使用 SCAD 检测法可视化瘢痕形成过程 - 一种 原位之外 皮肤瘢痕形成检测

既往使用的体外或离体模型缺乏皮肤组织中的真皮细胞成分及其复杂性。这种原位SCAD检测法克服了上述局限，能够在受伤动物体外研究瘢痕的形成过程。SCAD检测法可实现对成纤维细胞迁移及皮肤微环境中瘢痕形成的可视化观察。

该方法可用于筛选激活剂或抑制剂文库，以解析瘢痕形成的作用机制。利用SCAD模型对平面文库进行高通量筛选，有助于理解伤口修复过程中涉及的基本生物学过程及分子通路。SCAD检测方法操作简便，可直接使用皮肤外植体进行。

为了获得一致的瘢痕模型，建议选用出生后第零天或第一天的皮肤。处死出生后第零天或第一天的新生幼鼠后，使用无菌外科手术刀小心地切取1.5 cm × 1.5 cm的全层背部皮肤，直至骨骼肌层。用无菌弯头镊子剥离皮肤，确保浅筋膜完整地附着于下方的肉膜肌（panniculus carnosus muscle）。

用 50 至 100 毫升冷的 DMEM F-12 培养基冲洗切除的组织，以去除污染的血液。随后，用 Hanks 平衡盐溶液洗涤组织，以维持组织和细胞的活性。将皮肤表层筋膜朝上，倒置于含有 DMEM F-12 培养基的 10 厘米培养皿中。

然后，使用一次性2毫米活检打孔器，切除全层圆形皮肤组织以制备结痂组织，确保浅筋膜完整，并连同下方的肉膜肌（panniculus carnosus）一起保留至表皮层。向96孔板的每个孔中加入200 µL新鲜的不含酚红的DMEM F-12完全培养基。用无菌镊子将单个结痂组织倒置转移至96孔板的孔中，并使其完全浸没于培养基中。

将培养板转移至在标准条件下维持的细胞培养孵育箱中。在培养的第2天和第4天，移除培养基，每孔保留10微升，并加入新鲜预热的DMEM F-12完全培养基以及处理化合物，以维持细胞和组织的持续存活条件。对于SCADs的活体成像，取30毫升PBS，在玻璃瓶中通过微波加热制备2%至3%的低熔点琼脂糖溶液。

煮沸后，立即将瓶子转移至40摄氏度水浴中冷却液体琼脂糖溶液。接着，将伴有筋膜或瘢痕面朝上的SCAD组织转移至35毫米培养皿中央。然后使用1000微升移液器枪头，缓慢将40摄氏度的液体琼脂糖倾倒在组织上，在室温下包埋SCAD组织。

琼脂糖在两分钟内聚合。聚合后，加入2 mL预热的DMEM F-12完全培养基。然后使用共聚焦显微镜或双光子显微镜（显微镜配备文中所述的合适孵育系统），采集第0天至第1天的延时图像。

进行组织收获时，在相应时间点用无菌 PBS 更换培养基以洗涤组织。使用无菌镊子将每个 SCAD 转移至含有 500 微升 2% 多聚甲醛的 1.5 毫升微量离心管中，在 4 摄氏度下固定组织过夜。次日，用 PBS 洗涤组织三次，随后按照文本稿件中的描述进行二维或三维免疫荧光染色。

此处展示了第0天和第5天SCAD的代表性整体亮场图像。对组织切片进行垂直切面的Masson三色染色，揭示了第0天和第5天瘢痕核心处组织纤维化、组织收缩以及细胞外基质积聚的特征。同时展示了第0天和第5天SCAD的免疫荧光染色结果。

在早期和晚期瘢痕中，嵌入的阳性成纤维细胞显示为绿色，嵌入的阴性成纤维细胞显示为红色。为了进行三维成像，将组织包埋于琼脂糖溶液中，并覆盖PB SGT。代表性图像显示N-钙黏蛋白在第5天SCAD瘢痕部位的特异性定位。

配备孵育室的三维延时成像系统展示了成纤维细胞群在前12小时或瘢痕发育早期阶段迁移的初始事件。此处展示了在瘢痕形成过程中对单个成纤维细胞进行追踪所得到的细胞运动轨迹的图示。必须将SCAD组织倒置放入培养板的孔中，使筋膜朝上。

若不这样做，将导致迁移模式出现不可避免的差异。该方法可用于通过化学调节剂、中和抗体或病毒方法处理或培养来检测真皮层。这有助于在多种医学条件下评估病理性纤维化反应。

我们展示了连接蛋白-43和N-钙黏蛋白在伤口愈合过程中参与筋膜动员的关键分子作用。SCAD方法有助于识别抑制瘢痕形成和纤维化的新治疗策略。