由人诱导多能干细胞改造的同基因肾小球芯片
November 4th, 2022
这里介绍的是一种设计个性化器官芯片系统的协议，该系统通过整合与人类诱导的多能干细胞分化的遗传匹配的上皮和血管内皮细胞来概括肾小球过滤屏障的结构和功能。这种生物工程系统可以推进肾脏精准医疗和相关应用。
同基因肾小球芯片将使患者特定的疾病建模和肾毒性测试以及先进的精准医学应用成为可能。肾小球上皮和内皮来源于单个人诱导的多能干细胞或IPSC。IPSC具有无限的自我更新，几乎可以分化成任何细胞类型。
该技术可用于评估病理细胞表型和疾病。患者特异性器官芯片也可以作为药物筛选和机制研究的平台。该模型可应用于针对特定患者个性化芯片系统的开发。
该系统有可能在临床试验之前预测患者特定的反应。首先将25微升基底膜基质2溶液轻轻加入尿通道，20微升加入芯片的毛细血管通道。取两个无菌的15毫升锥形管盖，并用500微升无菌蒸馏水填充它们。
将盖子放在培养皿中以防止干燥，并将盖子放在培养皿上。在 37 摄氏度下孵育过夜。继续，从含有15天血管内皮细胞培养物的T75烧瓶中吸出培养基，浓度为90%。
加入五毫升细胞分离缓冲液，并在 37 摄氏度下孵育 5 至 7 分钟。然后将细胞转移到15毫升锥形管中，并加入5毫升DMEM / F-12。以200倍G离心五分钟。
除去上清液并将细胞重悬于300微升内皮维持培养基中。用血细胞计数器计数细胞以获得大约200万个细胞。使用 P200 屏障尖端，用 200 微升 DMEM/F-12 冲洗微流控芯片的顶部和底部通道，同时从出口外围吸出。
将连接到吸气器的 P200 屏障尖端牢固地握住芯片，远离底部通道的出口。将20微升血管内皮细胞悬液牢固地注入芯片的毛细血管通道中，并小心地从出口外围吸出培养基。在显微镜下检查是否有气泡或不均匀的播种密度。
轻轻倒置芯片，使细胞可以粘附在柔性PDMS膜的基底侧。将芯片放入支架盒中，并在盒中加入三毫升PBS，以防止膜干燥。将芯片在 37 摄氏度下孵育三个小时。
检查显微镜下的底部通道，以确定附着在柔性PDMS膜上的细胞汇合层。通过在底部通道的入口处添加200微升内皮维持培养基来洗涤未连接的细胞，同时从毛细血管通道出口的外围吸出。将芯片放回支架盒中，并在 37 摄氏度下孵育过夜。
第二天，用200微升内皮维持培养基轻轻冲洗毛细血管通道。用 200 微升 DMEM/F-12 冲洗尿道，并在入口和出口处滴下 50 微升 DMEM/F-12。进行中间中胚层细胞，用一毫升胰蛋白酶EDTA替换12孔板每个孔中的中间中胚层诱导培养基，并在37摄氏度下孵育五分钟。
使用细胞提升器轻轻刮取细胞，并使用移液解离细胞。向每个孔中加入两毫升胰蛋白酶中和溶液，并将细胞转移到50毫升锥形管中。用DMEM / F-12将细胞悬液的体积补足至50毫升，并以200倍G离心五分钟。
吸出上清液并将细胞重悬于500微升中间胚层诱导培养基中，以获得约300万个细胞。用血细胞计数器计数细胞。握住芯片并将25微升细胞悬液牢固地注入芯片的尿道中，同时小心地从出口外围吸出培养基。
检查气泡或不均匀的细胞接种密度。将三毫升PBS加入芯片支架盒中，并在37摄氏度下孵育三小时。孵育后，用200微升各自的细胞培养基冲洗两个通道。
将空的 P200 屏障尖端连接到尿道和毛细血管通道的两个出口。移取200微升内皮维持培养基，并将其一半注入毛细血管通道入口。释放入口内的移液器吸头，使通道的入口和出口都连接到充满介质的移液器吸头上。
用200微升中间中胚层维持培养基对尿道入口重复此过程。将芯片与嵌入在 37 摄氏度下的尖端孵育过夜。要将芯片连接到器官芯片生物反应器，首先，从通道中取出P200尖端。
将相应介质的液滴添加到尿道和毛细血管通道的入口和出口处，以防止干燥。向尿入口储液器中加入 3 毫升温热的足细胞诱导培养基，向毛细血管入口储液器中加入 3 毫升温热的内皮维持培养基。将 300 微升相应培养基直接添加到出口端口上方的出口储液罐中。
将豆荚滑到托盘上并进入器官芯片生物反应器。使用旋转拨盘选择并开始黄金周期两分钟。目视检查吊舱底部是否有所有四个流体端口上的小液滴。
要实现吊舱底部和微流控芯片端口之间的流体间接触，请将芯片载体轻轻滑入吊舱。轻轻向上按切屑托架卡舌。从芯片表面吸出多余的介质。
将器官芯片生物反应器的流速设置为每小时 60 微升。将循环应变设置为 10%，频率为 0.4 赫兹。使用器官芯片生物反应器上的旋转拨盘选择调节循环并运行两个小时。
目视检查出口储液罐是否增加介质液位。使用器官芯片生物反应器上的旋转拨盘选择调节循环。培养第 17 天后，每天从远离端口斜对角线的尿道出口储液器吸出培养基，但在储液器中保留一些培养基。
每两天用最多三毫升足细胞诱导培养基补充尿道入口储液器，持续五天。五天后，从尿道吸出培养基，但在储液器中保留一些培养基。每天用三毫升足细胞维持培养基补充尿道入口储液器。
同样，从毛细血管通道出口吸出培养基，并每天用内皮维持培养基补充入口储液器。使用该协议，人诱导的多能干细胞用于通过繁殖血管内皮细胞和足细胞来开发肾小球的功能体外模型。在足细胞诱导和血管内皮增殖后第21天，芯片内的细胞表达谱系识别标志物，例如足细胞的Podocin和Nephine，血管内皮细胞的VE Cadherin和PECAM-1。
足细胞和血管内皮细胞层均表达胶原蛋白IV，这是肾小球中最丰富的GBM蛋白。肾小球芯片选择性地过滤来自毛细血管的小分子，如菊粉进入尿通道，同时阻止白蛋白等大蛋白离开毛细血管通道，显示出选择性分子过滤功能。在第 4 至 7 天的内皮诱导期间，细胞数量的增加可能导致细胞的第二层，但过度接种可能会导致聚集，从而阻碍分化。
在PDMS芯片组件粘合不充分、流体流动路径堵塞或过滤屏障受损的情况下，可能会观察到尿道和毛细血管通道之间的意外流体交叉流动。从第 15 天开始播种内皮和上皮细胞并维护芯片时，重要的是在每一步目视检查通道中的气泡。在等基因肾小球芯片中，可以施用临床相关的候选药物来测试其治疗潜力或毒性水平。
这项技术现在为了解人类肾脏疾病的遗传基础和开发个性化疗法提供了机会。
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概述
本文介绍了一种用于构建个性化芯片器官系统的协议，该系统模仿肾脏肾小球滤过屏障。通过利用从人类诱导多能干细胞中获得的基因匹配的上皮细胞和血管内皮细胞，这个生物工程系统旨在提高肾脏精准医疗。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物工程
- 肾脏病学
- 干细胞研究
背景
- 同基因肾小球芯片能够实现患者特定的疾病建模。
- 人类诱导多能干细胞（IPSCs）可以分化为各种细胞类型。
- 该技术可以评估病理细胞表型。
- 它支持个性化医疗应用的发展。
研究目的
- 创建肾毒性测试模型。
- 促进药物筛选和机制研究。
- 推进肾脏精准医疗。
使用的方法
- 芯片器官系统的工程化。
- 来自IPSCs的上皮细胞和内皮细胞的整合。
- 肾脏肾小球滤过屏障的建模。
- 疾病和药物反应的评估。
主要结果
- 成功创建了一个患者特定的器官芯片。
- 展示了模拟肾脏疾病的潜力。
- 实现了药物肾毒性效应的测试。
- 为个性化医疗应用提供了平台。
结论
- 芯片器官系统可以推进肾脏研究。
- 它提供了一种精准医疗的新方法。
- 该模型可以适用于药物开发的更广泛应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Patient-specific isogenic kidney glomerulus chips derived from human iPSCs address a critical gap in predictive nephrotoxicity and disease modeling for drug discovery. This platform enables mechanistic de-risking and translational continuity by recapitulating the human glomerular filtration barrier with genetically matched cell types. The approach supports precision medicine initiatives and portfolio triage by enabling functional, patient-relevant assays early in the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a human-relevant, isogenic system.
- Supports biological de-risking by modeling disease phenotypes with patient-matched cells.
- Facilitates functional target validation through lineage-specific marker expression and barrier function.
- Improves predictive confidence for nephrotoxicity and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for compound screening in a physiologically relevant context.
- Delivers quantitative filtration and injury readouts for robust assay development.
- Enables scalability and platform reuse for high-content nephrotoxicity testing.
- Supports reliable evaluation of drug candidates for kidney-specific liabilities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human biology for translational biomarker discovery.
- Bridges discovery and preclinical validation by modeling patient-specific responses.
- Reduces translational risk by recapitulating human filtration and injury mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on functional human data.
Pipeline & Workflow Integration
This isogenic glomerulus chip platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical nephrotoxicity assessment, supporting precision medicine workflows.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and mechanistic studies in a patient-specific, human-derived system.
- Screening: Provides assay-ready chips with quantitative, reproducible filtration and injury outputs.
- Analytics: Enables measurement of selective molecular filtration and lineage marker expression for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity from in vitro to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform adaptable to diverse patient backgrounds and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in kidney research.
- Operational Value: Standardizes nephrotoxicity and disease modeling with reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early, patient-specific risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of kidney-targeted therapeutics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC differentiation and microfluidic chip handling.
- Needs access to organ-on-chip bioreactor systems and analytical imaging tools.
- Demands cross-team standardization for cell sourcing, seeding, and readout protocols.
- Adaptation across patient genotypes and disease models may require protocol optimization.
- Potential limitations include technical variability in chip assembly and cell differentiation efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Preparation of Microfluidic Organ Chip Devices
1:31
Seeding of viECs and Intermediate Mesoderm Cells into the Microfluidic Device
7:15
Podocyte Induction and Chip Maintenance
8:03
Results: Differentiation of viECs and Podocytes on Organ-On-A-Chip Device
9:35
Conclusion
