由人诱导多能干细胞构建的等基因肾小球芯片

等基因肾小球芯片将能够实现针对患者的疾病建模、肾毒性测试以及高级精准医疗应用。肾小球上皮和内皮细胞来源于同一个人工诱导多能干细胞（IPSC）群体。IPSC具有无限自我更新能力，可分化为几乎任何类型的细胞。

该技术可用于评估病理性细胞表型和疾病。患者特异性器官芯片还可作为药物筛选和机制研究的平台。该模型可应用于构建针对特定患者的个性化芯片上的器官系统。

该系统有望在临床测试前预测个体患者的反应。首先，向尿液通道中轻柔加入25 µL基底膜基质2溶液，并向芯片的毛细管通道中加入20 µL。取两个无菌的15 mL锥形管管盖，各加入500 µL无菌蒸馏水。

将盖子放入培养皿中以防止干燥，并盖上培养皿盖子。在 37°C 下孵育过夜。随后，吸去含有 90% 汇合度血管内皮细胞 15 天培养物的 T75 培养瓶中的培养基。

加入5毫升细胞解离缓冲液，于37摄氏度孵育5至7分钟。随后将细胞转移至15毫升锥形管中，并加入5毫升DMEM/F-12培养基。以200 × g离心5分钟。

吸去上清液，将细胞重悬于300微升内皮细胞维持培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，获得约200万个细胞。使用P200带滤芯吸头，同时向微流控芯片的上、下通道各加入200微升DMEM/F-12培养基，并从出口周围同步吸液。

用连接在移液器上的P200带滤芯吸头牢固握住芯片，并远离底部通道的出口。将20微升血管内皮细胞悬液牢固地注入芯片的毛细管通道中，并小心从出口周围吸取培养基。在显微镜下检查是否存在气泡或细胞接种密度不均的情况。

轻轻翻转芯片，使细胞能够黏附到柔性PDMS膜的基底侧。将芯片放入支架盒中，并向盒内加入3毫升PBS，以防止膜干燥。将芯片在37°C下孵育3小时。

在显微镜下检查底部通道，观察是否有融合的细胞层附着在柔性的PDMS膜上。通过在底部通道入口处加入200微升内皮维持培养基，同时从毛细管通道出口周围吸取液体，以清洗未贴壁的细胞。将芯片重新放回支架盒中，并于37摄氏度孵育过夜。

第二天，用 200 微升内皮细胞维持培养基轻柔冲洗毛细管通道。用 200 微升 DMEM/F-12 冲洗尿液通道，并在入口和出口端口处各滴加 50 微升 DMEM/F-12。对于中胚层前体细胞，将 12 孔板每孔中的中胚层诱导培养基更换为 1 毫升胰蛋白酶-EDTA，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。

使用细胞刮轻轻刮取细胞，并通过吹打进行细胞解离。向每孔中加入2毫升胰蛋白酶中和液，将细胞转移至50毫升锥形管中。用DMEM/F-12补至细胞悬液体积为50毫升，然后在200 × g条件下离心5分钟。

吸弃上清液，将细胞重悬于500微升中间中胚层诱导培养基中，以获得约300万个细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。手持芯片，将25微升细胞悬液牢固地注入芯片的尿液通道，同时小心吸取出口周围区域的培养基。

检查是否存在气泡或细胞接种密度不均的情况。向芯片支架盒中加入三毫升 PBS，并在 37 摄氏度下孵育三小时。孵育结束后，用 200 微升各自相应的细胞培养基冲洗两个通道。

将空的P200滤芯吸头插入尿道通道和毛细血管通道的两个出口中。用移液器吸取200微升内皮细胞维持培养基，将其中一半注入毛细血管通道的入口。将移液器吸头留在入口内，使通道的入口和出口均连接装有培养基的移液器吸头。

使用200微升中间中胚层维持培养基，对尿道通道入口重复此操作。将带有嵌入式吸头的芯片在37摄氏度下孵育过夜。要将芯片连接至器官芯片生物反应器，首先从通道中移除P200吸头。

向尿液通道和毛细血管通道的入口及出口处滴加相应培养基，以防止干燥。向尿液入口储液池中加入3 mL温热的足细胞诱导培养基，向毛细血管入口储液池中加入3 mL温热的内皮细胞维持培养基。直接在出口端口上方的出口储液池中各加入300 µL相应培养基。

将芯片模块滑入托盘并装入器官芯片生物反应器中。使用旋钮选择并启动预灌注循环，持续两分钟。目视检查芯片模块底部四个流体端口处是否有微小液滴。

为了在芯片底部与微流控芯片端口之间实现液体与液体的接触，轻轻将芯片载体滑入芯片座中。轻压芯片载体的标签向内并向上。吸除芯片表面多余的培养基。

将器官芯片生物反应器的流速设置为 60 微升每小时。将周期性应变设置为 10%，频率为 0.4 赫兹。使用器官芯片生物反应器上的旋转拨盘选择调节循环模式，并运行两小时。

目视检查出口储液槽中培养基液面是否升高。使用器官芯片生物反应器上的旋转拨盘选择调节循环模式。培养第17天后，每天从尿液通道出口储液槽中斜向吸出培养基，方向应远离进样口，但需在储液槽中保留部分培养基。

每两天向尿液通道入口储液池中补充最多三毫升足细胞诱导培养基，持续五天。五天后，从尿液通道中吸出培养基，但保留部分培养基于储液池中。此后每日向尿液通道入口储液池中补充三毫升足细胞维持培养基。

同样，每天从毛细血管通道出口处吸出培养基，并用内皮细胞维持培养基重新补充入口储液池。通过该方案，利用人诱导性多能干细胞，通过扩增血管内皮细胞和足细胞，建立了肾小球的功能性体外模型。在足细胞诱导及血管内皮扩增后的第21天，芯片内的细胞表达了谱系鉴定标志物，如足细胞表达Podocin和Nephrin，血管内皮细胞表达VE-Cadherin和PECAM-1。

足细胞和血管内皮细胞层均表达IV型胶原蛋白，这是肾小球肾小球基底膜中最丰富的蛋白质。肾小球芯片能够选择性地将小分子（如菊粉）从毛细血管过滤到尿液通道中，同时阻止白蛋白等大分子蛋白质离开毛细血管通道，显示出选择性分子过滤功能。在第4至第7天的内皮诱导过程中，细胞数量的增加可能导致形成次级细胞层，但接种过量可能引起细胞聚集，从而阻碍细胞分化。

如果PDMS芯片组件键合不充分、流体通路发生堵塞或滤过屏障受损，则可能观察到尿液通道与毛细血管通道之间出现意外的液体交叉流动。在接种内皮细胞和上皮细胞并从第15天起维持芯片培养时，每一步都必须肉眼检查通道中是否存在气泡。在同基因型肾小球芯片中，可施加具有临床意义的候选药物，以评估其治疗潜力或毒性水平。

这一技术为理解人类肾脏疾病的遗传基础并开发个性化治疗方案开辟了新的机遇。