离心30秒。向洗涤后的PIB中加入适量裂解缓冲液，配制成体积分数为50%的PIB缓冲液溶液。

轻轻吹打并旋转移液枪头与悬液，混匀以重悬 PIBs。取 20 µL 悬液转移至含有 0.5 mL 裂解缓冲液的 1.5 mL 离心管中。将离心管在 376 ×g 条件下离心 30 秒。

每个离心管中含有等体积的 PIBs。弃去上清液，仅保留每个管中的固体树脂及最多 50 µL 裂解缓冲液。将裂解物转移至含有 PIBs 的相应标记离心管中。

将裂解液与PIBs在4摄氏度、8 rpm转速下旋转孵育1小时。孵育后，在4摄氏度下以376 × g离心30秒，收集PIBs并弃去上清液。加入0.5毫升裂解缓冲液重悬珠子，并翻转离心管进行洗涤。通过离心收集珠子，弃去上清液。

重复此步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，尽可能去除裂解缓冲液，但不要吸起PIBs。准备含有2% SDS的洗脱缓冲液，并加入相当于PIBs体积四到五倍的洗脱缓冲液。

在65摄氏度孵育一小时，以从磁珠中洗脱磷酸化蛋白磷酸酶。在室温下以376 × g离心30秒。收集洗脱液至另一离心管中，进行质谱分析或蛋白质印迹实验。

为再生PIBs，将PIBs在2% SDS溶液中于室温下以8 rpm转速旋转孵育1小时。用25毫摩尔/升Tris-HCl pH 7.5缓冲液洗涤珠子3至5次，每次洗涤旋转30分钟。将PIBs保存在含叠氮化钠的25毫摩尔/升Tris-HCl pH 7.5缓冲液中。

对于质谱分析，数据过滤和分析的方法各不相同，可由研究人员或核心设施完成。将原始数据与物种特异性的蛋白质组数据库进行比对后，筛选搜索结果，并将其导出为 Microsoft Excel 工作表。对数据进行三重复分析。

对于无标记定量，使用 MS1 峰面积测量来定量数据。为了从头鉴定磷酸戊糖途径（PPP）亚基及其相互作用蛋白，比较微囊藻毒素-LR 抑制组和二甲基亚砜（DMSO）处理组的生物学三重复样本。对数据进行筛选，仅保留那些在三个 DMSO 对照处理样本中至少有两个样本的总肽段数大于一的蛋白质。

为了滤除非特异性结合树脂的蛋白质，需去除在微囊藻毒素-LR处理条件下总肽段数高于任何一种PPP催化亚基的蛋白质。从分析中排除角蛋白、胶原蛋白、核糖体蛋白和异质性核核糖核蛋白等常见污染物。导入数据至Perseus时，必须使用CSV文件。

通过在“加载”部分点击“通用矩阵上传”，将过滤后的数据导入 Perseus。进入“基本转换”部分，选择数据并将转换函数指定为以 2 为底的对数（log₂x），以完成数据转换。进入“缺失值填补”部分，选择“从正态分布填补缺失值”，选中数据并指定计算所需的宽度和下移值，以从正态分布中填补缺失值。

通过进入“标准化”菜单中的“分位数标准化”执行分位数标准化。通过进入“注释行”菜单中的“分类注释行”对数据进行注释。通过进入“检验”菜单中的“两样本检验”，选择相应的组别、待执行的检验方法以及用于多重假设检验校正的方法，以用于截断分析。

该函数还可计算 log 2 比值。通过 PIB 拉下实验，结合对 DMSO 处理和微囊藻毒素-LR 处理样品中蛋白质丰度的无标记定量，鉴定了 HeLa 细胞中的磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白。质谱分析的火山图中，特异性 PIB 结合蛋白以红色显示，催化亚基以蓝色显示，新的候选 PPP 亚基或相互作用蛋白以白色显示。

非特异性结合物以灰色显示。DMSO处理的HeLa细胞裂解液中log2面积的散点图显示，各蛋白丰度高度相关，表明数据具有良好的可重复性。对所有磷酸蛋白磷酸酶亚基及其相互作用蛋白的网络分析表明，这些蛋白是PIB下拉实验中的特异性互作蛋白。

可进行全蛋白质组学分析，并将结果与PIB分析进行比较，以确定PPPome的组成是由PPP的丰度驱动，还是受到翻译后机制的调控。PIB-MS是一种广泛适用的工具，已帮助我们鉴定出在不同条件下PPP表达模式的差异，例如间期与有丝分裂期样本之间的差异，或不同癌细胞系之间的差异。