直接测量重建的活性微管束内部作用力

本方案使研究人员能够利用纯化的组分构建细胞骨架结构，并直接测量这些网络所产生的力，从而理解细胞的这些机械组分在健康与疾病状态下的功能机制。该方法使我们能够量化这些作用力，并将测量数值直接关联到所涉蛋白质的关键参数，包括蛋白质浓度和密度——而这些参数通常在细胞内难以获取。

该方法可为多种细胞骨架网络提供研究 insights，例如参与有丝分裂或神经发育的网络。通过简单更换所使用的特定蛋白质，该方法可轻松适用于研究参与肌肉收缩或细胞迁移的网络。该方法最困难的部分在于协调不同的技术，包括单光束光镊和全内反射荧光显微镜（TIRF）。

此外，单分子实验需要对表面（例如盖玻片）进行仔细的预处理，因此制备高质量的样品至关重要。首先构建一个湿度 chamber：将用超纯水润湿的折叠无绒擦拭纸置于空的移液枪吸头盒底部。通过在通道一端加样、从另一端用吸水纸吸液的方式，使用移液器依次引入所有试剂。

使用20微升带角度的移液器吸头，缓慢加入10微升浓度为0.5毫克/毫升的链霉亲和素（streptavidin）或中性亲和素（NeutrAvidin）。将盖玻片朝下放入湿盒中孵育4分钟。用无尘纸吸取液体，使用20微升1×BRB80缓冲液冲洗反应腔。

重复一次试剂流动和孵育步骤后，用10微升浓度为0.5毫克/毫升的酪蛋白封闭液进行冲洗。将10微升稀释后的远红荧光素标记的微管流入样品室，然后用20微升1x BRB80缓冲液冲洗样品室。按照之前所示方法进行试剂流动和孵育后，用10微升适当浓度的待研究非马达蛋白进行冲洗步骤，随后流入10微升罗丹明标记的微管，并重复孵育和冲洗步骤。

接下来，将1微升用rigor肌球蛋白包被的微珠与19微升反应缓冲液混合。用透明指甲油密封流动池的两端，并等待指甲油完全干燥。使用配备全内反射荧光成像功能的倒置显微镜，并且该显微镜已集成单光束光镊系统。

在样品室的盖玻片上加入一滴浸油。将样品室的盖玻片面向下，放置在显微镜载物台上待成像。缓慢提升物镜，使物镜通过浸油与盖玻片接触。

调节物镜高度，使样品室的盖玻片表面处于焦平面。在所有三个通道中采集样品的单帧图像。本实验中，曝光时间使用100至200毫秒。

在对单个束进行检测时，调整激光功率，以在2至5分钟内获得良好的信噪比，同时尽量减少光漂白。每个视野中微管束的频率应约为每100微升×100微升视野每腔室3至4个微管束。使用显微镜的明场和100倍物镜观察样品中珠子的密度。

使用适当浓度的微珠，使其平均间距至少为10微米，并确保微珠未受到任何表面限制或发生聚集。确保远红外标记的生物素化微管牢固地附着在盖玻片表面，且罗丹明标记的微管无明显布朗运动。确保罗丹明标记的微管通过交联分子与生物素化微管连接，并在其游离端可见明显波动。

选择一个合适的微管束，该微管束仅包含两条微管：一条为生物素化微管，完全附着于表面；另一条为非生物素化微管，部分游离于溶液中，并沿x轴或y轴排列。使用光镊捕获一个呈现布朗运动的游离微珠。一旦微珠被捕获，需小心将其移至选定的微管束上方，确保在此过程中无其他微珠被拉入光镊陷阱中。

确保微珠距离含有交联蛋白的重叠区域数微米远。小心地沿 z 轴降低微珠，直至其与罗丹明标记微管游离段边缘接触。轻轻上拉，并沿垂直于微管轴的方向移动，通过观察罗丹明标记微管的弯曲及微珠位置的跟随情况，以确认是否连接成功。

通过移动纳米定位载物台，仔细将罗丹明标记的微管与表面固定微管的微管轴重新对齐，并设置微管束自动拉伸的参数。将拉伸方向设定为与微管平行的轴向。根据重叠长度设定所需的拉伸速度和拉伸时间。

以每秒1到2帧的速率开始在三个通道中记录荧光数据。使用已优化的激光功率和曝光时间。启动自动载物台移动，并从位置敏感探测器载物台和全内反射荧光显微镜载物台记录捕获数据。

去活化陷阱以释放小球，并根据需要重复实验。有丝分裂关键马达蛋白kinesin-5的集合体可通过产生与微管重叠长度呈线性关系的推力和制动力来调控微管滑动。研究发现，C末端尾部结构域对于高效的交联和力的产生是必需的。

全长蛋白能够产生持续的力，当所有马达蛋白达到各自的停滞力时，力的大小趋于平稳。然而，缺失C末端尾部的驱动蛋白-5（kinesin-5）所产生的最大力的幅度几乎减小了近五倍。非马达有丝分裂蛋白PRC1的复合物作为机械阻尼器发挥作用，抵抗后期纺锤体中区的微管滑动。

阻力不依赖于微管对之间重叠区域的长度或局部交联蛋白的密度，但强烈依赖于已结合的PRC1分子的总浓度。该方法可通过使用不同的蛋白质来研究多种生物系统，例如微生物的组织结构和神经元。此外，该方法还可轻松扩展用于分析基于肌动蛋白的网络结构，以研究肌肉收缩或细胞运动性。

该技术可研究独特的细胞整体几何结构，其中丝状结构既是轨道又是货物，并由少量蛋白质组装体进行组织。这些几何结构能更真实地模拟多种生物过程中细胞内发生的情况。