Name: 直接测量重组活性微管束内的力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解如何利用光镊与全内反射荧光显微镜技术直接测量重组微管束内的力。该方法可精确量化蛋白质相互作用产生的力，为细胞骨架力学和发育病理生物学研究提供重要见解。

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作者希望感谢以下资助的支持：R21 AG067436（资助对象：JP 和 SF）、T32 AG057464（资助对象：ET）以及伦斯勒理工学院理学院启动资金（资助对象：SF）。

作者无任何利益冲突需要披露。

多种细胞类型利用微管网络来完成大量本质上具有机械性质的任务。为了阐明细胞在健康和疾病状态下的功能，关键在于理解这些微米尺度的网络是如何由共同构建它们的纳米级蛋白质进行组织和调控的。诸如光镊等生物物理工具非常适合在该尺度上研究关键蛋白质的力化学特性。鉴于微管网络功能的多样性，研究人员已探索了多种采用光镊的复杂实验构型，包括对微管末端动力学的力依赖性分析67,68、着丝粒组分产生力学力的研究69,70,71，以及利用双光束哑铃陷阱构型探测微管丝状结构的力学特性72,73。在本实验方案中，我们描述了重建微管网络基本结构模式（如微管束）的新方法，并应用单分子荧光显微镜和光镊等生物物理工具，以获取有关细胞功能的关键信息。
...

细胞利用微管网络执行多种机械任务，从囊泡运输1,2,3到有丝分裂过程中的染色体分离4,5,6。许多与微管相互作用的蛋白质，例如分子马达蛋白驱动蛋白（kinesin）和动力蛋白（dynein），能够产生作用力，并受到机械负荷的调控。为了更深入地理解这些关键分子的功能机制，研究人员已采用单分子生物物理方法，如光镊技术和全内反射荧光显微镜（TIRF），直接监测单个蛋白质的关键参数，包括无负载步进速率、持续运动性以及力-速度关系。最常用的实验构型是将马达蛋白直接连接到捕获微球上，微球的球形几何形状和尺寸可模拟由马达驱动运输的囊泡。已有大量驱动蛋白家族成员，包括kinesin-17,8,9、kinesin-210,11,12、kinesin-313,14,15,16、kinesin-517,18、kinesin-819,20，以及动力蛋白及其复合物21,22,23,24,25，通过这些方法得到了研究。
然而，在许多细胞过程中，马达蛋白和非马达蛋白均利用微管作为轨道和货物26,27。此外，在微管纤维被交联成更高级束状结构的这些情况下，这些蛋白质以复合体形式发挥作用，而非单个独立单元。例如，在分裂的体细胞中，致密的纤维网络可自我组织形成有丝分裂纺锤体装置28,29,30。纺锤体的极间微管网络具有高度动态性，其结构主要表现为负端指向纺锤体两极，正端则在纺锤体赤道区域附近相互重叠。纺锤体内的纤维通过马达蛋白（如 kinesin-531,32,33、kinesin-1234,35,36 和 kinesin-1437,38,39）或非马达蛋白（如 PRC140,41,42,43 或 NuMA44,45,46）进行交联。在诸如极向流动、中期染色体居中调控或后期染色体分离等过程中，这些纤维经常发生移动或承受机械应力47,48,49,50,51,52。因此，有丝分裂过程中微米尺度纺锤体结构的完整性，依赖于该相互作用纤维网络所产生的推力与拉力之间精细调控的平衡。然而，用于探究这种力学调控机制并阐明蛋白质复合体如何协同作用以协调微管运动、产生正确组装纺锤体所需作用力的工具，直到最近才得以发展，我们目前才刚刚开始理解定义动态微管网络的生物物理规律。
本文的目标是展示重建交联微管对所需的步骤 体外，将这些束固定在一种显微镜腔室中，该腔室可同时实现对微管和交联蛋白的荧光成像以及纳米级力的测量，并对这些数据进行稳健处理。我们详细描述了稳定聚合荧光标记微管所需的步骤、显微镜盖玻片的制备、用于光镊实验的聚苯乙烯微球的准备，以及构建能够保持其完整性的交联丝状网络的方法 体内 在允许直接进行生物物理操控的同时保持其功能特性。

<table><tbody><tr><td>10W 掺镱光纤激光器，1064nm</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td></td></tr><tr><td>适用于TIRF应用的405/488/561/640nm四波段激光组合</td><td>Chroma</td><td>TRF89901v2</td><td></td></tr><tr><td>6x His标签抗体，生物素偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>#MA1-21315-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>丙酮，HPLC级</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-608-395</td><td></td></tr><tr><td>牛乳α-酪蛋白</td><td>Sigma</td><td>1002484390</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶（Benzonase）</td><td>Novagen</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>生物素-PEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>NC0479433</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Rosetta感受态细胞</td><td>Millipore Sigma</td><td>71-400-3</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶（Catalase）</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>190311</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo 100X/1.49NA油浸TIRF物镜</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素（Chloramphenicol）</td><td>ACROS Organics</td><td>227920250</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片迷你架，适用于8个盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td></td></tr><tr><td>精密任务擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>无水葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3501</td><td></td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Ecoline浸入式恒温器E100配003浴槽</td><td>LAUDA-Brinkmann</td><td>27709</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Corporation</td><td>32462-25GM</td><td></td></tr><tr><td>FIJI / Image J</td><td>https://fiji.sc/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>磨砂载玻片</td><td>Corning</td><td>12-553-10</td><td>75mm×25mm，厚度0.9-1.1mm</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>195196</td><td>Ⅶ型，不含额外氧气</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>JBS-NU-405S</td><td>可在-20 &amp;deg;C下保存数月，在-80 &amp;deg;C下可保存长达一年</td></tr><tr><td>Gold Seal盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>咪唑（Imidazole）</td><td>Fisher Scientific</td><td>03196-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>实验室干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>999320237</td><td>190mm板尺寸</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KIF5A K439（氨基酸：1-439）-6His</td><td>Gilbert Lab, RPI</td><td>N/A</td><td>doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182</td></tr><tr><td>Kimwipe擦拭纸</td><td>Kimberley Clark</td><td>Z188956</td><td>无尘纸</td></tr><tr><td>浸油，B型</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>LuNA激光发射装置（四通道：405、488、561、640nm）</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶（Lysozyme）</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>100834</td><td></td></tr><tr><td>四水合乙酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>MPEG-SVA 分子量5000</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>NC0107576</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素（Neutravadin）</td><td>Invitrogen</td><td>PI31000</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Nikon LuN4激光器</td></tr><tr><td>Ni-NTA树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA&lt;br/&gt; GAACTTTCAAAGGC</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA&lt;br/&gt; ACTCAGAATAGGTG</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>开放式厚壁聚碳酸酯管，0.2 mL，7 mm × 22 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>343755</td><td></td></tr><tr><td>Optima-TLX超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>361544</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇（Taxol等效物）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>ACROS Organics</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore</td><td>7110-5GM</td><td></td></tr><tr><td>猪源微管蛋白，生物素标记</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>猪源微管蛋白，HiLyte 647荧光标记</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M</td><td>远红荧光标记</td></tr><tr><td>猪源微管蛋白，罗丹明标记</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL590M</td><td></td></tr><tr><td>猪源微管蛋白，微管蛋白蛋白</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B sCMOS相机</td><td>Photometric</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>四象限探测器传感器头</td><td>ThorLabs</td><td>PDQ80A</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange Lightning试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>方形盖玻片</td><td>Corning</td><td>12-553-450</td><td>18 mm × 18 mm，厚度0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>链霉亲和素微球</td><td>Polysciences Inc.</td><td>24162-1</td><td></td></tr><tr><td>Superose-6层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0915--96</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100固定角转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机（超声破碎仪）</td><td>Vevor</td><td>JPS-08A(DD)</td><td>304不锈钢，40 kHz频率，60 W功率</td></tr><tr><td>Vectabond APTES溶液</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>含氨-D的Windex强力玻璃清洁剂</td><td>S.C. Johnson</td><td>SJN695237</td><td></td></tr></tbody></table>

直接测量重建的活性微管束内部作用力

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

微管网络在细胞中被用于执行多种任务，从作为囊泡运输的轨道，到在有丝分裂期间形成特化的阵列以调控染色体分离。与微管相互作用的蛋白质包括驱动蛋白和动力蛋白等马达蛋白，它们能够产生主动作用力和定向运动，也包括非马达蛋白，后者可将微丝交联成更高阶的网络结构或调控微丝动力学。迄今为止，针对微管相关蛋白的生物物理研究主要集中于单个马达蛋白在囊泡运输中的作用，关于驱动蛋白和动力蛋白的力生成特性及其机械化学调控机制已取得显著进展。然而，对于微管既作为货物又作为轨道的过程（如有丝分裂纺锤体内部微丝滑动），目前对参与其中的交联蛋白集合体的生物物理调控机制仍知之甚少。本文中，我们详细描述了一种直接探测由纯化微管和有丝分裂蛋白重建的最小化交联微管网络中力生成与响应的方法。将一对微管通过目标蛋白交联，其中一根微管固定于显微镜盖玻片上，另一根微管则由光镊操控。同时结合全内反射荧光显微镜技术，可在微丝滑动分离并产生作用力的过程中，实现对该微管网络所有组分的多通道可视化观察。我们还展示了如何利用这些技术探测由驱动蛋白-5集合体施加的推力，以及由有丝分裂微管相关蛋白PRC1交联的滑动微管对之间产生的黏滞制动阻力。这些检测方法为理解纺锤体组装与功能机制提供了重要见解，并可进一步推广应用于研究多种情境下致密微管网络的力学特性，例如神经元的轴突与树突，以及极化上皮细胞中的微管网络。

若满足若干关键标准，则表明已成功制备出适用于生物物理分析的微管束。首先，三色成像应显示两条排列整齐的微管，且交联蛋白的浓度在重叠区域富集（图5B、C和 图6B）。理想情况下，重叠区域边缘与罗丹明标记微管的游离末端之间的距离应至少为5 µm，以在捕获光束与荧光标记蛋白之间提供足够的物理空间。其次，在缺乏生物素化远红微管的区域，尤其是与交联蛋白标记所用通道相同的图像中，背景荧光信号应尽可能低。高背景荧光提示盖玻片钝化效果不佳，存在大量非特异性吸附于玻璃表面的蛋白质，这些蛋白可能与微管或捕获微珠发生非特异性相互作用。此外，若在任一微管成像通道中观察到微小的圆形斑点或短片段，则表明微管聚合与纯化过程未成功，或微管已老化或受损。
第三，用于捕获的微珠应呈现为单个微珠，而不是聚集在含有多个微珠的团块中。可能会有少量微珠不可逆地黏附在表面，但应观察到大部分微珠以单个颗粒的形式在样品腔内自由扩散。在将微珠注入腔室...

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外 利用同步的光镊捕获与全内反射荧光显微镜技术，直接量化活性微管网络中蛋白质复合物所产生的力和位移。该检测方法可实现对活性微管网络内蛋白质群体所生成的力与位移在纳米尺度上的精确测量。

微管网络在细胞中被用于完成多种任务，从作为囊泡运输的轨道，到发挥……

本方案使研究人员能够利用纯化的组分构建细胞骨架结构，并直接测量这些网络所产生的力，从而理解细胞的这些机械组分在健康与疾病状态下的功能机制。该方法使我们能够量化这些作用力，并将测量数值直接关联到所涉蛋白质的关键参数，包括蛋白质浓度和密度——而这些参数通常在细胞内难以获取。该方法可为多种细胞骨架网络提供研究 insights，例如参与有丝分裂或神经发育的网络。通过简单更换所使用的特定蛋白质，该方法可轻松适用于研究参与肌肉收缩或细胞迁移的网络。该方法最困难的部分在于协调不同的技术，包括单光束光镊和全内反射荧光显微镜（TIRF）。此外，单分子实验需要对表面（例如盖玻片）进行仔细的预处理，因此制备高质量的样品至关重要。首先构建一个湿度 chamber：将用超纯水润湿的折叠无绒擦拭纸置于空的移液枪吸头盒底部。通过在通道一端加样、从另一端用吸水纸吸液的方式，使用移液器依次引入所有试剂。使用20微升带角度的移液器吸头，缓慢加入10微升浓度为0.5毫克/毫升的链霉亲和素（streptavidin）或中性亲和素（NeutrAvidin）。将盖玻片朝下放入湿盒中孵育4分钟。用无尘纸吸取液体，使用20微升1×BRB80缓冲液冲洗反应腔。重复一次试剂流动和孵育步骤后，用10微升浓度为0.5毫克/毫升的酪蛋白封闭液进行冲洗。将10微升稀释后的远红荧光素标记的微管流入样品室，然后用20微升1x BRB80缓冲液冲洗样品室。按照之前所示方法进行试剂流动和孵育后，用10微升适当浓度的待研究非马达蛋白进行冲洗步骤，随后流入10微升罗丹明标记的微管，并重复孵育和冲洗步骤。接下来，将1微升用rigor肌球蛋白包被的微珠与19微升反应缓冲液混合。用透明指甲油密封流动池的两端，并等待指甲油完全干燥。使用配备全内反射荧光成像功能的倒置显微镜，并且该显微镜已集成单光束光镊系统。在样品室的盖玻片上加入一滴浸油。将样品室的盖玻片面向下，放置在显微镜载物台上待成像。缓慢提升物镜，使物镜通过浸油与盖玻片接触。调节物镜高度，使样品室的盖玻片表面处于焦平面。在所有三个通道中采集样品的单帧图像。本实验中，曝光时间使用100至200毫秒。在对单个束进行检测时，调整激光功率，以在2至5分钟内获得良好的信噪比，同时尽量减少光漂白。每个视野中微管束的频率应约为每100微升×100微升视野每腔室3至4个微管束。使用显微镜的明场和100倍物镜观察样品中珠子的密度。使用适当浓度的微珠，使其平均间距至少为10微米，并确保微珠未受到任何表面限制或发生聚集。确保远红外标记的生物素化微管牢固地附着在盖玻片表面，且罗丹明标记的微管无明显布朗运动。确保罗丹明标记的微管通过交联分子与生物素化微管连接，并在其游离端可见明显波动。选择一个合适的微管束，该微管束仅包含两条微管：一条为生物素化微管，完全附着于表面；另一条为非生物素化微管，部分游离于溶液中，并沿x轴或y轴排列。使用光镊捕获一个呈现布朗运动的游离微珠。一旦微珠被捕获，需小心将其移至选定的微管束上方，确保在此过程中无其他微珠被拉入光镊陷阱中。确保微珠距离含有交联蛋白的重叠区域数微米远。小心地沿 z 轴降低微珠，直至其与罗丹明标记微管游离段边缘接触。轻轻上拉，并沿垂直于微管轴的方向移动，通过观察罗丹明标记微管的弯曲及微珠位置的跟随情况，以确认是否连接成功。通过移动纳米定位载物台，仔细将罗丹明标记的微管与表面固定微管的微管轴重新对齐，并设置微管束自动拉伸的参数。将拉伸方向设定为与微管平行的轴向。根据重叠长度设定所需的拉伸速度和拉伸时间。以每秒1到2帧的速率开始在三个通道中记录荧光数据。使用已优化的激光功率和曝光时间。启动自动载物台移动，并从位置敏感探测器载物台和全内反射荧光显微镜载物台记录捕获数据。去活化陷阱以释放小球，并根据需要重复实验。有丝分裂关键马达蛋白kinesin-5的集合体可通过产生与微管重叠长度呈线性关系的推力和制动力来调控微管滑动。研究发现，C末端尾部结构域对于高效的交联和力的产生是必需的。全长蛋白能够产生持续的力，当所有马达蛋白达到各自的停滞力时，力的大小趋于平稳。然而，缺失C末端尾部的驱动蛋白-5（kinesin-5）所产生的最大力的幅度几乎减小了近五倍。非马达有丝分裂蛋白PRC1的复合物作为机械阻尼器发挥作用，抵抗后期纺锤体中区的微管滑动。阻力不依赖于微管对之间重叠区域的长度或局部交联蛋白的密度，但强烈依赖于已结合的PRC1分子的总浓度。该方法可通过使用不同的蛋白质来研究多种生物系统，例如微生物的组织结构和神经元。此外，该方法还可轻松扩展用于分析基于肌动蛋白的网络结构，以研究肌肉收缩或细胞运动性。该技术可研究独特的细胞整体几何结构，其中丝状结构既是轨道又是货物，并由少量蛋白质组装体进行组织。这些几何结构能更真实地模拟多种生物过程中细胞内发生的情况。

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科研

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Biology

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