使用多种荧光染色和组织清除方法以3D模式展示毛茸茸和光滑的皮肤神经支配
2022年5月20日
组织切片的厚度限制了皮肤神经支配的形态学研究。本方案描述了一种独特的组织清除技术，用于在共聚焦显微镜下可视化300μm厚组织切片中的皮肤神经纤维。
该方案提供了一种使用共聚焦显微镜观察同步部分的可行方法，可以确保神经纤维观察的精度。简单易用的组织清洁方案是这种技术的主要优点。组织清洁过程非常高效，大约需要30分钟到一个小时。
如文本手稿中所述，对安乐死的大鼠进行灌注。使用手术刀从后爪上取下背部和鞋底的皮肤。对于需要冷冻切片的样品，将组织从4%的醛中固定在0.1摩尔PB中两小时。
洗涤后，将皮肤组织嵌入37摄氏度的2%琼脂糖中，并将其放入冰盒中冷却。用冰水将安装的组织固定在振动微调上，并在横向方向上以500微米的厚度将其切片。切片后，从切片中取出琼脂糖并将其储存在具有1x PBS的六孔板中。
将组织切片在2%曲肽X-100的溶液中在1x PBS中以4摄氏度孵育过夜。将组织切片放入封闭缓冲液中，并在振荡器上以每分钟72次旋转，在四摄氏度下旋转过夜。将组织切片转移到含有小鼠单克隆抗CGRP和绵羊多克隆抗LYVE-1抗体的一抗的溶液中，在微量离心管中的稀释缓冲液中。
然后在摇床上以四摄氏度旋转两天。在室温下用洗涤缓冲液洗涤组织切片两次，然后在洗涤缓冲液中以四摄氏度将其保持在振荡器上过夜。第二天，将组织切片转移到微量离心管中含有二抗的混合溶液中，并在振荡器上以每分钟72转的速度在四摄氏度下旋转五小时。
在室温下用洗涤缓冲液在六孔板中洗涤组织切片两次，持续一小时。将组织切片保持在振荡器上的洗涤缓冲液中，在四摄氏度下过夜。将组织切片转移到组织清除试剂中，并在室温下在振荡器上以每分钟60转的速度轻轻旋转一小时。
将透明组织安装在载玻片上，然后用垫片圈住组织，并用新鲜的组织清除试剂和盖玻片粘住间隙。3D模式表明CGRP阳性神经纤维通过皮下组织和真皮到达表皮。这些神经纤维在皮下组织中成束运行，在真皮内分支并终止于表皮。
相反，阳性血管中的鬼臼蛋白和LYVE-1阳性淋巴管分布在皮下组织和真皮中。通常，CGRP阳性神经纤维平行或包围血管和淋巴管，在毛茸茸和光滑的皮肤中形成3D网络。使用常规方法，虽然神经纤维血管和淋巴管在薄片中用CGRP鬼笔环蛋白和LYVE-1清楚地标记，但这些结构的观察受到切片厚度的限制，无法完全观察到。
在厚度为30 μm的切片中，CGRP阳性神经纤维表面积的毛茸茸的皮肤和光滑的皮肤之间没有差异。在300微米厚的组织切片中，与毛茸茸的皮肤相比，松弛皮肤CGRP正神经纤维的表面积显著增加。在抗体孵育后使用具有高渗透压的清洁缓冲液非常重要。
几次，免疫荧光染色所需的清洁时间是必要的。按照这个程序，我们认为有可能染色和观察其他组织和器官的六个部分也存在。这种技术可以帮助神经科学研究人员了解神经纤维的表面积和状态。
它还有助于我们观察组织和器官的创新。
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概述
本研究提出了一种新的组织清除技术，用于通过共聚焦显微镜对厚300 µm组织切片中的皮肤神经纤维进行可视化。该方法增强了皮肤神经内分泌的形态学研究，解决了传统薄切片的局限性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 组织成像
- 共聚焦显微镜
背景
- 研究皮肤神经内分泌对于理解感觉通路至关重要。
- 传统方法受到组织切片薄度的限制。
- 在较厚切片中可视化神经纤维可以提供更深入的洞察。
- 该方法旨在提高成像精度和效率。
研究目的
- 开发并验证厚皮肤切片的组织清除技术。
- 促进神经纤维及其与血管和淋巴管的关系的观察。
- 提供可适用于研究其他组织和器官的方法。
使用的方法
- 利用共聚焦显微镜对清除后的组织切片中的神经纤维进行可视化。
- 生物模型包括处死的大鼠，特别观察背部和后爪的皮肤。
- 关键步骤包括组织灌流、嵌入、抗体染色和组织清除。
- 整个清洁和成像协议通常需要30分钟到1小时。
主要结果
- 清除技术成功地揭示了CGRP阳性神经纤维在皮肤中形成3D网络。
- 结果表明毛发和无毛皮肤之间神经纤维分布存在显著差异。
- 该方法允许详细观察与血管和淋巴管的结构关系。
- 发现CGRP阳性纤维平行于或包围血管和淋巴管。
结论
- 该技术增强了对皮肤神经内分泌进行全面可视化和研究的能力。
- 改进的可视化可能为神经生物学机制提供有价值的洞察。
- 潜在应用扩展到各种组织，促进更广泛的神经科学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Three-dimensional visualization of skin innervation using thick tissue sections and multiplex fluorescent staining addresses a critical gap in mapping peripheral nerve architecture. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling comprehensive analysis of nerve, blood, and lymphatic vessel interactions in disease-relevant skin models. The method supports translational continuity for neurobiology and dermatology-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed mapping of sensory nerve fiber distribution in both hairy and glabrous skin.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships between nerves and vasculature.
- Improves predictive confidence for target validation in peripheral nervous system research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated 3D skin models for downstream phenotypic screening.
- Enhances assay reproducibility by standardizing tissue clearing and staining protocols.
- Provides quantitative outputs on nerve fiber surface area and network complexity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling both hairy and glabrous skin innervation.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neurocutaneous targets.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing structural biomarkers in skin tissue.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on nerve-vasculature interactions in skin.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D readouts for assay development.
- Analytics: Provides surface area measurements and network mapping for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment in disease-relevant skin models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other tissues and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in nerve mapping.
- Operational Value: Streamlines tissue processing with efficient clearing and staining workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust 3D data for target evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous and dermatological programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and multiplex immunofluorescence.
- Demands access to tissue clearing reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining and clearing protocols.
- Adaptable to various tissue types with protocol optimization.
- Dependent on antibody quality and clearing efficiency for optimal results.
