Name: 一种基于质谱的磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用物鉴定方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学习PIB-MS技术用于富集内源性磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白的方法。该技术利用质谱蛋白质组学进行鉴定和定量，无需外源表达或抗体，适用于细胞和临床样本的蛋白质组学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.N.K. 感谢 NIH R33 CA225458 和 R35 GM119455 项目的支持。我们感谢 Kettenbach 实验室和 Gerber 实验室的有益讨论。

注意：PIB 的制备方法如 Moorhead 等所述，将 1 mg 微囊藻毒素与约 6 mL 葡聚糖凝胶偶联，以制备结合能力高达 5 mg/mL17 的 PIB。
1. 样品制备
注意：PIB-MS 实验通常每种条件起始使用 1 mg 总蛋白。本实验中，使用约 2.5 × 106 个 HeLa 细胞提取出 1 mg 蛋白质。针对实验中使用的每种细胞系或组织，均应进行此计算18。如果样本量有限且无法获得 1 mg 蛋白，可减少上样量，但会导致 PPP 亚基检测灵敏度略有下降。或者，可采用 TMT 标记技术，将所有条件的样本混合于同一样品中，从而提高检测灵敏度，如步骤 9 所示。
<ol>
	<li>收集组织样本或细胞沉淀。对于细胞沉淀，将细胞在室温（RT）下以 277 × g 离心 2 分钟，弃去培养基，并用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。细胞沉淀可在 -80 °C 下保存数月。</li>
	<li>配制裂解缓冲液（500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5% Triton X-100（体积比），5 mM β-甘油磷酸二钠盐五水合物，1:500（体积比）蛋白酶抑制剂混合物 III），并置于冰上。配制足够量以用于所有样品的裂解和洗涤。若每种条件起始蛋白量为 1 mg，则每份样品约需配制 3 mL 缓冲液用于裂解和洗涤。 
	注意：本步骤中所述裂解缓冲液为温和去垢剂溶液，可能不足以溶解不溶性膜蛋白或细胞骨架相关蛋白。可尝试其他去垢剂以提高溶解效果。已测试不同浓度的 NaCl 和 Triton-X-100，上述浓度被证明在背景信号低且磷酸酶亚基结合效率高方面最为理想。</li>
	<li>向样品中加入预冷的裂解缓冲液。若裂解 1 mg 蛋白，使用 1 mL 缓冲液。若样品为冷冻状态，加入裂解缓冲液后将样品置于冰上融化。
	<ol>
		<li>对于细胞样品，通过超声处理进行匀浆，每次超声脉冲之间保持样品在冰上。以 15% 振幅进行三次、每次 15 秒的超声处理。具体参数可能因所用超声仪型号而异（参见 材料表）。</li>
		<li>对于组织样品，先使用 Dounce 组织研磨器研磨组织至液化状态，再按步骤 1.3.1 所述进行超声处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将匀浆后的样品在 4 °C 下以 21,130 × g 离心 15 分钟，以去除不溶性碎片。随后，在不扰动形成的沉淀或附着在管壁上的脂质的情况下，将上清液转移至新管中。如需，可取 100 µL 澄清裂解液作为富集前样品，储存于 -20 °C。务必保持裂解液处于冰上。</li>
	<li>取各样品少量等分试样，按照制造商说明书进行蛋白定量检测（如双辛可宁酸法（BCA）），测定各样品中的总蛋白含量。BCA 检测过程中应确保裂解液始终置于冰上。</li>
	<li>完成 BCA 检测后，将等量蛋白转移至新管中，并用裂解缓冲液稀释，确保每管蛋白浓度一致（例如 1 mg/mL）。若实验需要设置 PPP 抑制剂对照组，则准备两份蛋白含量相同的各样品等分试样，并进入步骤 1.7；若无需 PPP 抑制剂对照组，则跳至步骤 2。确保样品始终置于冰上。 
	注意：在 PIB-MS 分析中，每种实验条件下必须使用相等的蛋白浓度。PPP 抑制剂对照组用于区分与 PIBs 特异性结合的蛋白与非特异性背景结合蛋白。</li>
	<li>对于 PPP 抑制剂对照组，一份样品加入游离 MCLR（1 µM），另一份加入等体积 DMSO 作为对照。轻轻涡旋混匀，冰上孵育 15 分钟。 
	&#8203;注意：MCLR 处理可阻断 PPP 催化亚基的结合，但不影响样品中非特异性结合 PIBs 的蛋白。操作 MCLR 时需谨慎，因其具有毒性。请参阅 材料表 中的相关操作注意事项。</li>
</ol>
2. PIBs 的制备
<ol>
	<li>确定实验所需的PIBs用量。每1 mg蛋白可获得1–3 µg的PPPs及其相互作用蛋白；每个样品至少使用10 µL固相PIBs树脂，以尽量减少珠粒损失。PIBs的结合容量为3–5 mg/mL14,17。</li>
	<li>将适量PIBs转移至1.5 mL离心管中，加入0.5 mL裂解缓冲液，轻轻涡旋混匀，随后在室温下以376 × g离心30秒，重复洗涤3次。每次更换裂解缓冲液时，避免吸头接触并吸走树脂珠粒。</li>
	<li>向洗涤后的PIBs中加入适量裂解缓冲液，配制成50%的PIBs/缓冲液悬浮液（体积比）。轻轻吹打并晃动移液枪头，使PIBs充分重悬于缓冲液中。</li>
	<li>将20 µL上述悬浮液转移至已预先加入0.5 mL裂解缓冲液的新1.5 mL离心管中。管中的裂解缓冲液有助于将珠粒从移液枪头中完全排出。重复此步骤，直至为每个样品准备好数量相等的含等量PIBs的离心管。</li>
	<li>在室温下以376 × g离心30秒。确保所有离心管中含有等量的树脂珠粒。弃去上清液，每管仅保留固相树脂及最多50 µL裂解缓冲液。</li>
</ol>
3. PIBs 与裂解液的孵育
<ol>
	<li>将步骤1.6或步骤1.7中的裂解液转移至已标记的试管中，试管内含有步骤2制备的PIBs。在4 °C条件下，以8 rpm的速度旋转孵育裂解液与PIBs混合物1小时。</li>
</ol>
4. PIBs 的洗涤
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 376 × g 离心 30 秒，使 PIBs 中的磁珠沉淀。弃去上清液，并根据需要保留 100 µL 上清液用于富集后分析。</li>
	<li>用 0.5 mL 裂解缓冲液重悬磁珠，反复倒置混匀（不建议涡旋震荡），在 4 °C 条件下以 376 × g 离心 30 秒使磁珠沉淀，小心移除裂解缓冲液，避免扰动磁珠沉淀。重复此洗涤步骤 3 次。</li>
</ol>
5. 从 PIBs 中洗脱 PPPs
<ol>
	<li>最后一次洗涤后，尽可能吸除裂解缓冲液，注意不要吸起任何PIB。制备含有2% SDS（体积比）的洗脱缓冲液，并加入相当于PIB体积4–5倍的洗脱缓冲液，以从PIB中洗脱PPP。例如，若使用10 µL的PIB，则加入50 µL洗脱缓冲液。将PIB与洗脱缓冲液在65 °C孵育1小时，以充分洗脱PPP。</li>
	<li>洗脱完成后，将离心管在室温下以376 × g离心30秒，收集上清液，并小心吸取洗脱液至新的离心管中，避免转移任何PIB。所得洗脱液可用于Western印迹分析或质谱分析。洗脱液可在-20 °C保存数月。</li>
	<li>若需再生PIB以供后续使用，可在室温下用2% SDS（体积比）溶液旋转孵育珠子1小时（转速8 rpm）。随后用25 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液洗涤3–5次，每次洗涤旋转30分钟。所有洗涤步骤完成后，将PIB保存于含叠氮化钠（0.05% 质量体积比）的25 mM Tris-HCl（pH 7.5）储存缓冲液中。</li>
	<li>通过Western印迹或质谱分析洗脱液。PIB洗脱液的质谱分析方法如下所述。</li>
</ol>
6. 去除去垢剂
注意：可采用多种方法从洗脱液样品中去除去垢剂以用于质谱分析。我们发现，Hughes 等人描述的单管固相增强样品制备法（SP3）效果良好19。
<ol>
	<li>向上一步骤5.2所得50 µL洗脱液中加入0.5 µL SP3磁珠。SP3磁珠的使用比例为10:1（µg:µg），或至少0.5 µg/µL（储存液浓度为50 µg/µL）。轻轻涡旋混合磁珠与洗脱液。</li>
	<li>向磁珠-洗脱液混合物中加入一个洗脱体积的100%乙醇（例如，若使用了50 µL洗脱液，则加入50 µL 100%乙醇）。将样品置于恒温混匀仪中，在24 °C、1000 rpm条件下孵育5分钟。</li>
	<li>为收集全部磁珠，将样品置于磁力架上。待磁珠完全吸附后，弃去上清液，并用0.5 mL 80%乙醇（体积比）洗涤磁珠3次。每次洗涤时，通过涡旋重新悬浮磁珠，再将样品置于磁力架上使磁珠吸附，随后弃去上清液。</li>
	<li>再用0.5 mL 100%乙腈（ACN）洗涤磁珠一次，以彻底去除残留乙醇，并尽可能吸除全部乙腈。&#160;</li>
</ol>
7. 蛋白质的消化
<ol>
	<li>在166 mM HEPES（pH 8.5）中配制胰蛋白酶的1:100稀释液（终浓度为0.004 µg/µL），每管磁珠中加入30 µL该胰蛋白酶溶液，并通过涡旋重悬。</li>
	<li>将SP3-胰蛋白酶磁珠混合物置于恒温混匀仪中，37 °C、1000 rpm孵育5小时，或30 °C过夜孵育。将管子置于磁力架上收集磁珠，并将消化产物转移至新管中。</li>
	<li>对于非标记定量分析，通过加入20%三氟乙酸（TFA）（体积比）使终浓度达到0.2% TFA（体积比）以终止反应。用pH试纸检测各样品pH值是否在2–3之间；若未达到，可逐次少量补加20% TFA直至满足条件。样品在脱盐前必须充分酸化。继续进行第8步。</li>
	<li>若对样品进行TMT标记，则不要进行酸化处理，直接进入第9步。</li>
</ol>
8. 消化产物的脱盐
<ol>
	<li>按照 Rappsilber 等人20所述方法，通过将 C18 树脂填充至 200 µL 质谱兼容溶剂的吸头中，为每个样品制备一个 stage tip。使用钝头针将两片 C18 材料压入针内，并确保其保留在针中。使用细金属推杆将圆片从针中推出，转移至质谱兼容溶剂的吸头中。 
	注意：从本实验方案的此步骤开始，必须使用质谱兼容溶剂的吸头，因为其他移液吸头可能会向样品中浸出可在质谱检测中被识别的化学物质。</li>
	<li>用 30 µL 的 100% 甲醇对每个 stage tip 进行平衡，随后用 30 µL 的 60% 甲醇（体积比），再用 30 µL 的 0.1% 三氟乙酸（体积比）冲洗。使用注射器将每种溶液推过 stage tip。如有需要，可在注射器末端套上透明薄膜以增强注射器与 stage tip 之间的接触。务必确保 stage tip 内的 C18 材料始终保持湿润，切勿干燥。</li>
	<li>将第 7.3 步得到的酸化肽段消化产物加入已标记的 stage tip 中，并使用注射器将其推过 stage tip，注意避免 stage tip 完全干燥。</li>
	<li>用 30 µL 的 0.1% 三氟乙酸（体积比）对每个样品清洗两次。通过向每个 stage tip 中加入 30 µL 的 60% 甲醇（体积比），并用注射器压力将全部液体推出至新的、已标记的离心管中，从而洗脱肽段。这是唯一允许 C18 材料完全干燥的步骤。</li>
	<li>通过真空离心法将每个样品干燥。干燥后的肽段可在 -20°C 下保存数月。样品现已准备好进行无标记质谱分析。仅使用一半样品用于质谱仪分析，另一半保留用于必要时重新进样。确保采用适当的质谱仪分析方法。</li>
</ol>
9. TMT 标记
注意：串联质谱标签标记用于多重样本的定量分析。每瓶0.8 mg的TMT试剂足以标记最多0.8 mg的蛋白质21。在起始蛋白量为1 mg的PIB下拉实验中，可获得1–3 µg的磷酸化蛋白亚基。以下方案适用于最多10 µg的蛋白质，效果最佳。
<ol>
	<li>将一支0.8 mg的TMT试剂用80 µL无水乙腈（ACN）重悬。</li>
	<li>使用不同的TMT标签对第7.4步中的每个样品进行标记，最多可标记18个通道。务必记录每个样品所添加的TMT标签。向肽段消化产物中加入2 µL TMT试剂和2 µL ACN，轻轻涡旋混匀，然后在室温下以376 × g 离心30秒以收集样品，并在室温下孵育1小时以完成标记。</li>
	<li>为检测TMT标记效率，取各标记反应产物1 µL混合于一个含有9 µL液相色谱-质谱级水和1 µL 10%羟胺（体积比）的0.5 mL离心管中，制备标记检测样品，以终止反应。将剩余未淬灭的标记样品置于-80 °C冰箱中保存。在评估标记效率期间，样品可保存数天。</li>
	<li>通过加入30 µL 0.1%三氟乙酸（TFA，体积比）酸化TMT标记检测样品。检查pH值是否在2–3之间。若不在该范围，逐滴加入20% TFA（体积比）直至达到此pH值。随后按照步骤8.1–8.5所述方法通过StageTip进行脱盐处理。</li>
	<li>将TMT标记检测样品上机进行质谱分析，以评估标记效率。在肽段水平上将搜索结果过滤至1%的错误发现率（FDR），并据此确定标记效率21,22。</li>
	<li>完全标记的肽段在其N端及所有赖氨酸残基上均带有TMT试剂。定量各通道TMT报告离子的强度，并比较其总和。当所有肽段中&#62;95%被标记且各通道TMT报告离子的总强度相近时，表明标记充分。 
	注意：除标记不完全外，TMT报告离子总强度的差异也可能源于1 µL检测样品移液不准确；但也可能反映真实的生物学差异，此时所有重复样本应呈现一致的趋势。</li>
	<li>从-80 °C取出未淬灭的样品并解冻。若标记不完全，按前述记录向样品中补加1 µL相应的TMT试剂，孵育1小时后重复TMT标记检测。若样品已完全标记，则继续进行第9.8步。</li>
	<li>标记完全后，向TMT反应体系中加入2 µL 10%羟胺（体积比）以终止反应，室温孵育15分钟。淬灭完成后，样品可在-80 °C保存数月。</li>
	<li>合并所有淬灭后的TMT通道样品，并加入2 µL 20% TFA（体积比）酸化反应体系。检测混合样品的pH值，确保其处于pH 2–3范围内。若未达要求，逐次加入少量20% TFA直至pH达标。此步骤对后续脱盐效果至关重要。</li>
	<li>通过真空离心30分钟去除乙腈（ACN），然后按以下方法对样品进行脱盐处理。</li>
</ol>
10. TMT标记合并样品的脱盐
<ol>
	<li>使用具有适当蛋白载量的SPE C18脱盐板（通常2 mg吸附剂足以满足本应用需求）对合并的TMT试剂进行脱盐。用200 µL的60%甲醇（体积比）和200 µL的10%甲醇/0.1%三氟乙酸（体积比）平衡小孔。</li>
	<li>将第9.10步酸化后的TMT标记肽段加载至脱盐板中。用200 µL的10%甲醇/0.1%三氟乙酸（体积比）洗涤样品孔两次。</li>
	<li>用100 µL的60%甲醇（体积比）洗脱肽段。通过真空离心干燥样品。干燥后的TMT标记样品可在-80 °C下保存数月。</li>
	<li>对于TMT标记样品的质谱分析，注入一半样品，另一半保留以备重新进样所需。 
	&#8203;注意：质谱进样量将根据具体色谱柱、仪器设置和样品类型而有所不同。</li>
</ol>
11. 数据分析
注意：数据过滤和分析方法多种多样，不在本实验方案的范围之内，但以下分析说明旨在针对本方案所产生的特定类型数据提供具体指导。
<ol>
	<li>根据所用样本细胞或组织的来源，将原始质谱数据搜索比对至相应的物种特异性蛋白质组数据库。此处使用 Comet 作为搜索算法23.</li>
	<li>通过调整特定搜索算法的参数，以 1% 的错误发现率（FDR）过滤搜索结果22对于无标记定量，使用MS1峰面积测量值对数据进行定量。对于TMT标记的样本，使用MSn衍生的报告离子强度进行定量。为确保统计学显著性，样本需进行生物学重复三次的分析。</li>
	<li>为了 从头合成 鉴定PPP亚基及其相互作用蛋白时，应比较经MCLR抑制和DMSO处理的三份生物学重复样本。为比较不同条件下或药物处理后的PPP组，需确保每种条件或药物处理均设有三份生物学重复样本。</li>
	<li>筛选数据，仅保留总肽段数满足条件的蛋白质 &#62;在至少两个DMSO对照处理样本中均存在。MCLR竞争并不总是能够完全消除所有催化亚基的结合。此外，某些PPP催化亚基可能会非特异性地结合到Sepharose树脂上。为排除上述可能性，并过滤掉非特异性结合树脂的蛋白质，应去除在MCLR处理条件下总肽段数高于任何PPP催化亚基的蛋白质。</li>
	<li>排除常见污染物，如角蛋白、胶原蛋白、40S 和 60S 核糖体蛋白以及非 PPP 亚基的异质性核核糖核蛋白，不纳入分析14.</li>
	<li>单击将过滤后的数据导入 Perseus 通用矩阵上传 在加载部分24,25. 日志2 通过前往以下步骤转换数据 基础 &#62; 转化，选择数据，并指定转换函数，此处为 log2(x)。</li>
	<li>通过以下步骤从正态分布中填补缺失值： 填补 &#62; 从正态分布替换缺失值，选择数据，并指定用于计算的宽度（默认值 0.3）和向下平移值（默认值 1.8）。通过前往执行分位数标准化 标准化 &#62; 分位数标准化.</li>
	<li>计算对数2 比率及相应条件下的学生t检验p值。首先，通过前往 注释行 &#62; 分类注释行. 通过前往执行 T 检验 测试 &#62; 双样本检验，选择要比较的组别、执行的检验方法以及用于多重假设检验校正的方法，该方法同样用于截断分析。 
	注意：对于 从头合成 鉴定时，若某蛋白在MCLR处理组与DMSO对照组之间的丰度差异具有统计学显著性，且其log2-倍数变化大于任何已知特异性结合的PPP亚基的最小倍数变化。</li>
</ol>

<ol><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li>
<li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Ser%2FThr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li>
<li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+serine%2Fthreonine+phosphatases%3A+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li>
<li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A%3A+A+highly+regulated+family+of+serine%2Fthreonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li>
<li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+promiscuity+to+precision%3A+protein+phosphatases+get+a+makeover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li>
<li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+PP1+toolkit%3A+designed+to+create+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li>
<li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D-networking+by+mitotic+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li>
<li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PP1+binding+code%3A+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li>
<li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li>
<li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li>
<li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li>
<li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755(2013).</li>
<li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li>
<li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li>
<li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+ser%2Fthr+protein+phosphatases%3A+specificity%2C+use+and+common+forms+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li>
<li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li>
<li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li>
<li>Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pot%2C+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMT+labeling+for+the+masses%3A+A+robust+and+cost-efficient%2C+in-solution+labeling+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet%3A+an+open-source+MS%2FMS+sequence+database+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PIB-MS 是一种化学蛋白质组学方法，可用于在单次分析中对来自不同样本来源的PPPome进行定量分析。已有大量研究使用激酶抑制剂珠粒来研究激酶组及其在癌症和其他疾病状态下的变化10,11,12,13。然而，对PPPome的研究仍相对滞后。我们预计该方法能够填补这一空白，并揭示细胞去磷酸化调控的机制。在此，我们证明利用PIB可富集PP1、PP2A、PP4、PP5和PP6的催化组分及非催化组分。我们还能够在多种细胞系、组织类型和生物体中鉴定出新的PPP相互作用候选蛋白。
在PIB-MS实验流程中有若干关键步骤不容忽视，包括设置适当的对照和重复、所有样品间加入等量的蛋白质、样品制备过程中维持非变性条件、样品与PIB孵育以及PIB的洗涤。关于对照和重复，如果目标是鉴定新的PPP亚基及其相互作用蛋白，则每个样品应取一半加入PPP抑制剂，...

蛋白质磷酸化调控大多数细胞过程，包括但不限于DNA损伤应答、生长因子信号传导以及有丝分裂的进程1,2,3。在哺乳动物细胞中，大多数蛋白质在某一时刻会于一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上发生磷酸化，其中磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸约占所有磷酸化位点的98%2,3。尽管激酶在细胞信号传导中的作用已被广泛研究，蛋白磷酸酶（PPPs）在调控动态细胞过程中的功能仍处于逐步揭示之中。
磷酸化动态过程由激酶与磷酸酶之间的动态相互作用所调控。在哺乳动物细胞中，存在超过400种蛋白激酶，可催化丝氨酸/苏氨酸的磷酸化。其中超过90%的位点由磷酸化蛋白磷酸酶（PPPs）去磷酸化，PPPs是一类包含PP1、PP2A、PP2B、PP4-7、PPT和PPZ的小型酶家族。2,3. PP1 和 PP2A 负责细胞内大多数磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸的去磷酸化反应2,3,4激酶与磷酸酶在数量上的显著差异，以及PPP催化亚基缺乏特异性的问题 体外 导致人们认为激酶是磷酸化的主要决定因素2,3然而，多项研究表明，磷酸酶可通过形成多聚体全酶来建立底物特异性5,6,7,8,9例如，PP1 是一种异源二聚体，由一个催化亚基和某一时刻超过150种调节亚基中的一个组成6,7,8相反，PP2A 是一种由支架（A）、调节（B）和催化（C）亚基组成的异源三聚体2,3,9. PP2A 调节亚基有四个不同的家族（B55、B56、PR72 和 striatin），每个家族包含多个基因、剪接变体和不同的定位模式2,3,9PPP 的多聚体特性填补了激酶与 PPP 催化亚基在数量上的差距。然而，这也为研究 PPP 信号转导带来了分析上的挑战。要全面解析 PPP 信号通路，关键在于研究细胞或组织中各种不同的全酶复合物。在人类激酶组研究方面，已取得显著进展，其中采用了称为多重抑制剂 beads 或 kinobeads 的激酶抑制剂 beads 技术，这是一种化学蛋白质组学策略，即将激酶抑制剂固定于 beads 上，再通过质谱技术鉴定富集的激酶及其相互作用分子。10,11,12,13.
我们已建立一种类似的方法用于研究PPP生物学。该技术利用固定了一种非选择性PPP抑制剂——微囊藻毒素-LR（microcystin-LR，简称MCLR）的磁珠，通过亲和捕获PPP催化亚基，这种磁珠被称为磷酸酶抑制剂磁珠（phosphatase inhibitor beads, PIBs）14,15。与其他需要内源性标记或外源表达PPP亚基、可能改变蛋白活性或定位的方法不同，PIB-MS能够在特定时间点或特定处理条件下，富集细胞和组织中的内源性PPP催化亚基、其相关的调节亚基和支架亚基，以及相互作用蛋白（统称为PPP组，PPPome）。MCLR在纳摩尔浓度下即可抑制PP1、PP2A、PP4-6、PPT和PPZ，因此PIBs在富集PPP组方面具有高效性16。该方法可适用于从细胞到临床样本的各类起始材料。本文中，我们详细描述了如何利用PIBs结合质谱分析（PIB-MS）高效捕获、鉴定和定量内源性PPP组及其修饰状态。
<img alt="蛋白质组学工作流程图：样品制备、质谱分析、TMT标记、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：PIB-MS实验方案的可视化概要。 在PIB-MS实验中，样品可来源于多种形式，从细胞到肿瘤组织均可获取。样品采集后进行裂解和均质化处理，随后进行PPP富集。为富集PPP，将裂解液与PIB孵育，可选择性加入或不加入PPP抑制剂（如MCLR）。随后洗涤PIB，并在变性条件下洗脱PPP。通过SP3蛋白质富集去除去垢剂，再进行胰蛋白酶消化和脱盐处理，以制备适用于质谱分析的样品。在质谱分析前，样品可选择性地进行TMT标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
PIB-MS 包括细胞或组织的裂解与澄清、将裂解液与 PIBs 孵育、洗脱，以及通过蛋白质印迹或基于质谱的方法对洗脱液进行分析（图1）。加入游离的 MCLR 可作为对照，以区分特异性结合 PIB 的蛋白与非特异性相互作用的蛋白。对于大多数应用，可采用无标记方法直接鉴定洗脱液中的蛋白质。当需要更精确的定量或鉴定低丰度物种时，可进一步采用串联质谱标签（TMT）标记处理，以提高覆盖度并减少样品投入量。

<table><tbody><tr><td>乙腈（ACN）</td><td>Honeywell</td><td>AH015-4</td><td>注意：ACN 易燃且有毒；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。</td></tr><tr><td>无水乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-100ML</td><td>注意：ACN 易燃且有毒；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>型号 no. 5424</td><td></td></tr><tr><td>β-甘油磷酸二钠盐五水合物</td><td>Acros Organics</td><td>410991000</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>型号 no. 5810 R 15 安培版本</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨器</td><td>Fisherbrand Pellet Pestles</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>Empore 固相萃取盘，C18</td><td>CDS Analytical</td><td>76333-132</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>关键：其他类型的离心管可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。</td></tr><tr><td>Eppendorf 管，2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>关键：其他类型的离心管可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。</td></tr><tr><td>固相萃取板多通道装置</td><td>Waters</td><td>WAT097944</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管，50 mL</td><td>VWR</td><td>21008</td><td></td></tr><tr><td>通用钝头针和推杆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用磁性分离架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH3028</td><td>注意：HCl 具有腐蚀性；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。</td></tr><tr><td>50%（质量/体积）羟胺溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>65 &amp;deg;C 恒温培养箱</td><td>VWR</td><td>型号 no. 1380FM</td><td></td></tr><tr><td>Koptec 纯乙醇，200 证明</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>用于高效液相色谱的甲醇（MeOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-4L-R</td><td>注意：MeOH 易燃且有毒；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。</td></tr><tr><td>微囊藻毒素 LR（MCLR）</td><td>Cayman Chemical</td><td>10007188</td><td>注意：MCLR 有毒；操作时需佩戴手套，避免皮肤接触。</td></tr><tr><td>PBS，1&amp;times;，不含钙和镁，pH 7.4 &amp;plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>&amp;nbsp;21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸，例如 MilliporeSigma MColorpHast pH 试纸和指示纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1095310001</td><td></td></tr><tr><td>PIBs</td><td></td><td></td><td>有关 PIBs 的制备方案，请参见 Moorhead 等，2007。</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，10 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491504</td><td>关键：其他类型的吸头可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。</td></tr><tr><td>移液器吸头，1000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491555</td><td>关键：其他类型的吸头可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。</td></tr><tr><td>移液器吸头，200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>22491539</td><td>关键：其他类型的吸头可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。</td></tr><tr><td>塑料注射器，10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物 III</td><td>Research Products International</td><td>P50700-1</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 杂合四极杆-Orbitrap 质谱仪、Orbitrap Fusion、Orbitrap Fusion Lumos 或 Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冷型台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>型号 no. 5424 R</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪（Labquake 摇床旋转器）</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>8 rpm 转速</td></tr><tr><td>样品收集板，96 孔，1 mL</td><td>Waters</td><td>WAT058957</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1311-1</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0299-1</td><td>注意：叠氮化钠具有爆炸性和毒性；操作时需佩戴手套，在化学通风橱中进行，并避免与金属接触。</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Chemical</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪（Branson 数字超声波破碎仪）</td><td></td><td>型号 no. SFX 250</td><td></td></tr><tr><td>SPE C18 脱盐板</td><td>Waters</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBeads 磁性羧基修饰微粒（SP3 珠）</td><td>Cytiva</td><td>6.51521E+13</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>型号 no. 5350</td><td></td></tr><tr><td>TMT10plex 同重同位素标记试剂组及 TMT11-131C 标记试剂，每种标签 3 &amp;times; 0.8 mg</td><td>ThermoFisher</td><td>A37725</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Honeywell</td><td>T6508-25ML</td><td>注意：TFA 具有腐蚀性，接触皮肤会引起刺激。操作时需佩戴手套和眼部防护装备，并在化学通风橱中进行。</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪及冷阱</td><td>Thermo Scientific</td><td>型号 nos. SpeedVac SPD120 和 RVT5105</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器（Vortex-Genie 2）</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液相色谱-质谱用水</td><td>Honeywell</td><td>LC365-4</td><td></td></tr></tbody></table>

基于质谱法鉴定磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白的方法

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

大多数细胞过程受到蛋白质磷酸化的动态调控。超过四分之三的蛋白质会发生磷酸化，而磷酸蛋白磷酸酶（PPPs）介导了细胞内90%以上的丝氨酸/苏氨酸去磷酸化反应。蛋白质磷酸化失调已被证实与多种疾病的病理生理过程相关，包括癌症和神经退行性疾病。尽管PPPs具有广泛的功能，但调控PPPs的分子机制以及由PPPs所调控的下游通路仍缺乏充分表征。本文介绍了一种名为磷酸酶抑制剂珠粒结合质谱技术（PIB-MS）的蛋白质组学方法，可在仅12小时之内，利用任何细胞系或组织样本，实现对PPPs及其翻译后修饰和相互作用蛋白（统称为PPP组）的鉴定与定量。PIB-MS采用一种非选择性的PPP抑制剂——微囊藻毒素-LR（MCLR），将其固定于Sepharose珠粒上，以捕获并富集内源性PPPs及其相关蛋白。该方法无需外源表达带标签的PPPs，也不依赖特异性抗体。PIB-MS为研究进化上保守的PPPs提供了一种创新手段，并有助于拓展当前对去磷酸化信号通路的认知。

<img alt="磷酸酶相互作用分析，磷酸酶抑制剂微珠示意图，LC-MS/MS，数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：特异性 PIB 结合物的鉴定。（A）多种组织类型或细胞可通过 PIB-MS 进行分析。HeLa 细胞以生物学三复孔进行实验，分别用 DMSO 或 PPP 抑制剂 MCLR 处理后，与 PIBs 孵育，并通过 LC-MS/MS 进行分析。（B）DMSO 和 MCLR 处理的 HeLa 细胞裂解液中 PIB-MS 分析的火山图，特异性 PIB 结合物以红色显示。PPP 催化亚基标注并以蓝色显示。新的候选 PPP 亚基或相互作用蛋...

本文介绍了一种从细胞和组织中富集内源性磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白，并通过基于质谱的蛋白质组学方法对其进行鉴定和定量的实验方案。

大多数细胞过程由动态的蛋白质磷酸化所调控。超过四分之三的蛋白质可被磷酸化，而磷酸化蛋白……

PIB-MS 是一种用于从细胞和组织中富集内源性磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白的新型技术。该技术通过基于质谱的蛋白质组学方法对这些蛋白进行鉴定和定量。该方法无需外源表达带有标签的磷酸化蛋白磷酸酶，从而避免了可能对蛋白活性或定位造成的干扰。此外，该方法不使用可能缺乏特异性或无法区分特定同工型的抗体。这种研究PPPM的方法可进行规模调整，适用于从细胞到临床样本的各种样本类型。首先，在室温下以277 ×g离心两分钟，收集细胞沉淀。吸去培养基，用 5 毫升 PBS 洗涤细胞。按照文本方案中的描述配制裂解缓冲液，并置于冰上保存。向样品中加入 1 毫升预冷的裂解缓冲液，然后通过超声处理裂解样品，每次超声脉冲间隔期间将样品置于冰上。将裂解液转移至新的1.5毫升离心管中。在4摄氏度下，以21,130 ×g离心超声处理后的样品15分钟。取部分裂解液用于通过二辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay）定量总蛋白浓度。此步骤对于确保每个样品中蛋白质浓度相等至关重要。对于磷酸化蛋白磷酸酶抑制剂对照，应为每个样品制备两份等蛋白浓度的分装样品。可使用裂解缓冲液稀释样品，使每管样品的蛋白质浓度相等。向一份等分试样中加入一微摩尔的游离微囊藻毒素-LR，向另一份中加入等体积的DMSO。涡旋混匀样品，并在冰上孵育15分钟。磷酸酶抑制剂磁珠的制备应提前完成，或在样品制备部分所述的孵育步骤期间进行。每毫克蛋白质使用10微升固态磷酸酶抑制剂磁珠（PIB树脂），并将其加入1.5毫升离心管中。用0.5毫升裂解缓冲液对PIB进行三次洗涤，每次涡旋混匀后，在室温下以376 × g离心30秒。向洗涤后的PIB中加入适量裂解缓冲液，配制成体积分数为50%的PIB缓冲液溶液。轻轻吹打并旋转移液枪头与悬液，混匀以重悬 PIBs。取 20 µL 悬液转移至含有 0.5 mL 裂解缓冲液的 1.5 mL 离心管中。将离心管在 376 ×g 条件下离心 30 秒。每个离心管中含有等体积的 PIBs。弃去上清液，仅保留每个管中的固体树脂及最多 50 µL 裂解缓冲液。将裂解物转移至含有 PIBs 的相应标记离心管中。将裂解液与PIBs在4摄氏度、8 rpm转速下旋转孵育1小时。孵育后，在4摄氏度下以376 × g离心30秒，收集PIBs并弃去上清液。加入0.5毫升裂解缓冲液重悬珠子，并翻转离心管进行洗涤。通过离心收集珠子，弃去上清液。重复此步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，尽可能去除裂解缓冲液，但不要吸起PIBs。准备含有2% SDS的洗脱缓冲液，并加入相当于PIBs体积四到五倍的洗脱缓冲液。在65摄氏度孵育一小时，以从磁珠中洗脱磷酸化蛋白磷酸酶。在室温下以376 × g离心30秒。收集洗脱液至另一离心管中，进行质谱分析或蛋白质印迹实验。为再生PIBs，将PIBs在2% SDS溶液中于室温下以8 rpm转速旋转孵育1小时。用25毫摩尔/升Tris-HCl pH 7.5缓冲液洗涤珠子3至5次，每次洗涤旋转30分钟。将PIBs保存在含叠氮化钠的25毫摩尔/升Tris-HCl pH 7.5缓冲液中。对于质谱分析，数据过滤和分析的方法各不相同，可由研究人员或核心设施完成。将原始数据与物种特异性的蛋白质组数据库进行比对后，筛选搜索结果，并将其导出为 Microsoft Excel 工作表。对数据进行三重复分析。对于无标记定量，使用 MS1 峰面积测量来定量数据。为了从头鉴定磷酸戊糖途径（PPP）亚基及其相互作用蛋白，比较微囊藻毒素-LR 抑制组和二甲基亚砜（DMSO）处理组的生物学三重复样本。对数据进行筛选，仅保留那些在三个 DMSO 对照处理样本中至少有两个样本的总肽段数大于一的蛋白质。为了滤除非特异性结合树脂的蛋白质，需去除在微囊藻毒素-LR处理条件下总肽段数高于任何一种PPP催化亚基的蛋白质。从分析中排除角蛋白、胶原蛋白、核糖体蛋白和异质性核核糖核蛋白等常见污染物。导入数据至Perseus时，必须使用CSV文件。通过在“加载”部分点击“通用矩阵上传”，将过滤后的数据导入 Perseus。进入“基本转换”部分，选择数据并将转换函数指定为以 2 为底的对数（log₂x），以完成数据转换。进入“缺失值填补”部分，选择“从正态分布填补缺失值”，选中数据并指定计算所需的宽度和下移值，以从正态分布中填补缺失值。通过进入“标准化”菜单中的“分位数标准化”执行分位数标准化。通过进入“注释行”菜单中的“分类注释行”对数据进行注释。通过进入“检验”菜单中的“两样本检验”，选择相应的组别、待执行的检验方法以及用于多重假设检验校正的方法，以用于截断分析。该函数还可计算 log 2 比值。通过 PIB 拉下实验，结合对 DMSO 处理和微囊藻毒素-LR 处理样品中蛋白质丰度的无标记定量，鉴定了 HeLa 细胞中的磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白。质谱分析的火山图中，特异性 PIB 结合蛋白以红色显示，催化亚基以蓝色显示，新的候选 PPP 亚基或相互作用蛋白以白色显示。非特异性结合物以灰色显示。DMSO处理的HeLa细胞裂解液中log2面积的散点图显示，各蛋白丰度高度相关，表明数据具有良好的可重复性。对所有磷酸蛋白磷酸酶亚基及其相互作用蛋白的网络分析表明，这些蛋白是PIB下拉实验中的特异性互作蛋白。可进行全蛋白质组学分析，并将结果与PIB分析进行比较，以确定PPPome的组成是由PPP的丰度驱动，还是受到翻译后机制的调控。PIB-MS是一种广泛适用的工具，已帮助我们鉴定出在不同条件下PPP表达模式的差异，例如间期与有丝分裂期样本之间的差异，或不同癌细胞系之间的差异。

a-mass-spectrometry-based-approach-to-identify-phosphoprotein

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

一种基于质谱的磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用物鉴定方法

利用低温裂解、尿素溶解、HILIC分级和IMAC富集磷酸化肽段的定量磷酸化实验方案描述。...

脂肪酸刺激下的定量磷酸化蛋白质组学 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文介绍了一种植物蛋白质复合物的纯化与表征实验方案。我们通过免疫沉淀复合物中的单一蛋白质，从而鉴定其翻译后修饰及其相互作用蛋白伙伴。...

植物蛋白质复合物翻译后修饰的鉴定

蛋白质磷酸化是细胞解读和响应胞外环境信息的核心机制。本文介绍一种高通量筛选方案，利用从哺乳动物细胞中纯化的激酶，快速鉴定能够磷酸化特定底物（或底物群）的激酶。...

利用高通量筛选鉴定激酶-底物配对

肽竞争实验在多种分子和免疫学实验中被广泛应用。本文描述了一种详细的肽竞争实验方法 体外...

寡肽竞争法测定磷酸化位点

本方案描述了一种从前列腺癌细胞系或组织中提取并富集磷酸化肽段以进行磷酸化蛋白质组分析的实验方法 通过...

磷酸化肽段富集联合非标记定量质谱法研究前列腺癌磷酸化蛋白质组

本文介绍了一种共免疫沉淀及磁珠上酶活性检测的实验方案，可同时研究质膜受体特定蛋白结构域在酶募集和酶活性中的作用。...

研究受体与酶之间功能相互作用的共免疫沉淀实验

我们采用严谨的生化方法表征了一种新的激酶蛋白：利用特异性抗体在不同细胞系和组织中进行蛋白质印迹分析，通过共免疫沉淀实验检测其相互作用，通过蛋白质印迹结合磷酸化特异性抗体以及γ[32P]...

利用稳健的生化方法对一种新型激酶蛋白进行分子水平表征

本方案重点在于鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。该方法采用亲和层析技术，将生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇通过链霉亲和素固定于琼脂糖或磁珠上。通过蛋白质印迹（Western...

通过亲和层析联合蛋白质印迹或质谱法鉴定肌醇磷酸或磷脂酰肌醇相互作用蛋白

本方案描述了利用改进的单分子下拉（SiMPull）实验对蛋白质磷酸化进行定量的样品制备与数据分析方法。...

一种优化的单分子下拉检测法用于蛋白质磷酸化定量

一种用于人胰腺组织中N-糖肽和磷酸化肽同步分析的旋转尖端富集策略

学习PIB-MS技术用于富集内源性磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白的方法。该技术利用质谱蛋白质组学进行鉴定和定量，无需外源表达或抗体，适用于细胞和临床样本的蛋白质组学研究。

基于质谱法鉴定磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白的方法

探索更多视频