直接测量重组活性微管束内的力

我们的协议允许研究人员从纯化的成分中构建细胞骨架基序，并直接测量这些网络产生的力，以了解细胞的这些机械成分在健康和疾病状态下的功能。这种方法使我们能够量化力并直接关联这些数字，以保持所涉及的蛋白质的参数，包括蛋白质浓度和密度。通常无法在单元格内获取的参数。

这种方法可以提供对任何类型的细胞骨架网络的见解，例如参与有丝分裂或神经发育的网络。它可以很容易地适应研究涉及肌肉收缩或细胞迁移的网络，只需简单地交换掉正在使用的这种特定蛋白质。这种方法最棘手的方面是不同技术的协调，其中包括单光束光学陷阱和TIRF显微镜。

此外，单分子实验需要仔细准备表面，例如盖玻片，因此制备高质量的样品至关重要。首先，将折叠起来的无绒纸巾浸有超纯水，放在空移液器吸头盒的底部，从而构建湿度室。通过在通道的一端移液液体并在另一端吸出液体来引入所有试剂。

使用20微升角的移液器吸头，缓慢流入10微升0.5毫克/毫升链霉亲和素或中性亲和素。将载玻片在湿度室中孵育4分钟，盖玻片朝下。使用20微升的1x BRB80使用无绒纸巾冲洗腔室以抽出液体。

重复流动试剂并再次孵育一次后，用10微升0.5毫克/毫升酪蛋白封闭溶液冲洗步骤。将 10 微升稀释的生物素化远红微管流入腔室，然后用 20 微升 1x BRB80 冲洗腔室。如前所述流动试剂并孵育后，用10微升适当浓度的非运动蛋白冲洗该步骤待研究，然后流入10微升罗丹明微管并重复孵育和冲洗。

接下来，混合 1 微升严格驱动蛋白包被的珠子和 19 微升反应缓冲液。用透明的指甲油密封腔室的两侧边缘，等待抛光剂干燥。采用具有全内反射荧光成像能力的倒置显微镜仪器，并在其中构建了单光束光学陷阱。

在样品室的盖玻片上加入 1 滴浸油。样品室的盖玻片面朝下，将要成像的样品放在显微镜平台上。慢慢地将物镜向上抬起，使盖玻片和物镜之间通过油接触。

调整物镜高度，使样品室的盖玻片表面清晰对焦。在所有三个通道中记录样品的单帧图像。对于这里的实验，请使用 100 到 200 毫秒的曝光时间。

调整激光功率以从样品中获得良好的信噪比，同时在分析单个束时最大限度地减少 2 到 5 分钟内的光漂白。每个视场的微管束频率应约为每腔室每 100 微升 x 100 微升视野 3-4 个微管束。使用明场和显微镜上的100倍物镜观察样品中珠子的密度。

使用一定浓度的珠子，使珠子平均相距至少 10 微米，并确保它们没有任何类型的表面约束或聚集。确保生物素化的远红色微管牢固地附着在盖玻片的表面上，并且罗丹明没有可见的布朗运动。确保罗丹明微管通过交联图连接到生物素化的微管上，并在其自由端明显波动。

确定一个合适的微管束，该微管束仅包含两个微管，一个具有全表面附着的生物素化，另一个非生物素化的微管，在溶液中部分游离并在 x 轴或 y 轴上对齐。使用光学陷阱捕获显示布朗运动的自由珠子。一旦磁珠被捕获，小心地将磁珠移动到选定的微管束上，确保在此过程中没有其他磁珠被拉入陷阱。

确保磁珠距离含有交联蛋白的重叠区域几微米。小心地降低z轴上的珠子，直到它与罗丹明微管的自由段的边缘接触。轻轻向上拉并垂直于微管轴移动，通过观察罗丹明微管弯曲并跟随珠子位置来检查附着。

通过移动纳米定位平台，沿着表面附着微管的微管轴小心地重新对齐罗丹明微管，并设置自动拉动微管束的参数。沿微管的平行轴设置方向。根据重叠长度设置所需的拉动速度和所需的拉动时间。

开始以每秒1至2帧的速率记录三个通道中的荧光数据。使用优化的激光功率和曝光时间。启动自动载物台运动，并记录来自位置敏感检测器载物台和全内反射荧光相机载物台的捕获数据。

停用陷阱以释放珠子并根据需要重复实验。必需的有丝分裂运动蛋白kinesin-5的集合可以通过产生随重叠长度线性缩放的推动力和制动力来调节微管滑动。研究发现，C端尾域是高效交联和力产生所必需的。

全长蛋白质能够产生持续的力，当所有运动蛋白达到其各自的失速力时，这种力就会停滞不前。然而，没有C端尾部的驱动蛋白-5电机产生的最大力小了近五倍。非运动有丝分裂蛋白PRC1的集合作为机械仪表板运行，以抵抗微管在后期纺锤体中间区滑动。

电阻力不取决于微管对之间重叠区域的长度或局部交联剂密度，但它们确实在很大程度上取决于接合的PRC1分子的总浓度。该方法可以通过使用替代蛋白质来适应研究不同的生物系统，例如微生物组织和神经元。它也可以很容易地扩展为分析基于肌动蛋白的网络几何形状，以研究肌肉收缩或细胞运动。

这种技术可以研究独特的细胞总几何形状，其中细丝既是跟踪又是货物，并且由小的蛋白质集合组织。这些几何形状更好地模仿了许多生物过程中细胞中发生的事情。