Name: 绵羊眼玻璃体内注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: 学习绵羊眼玻璃体内注射技术，用于视网膜基因治疗研究。该方法以绵羊为模型，通过向玻璃体腔注射治疗剂，为治疗视网膜退行性疾病提供微创方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢 Steve Heap 博士（BVSc，CertVOphthal）在建立本方案及执行 Murray 等所述注射操作过程中提供的协助。&#160;等。15作者还感谢来自新西兰CureKids、坎特伯雷医学研究基金会、Neurogene公司以及Batten病支持与研究协会的资助。

所有实验方案均经林肯大学动物伦理委员会批准，并符合美国国立卫生研究院关于科研中动物护理与使用的指南以及新西兰《动物福利法》（1999年）的规定。边境代尔羊在出生时即被诊断14，并饲养于林肯大学的研究农场。三只3月龄的纯合子（CLN5-/-）母羊接受单次玻璃体内注射（IVT）至左眼，未处理的右眼作为内部对照。将电生理视网膜图（ERG）和病理学数据与历史上的健康对照和患病对照数据进行比较。本研究使用的病毒载体为自互补腺相关病毒9型（scAAV9），携带鸡β-肌动蛋白（CBh）启动子和密码子优化的绵羊CLN5基因（scAAV9/CBh-oCLN5opt）。该病毒载体由美国北卡罗来纳大学病毒载体核心实验室（NC, USA）提供。
1. 术前准备
<ol>
	<li>对手术器械包进行高压灭菌（图1）。</li>
	<li>术前24小时对绵羊进行禁食。</li>
	<li>手术前记录活体体重。</li>
</ol>
<img alt="用于医疗操作的止血钳、镊子和导线夹置于蓝色铺巾上的手术设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：玻璃体内手术器械包。 玻璃体内（IVT）手术所需的器械包括：(1) 用于撑开眼睑的眼睑撑开器；(2) 一对弯头镊子，用于夹持球结膜并转动眼球；(3) 一把直头止血钳，作为替代器械，用于夹持球结膜并在眼球回缩至眼眶内时固定眼球位置。该器械包在手术前需进行高压灭菌处理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 手术操作
<ol>
	<li>固定动物，并使用电动剪毛器将颈部一侧颈静脉上方的羊毛剪除。</li>
	<li>通过在颈静脉沟基部施加压力来阻断颈静脉，使静脉隆起并清晰可见。</li>
	<li>将适量地西泮（0.3 mg/kg）和氯胺酮（7.5 mg/kg）抽入无菌注射器中，安装无菌20 G针头。将针头插入颈静脉，轻轻回抽活塞，确认血液进入针座，表明针头已在静脉内。确认后，通过静脉（颈静脉）途径进行诱导麻醉。</li>
	<li>麻醉诱导后立即让动物仰卧，伸展颈部，将舌头向上前方牵拉，使用喉镜暴露喉部。当动物呼气时，轻柔地将气管插管（根据羊的体型选择6.0–9.0规格）插入声门之间。立即充胀气管套囊，并用绑带固定导管于下颌。确认导管内有气流通过。</li>
	<li>将羊转移至手术台，置于侧卧位。</li>
	<li>立即连接气管导管至麻醉机管路，以100%氧气输送异氟烷。初始浓度设为3%–4%，随后维持在2%–3%。观察羊的自主呼吸情况。</li>
	<li>在整个操作过程中监测心率（脉搏）、呼吸频率、血氧饱和度、呼气末CO2水平及直肠体温。有关麻醉状态下羊的这些参数生理值，请参见表1（数值存在个体差异，可作为参考）。</li>
	<li>在手术器械车上铺一张大号无菌方形手术巾，随后放置无菌器械。</li>
	<li>在待注射的眼部覆盖无菌带窗手术巾。</li>
	<li>使用无菌20 mL注射器以1%-5%聚维酮碘溶液冲洗眼部，进行无菌消毒。</li>
	<li>向眼部滴加1–2滴Alcaine 0.5% W/V眼用溶液，作为局部麻醉剂。</li>
	<li>将Nopa Barraquer-Colibri眼睑撑开器（10 mm）安装于眼睑，以保持眼睛张开。</li>
	<li>用镊子夹住眼球外侧上方的球结膜，并将眼球向腹内侧旋转。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>清醒状态</td>
			<td>麻醉的</td>
			<td>推荐的关键干预点</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心率（次/分钟）</td>
			<td>50-80（静息）至280（活动）</td>
			<td>50-80</td>
			<td>&lt;50, &gt;100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>呼吸频率（次/分钟）</td>
			<td>15-40（常温）至350（过热）</td>
			<td> 10-30</td>
			<td>&lt;8, &gt;40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氧饱和度（mm Hg）</td>
			<td>95-100</td>
			<td>98-100</td>
			<td>&lt;90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>终末潮气末 CO₂2 (mm Hg)</td>
			<td>35-45</td>
			<td>35-45</td>
			<td>&gt;55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体温（˚C）</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>&lt;36, &gt;40</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：麻醉绵羊需监测的生理参数值。
3. 病毒制备
<ol>
	<li>将 AAV 载体分装样品在 −80 ˚C 下保存至使用。</li>
	<li>手术当天，将用于 IVT 递送的所需数量的小瓶置于冰上解冻。</li>
	<li>给药前立即涡旋混匀病毒载体分装样品，并在 400 × g 离心 10 秒以收集管内液体。</li>
	<li>将每份病毒载体分装样品用无菌过滤的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至目标剂量，终体积为 100 µL。在无菌的 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中，使用无菌过滤吸头进行载体稀释。所有接触过病毒载体的一次性耗材均应弃入消毒液中（参见材料表）。 
	注意：在原始出版文献15中，治疗剂（AAV9.CLN5）的剂量为 1.9 × 1010 病毒基因组。推荐剂量将根据所用治疗剂的不同而有所变化；因此，本标准操作方案中未指定具体剂量。</li>
	<li>立即将 100 µL 的 AAV 载体溶液吸入一支无菌、低死体积的 1 mL 注射器中，该注射器永久连接 28 G × 1/2 英寸针头，用于立即注射。确保从配制到注射的时间少于 2 分钟。</li>
</ol>
4. 病毒给药
<ol>
	<li>在眼球外侧，于巩膜后方约 7 mm 处插入针头，并向后倾斜进针角度以避开晶状体（图 2 和 图 3）。以弹丸式单次注射方式给予 100 µL 药物，尽可能靠近视网膜，但不扰动视网膜表面。</li>
	<li>用约 10–15 mL 的 1–5% 聚维酮碘溶液冲洗眼球，随后用 10 mL 生理盐水冲洗，然后取下开睑器和手术巾。</li>
	<li>将绵羊翻身，必要时对另一只眼重复上述操作。</li>
</ol>
<img alt="眼部解剖手术示意图，突出显示眼肌的对齐与定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：眼球的腹内侧旋转。（A）用无齿镊夹住球结膜，然后（B）向腹内侧（即向下并朝向吻部）旋转，以暴露眼球的背外侧表面用于注射。缩写：V = 腹侧，D = 背侧，M = 内侧，L = 外侧。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="无菌环境中使用牵开器和注射器的手术操作，突出显示手术设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：注射位置与深度。 针头注射于眼球的背外侧部位，针头全长（0.5 英寸/12.7 mm）均插入眼内。注意针头朝向眼球后部的角度，以避开晶状体，并尽可能接近视网膜进行注射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 术后管理
<ol>
	<li>操作完成后，停止异氟烷气体吸入麻醉，用100%氧气冲洗管路，将导管从气管插管上断开，并将绵羊转移至恢复室。</li>
	<li>将绵羊置于胸卧位，四肢收于身下，持续监测直至完全恢复意识。确保动物口腔内无任何阻塞物。</li>
	<li>观察到吞咽反射后，部分放空气管插管的气囊，并轻柔地将插管从口中取出。</li>
	<li>在后肢股二头肌注射肌内非甾体抗炎药，于颈部侧面或肩部后方皮下注射抗生素，并向眼球表面滴加0.5%氯霉素眼药水。</li>
	<li>当绵羊能够自主站立后，提供水和饲料（苜蓿颗粒和粗饲料）。</li>
	<li>术后7天内，每日给予0.5%氯霉素眼药水2至3次。</li>
	<li>术后约24小时，在返回室外圈舍前将绵羊在室内饲养过夜。</li>
	<li>连续3周每日记录直肠温度。监测脉搏或呼吸频率、摄食量、神经行为、体温、体重、姿势、眼部健康状况以及任何疾病临床征象的变化。如出现不良事件迹象，应及时寻求相应的兽医治疗。</li>
</ol>
6. 评估疗效 体内
<ol>
	<li>如果玻璃体内注射（IVT）的目标是保护视力，应监测其疗效 体内 通过迷宫测试或视网膜电图（ERG）等方法评估视网膜细胞功能，或通过光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜结构。 
	注意：这些疗效指标在视网膜下注射基因治疗后已有充分描述11,15,16.</li>
</ol>
7. 死后组织分析
<ol>
	<li>在玻璃体内注射手术后的适当终点，采用批准的方法对绵羊实施安乐死。 
	注意：建议的安乐死方法，例如静脉注射兽医用安乐死药物，或使用穿透性栓塞枪击中颈椎后迅速放血，已在其他文献中详细描述15,16。</li>
	<li>使用外科锐性/钝性弯剪摘取绵羊眼球。剪开外侧和内侧睑裂以扩大眼眶开口，随后系统性地剪开结膜皱襞、结缔组织、肌肉以及视神经，使眼球从眼眶中完全游离。</li>
	<li>将完整摘除的眼球浸入10%福尔马林中固定2小时，随后在Bouin氏液中后固定4小时，并在巩膜上做一小切口（0.5 cm）以确保充分灌注。或者，将眼球浸入Davidson氏液中固定48小时。</li>
	<li>将眼组织切片按常规进行石蜡包埋，并切片至3–5 µm厚度。 
	注意：苏木精和伊红（H&amp;E）染色及免疫组织化学分析的染色步骤此前已有描述15,16。</li>
	<li>通过死后组织检测评估疗效，检测指标包括总视网膜厚度、视网膜各层厚度、外核层细胞排数计数，以及针对特定视网膜细胞类型、视网膜胶质细胞或目标蛋白的免疫组织化学染色。 
	注意：有关这些分析的具体方案，请参见此前发表的文献15,16。</li>
</ol>

<ol><li>Himawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+retinal+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to retinal photoreceptors.</a> Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).</li>
<li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+therapies+for+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%3A+More+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye.</a> Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).</li>
<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li>
<li>Grzybowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((update+on+intravitreal+injections%3A+Euretina+expert+consensus+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations.</a> Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).</li>
<li>Pavlou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+AAV+capsids+for+intravitreal+gene+therapy+of+photoreceptor+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392(2021).</li>
<li>Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+mutation+spectrum+and+clinical+correlations+of+over+360+mutations+in+eight+genes+that+underlie+the+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).</li>
<li>Wibbeler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerliponase+alfa+for+the+treatment+of+atypical+phenotypes+of+CLN2+disease%3A+A+retrospective+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series.</a> Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+intraventricular+cerliponase+alfa+for+CLN2+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).</li>
<li>Mitchell, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+monitoring+of+the+CNS+demonstrates+the+efficacy+of+gene+therapy+in+a+sheep+model+of+CLN5+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease.</a> Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).</li>
<li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+retinal+degeneration+in+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Scientific Reports. 12 (1), 3670(2022).</li>
<li>Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinography+data+from+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Data in Brief. 37, 107188(2021).</li>
<li>Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+and+allometric+prediction+of+vitreous+volume%2C+and+retina+and+lens+weights+in+G%C3%B6ttingen+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs.</a> Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).</li>
<li>Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ganglion+cells+and+photoreceptors+in+the+sheep+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).</li>
<li>Frugier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+large+animal+model+of+CLN5+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+in+Borderdale+sheep+is+caused+by+a+nucleotide+substitution+at+a+consensus+splice+site+%28c.571%2B1G%3EA%29+leading+to+excision+of+exon+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3.</a> Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).</li>
<li>Murray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+gene+therapy+protects+against+retinal+dysfunction+and+degeneration+in+sheep+with+CLN5+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease.</a> Experimental Eye Research. 207, 108600(2021).</li>
<li>Ross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+retinal+transduction+by+AAV2-7m8+following+intravitreal+injection+in+a+sheep+model+of+CNGA3+achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia.</a> Gene Therapy. , (2021).</li>
<li>Boyd, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor-targeted+gene+delivery+using+intravitreally+administered+AAV+vectors+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs.</a> Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+visual+performance+with+intravitreal+administration+of+9-cis-retinal+in+Rpe65-mutant+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs.</a> Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).</li>
<li>Ross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+photoreceptor+transduction+efficacy+of+capsid-modified+adeno-associated+viral+vectors+following+intravitreal+and+subretinal+delivery+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).</li>
<li>Kotterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+neutralization+poses+a+barrier+to+intravitreal+adeno-associated+viral+vector+gene+delivery+to+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates.</a> Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).</li>
<li>Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+responses+to+AAV+gene+therapy+in+the+ocular+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment.</a> Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).</li>
<li>Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subconjunctival+hemorrhage+after+intravitreal+injection+of+anti-vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).</li>
<li>Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+needle+forces+and+acute+pressure+changes+during+intravitreal+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).</li>
<li>Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+and+injection+forces+during+intravitreal+injection+into+enucleated+porcine+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).</li>
<li>Ross, M., Ofri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+retinal+gene+therapy%3A+Evolving+from+subretinal+to+intravitreal+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery.</a> Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).</li>
<li>Henein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+of+intravitreal+injections+into+liquid+vitreous+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes.</a> Pharmaceutics. 11 (8), 371(2019).</li>
<li>Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+intraocular+pressure+variation+during+automatic+intravitreal+injections%3A+An+ex-vivo+experimental+study+using+porcine+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes.</a> PloS One. 16 (8), 0256344(2021).</li>
<li>Willekens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreally+injected+fluid+dispersion%3A+Importance+of+injection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).</li>
<li>Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+models+to+study+drug+delivery+barriers+in+the+posterior+segment+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).</li>
<li>Kiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Considerations+for+Ocular+Gene+Therapy.+Adeno-associated+virus+vectors+offer+a+safe+and+effective+tool+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Retinal+Physician%22%5BJournal%5D)">Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery.</a> Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+targeting+the+inner+retina+rescues+the+retinal+phenotype+in+a+mouse+model+of+CLN3+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain-directed+gene+therapy+rescues+a+mouse+model+of+neurodegenerative+CLN6+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease.</a> Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

玻璃体内注射是人类眼科中最常见的外科手术之一，已证明可有效将腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗递送至绵羊的视网膜。我们先前已证实，通过玻璃体内注射递送AAV9.CLN5基因治疗可有效减轻CLN5型神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL）绵羊模型的视网膜功能障碍和退行性病变15。希望该给药途径在人类NCL患者中的转化应用也能带来益处。
向绵羊眼球内进行小体积玻璃体内注射（IVT）的操作方案相对简单、无创，易于重复，且非专业人员也容易掌握。注射的成功取决于视网膜内的靶细胞、所递送的治疗手段，以及注射的位置和方向。尽管通常认为玻璃体内注射在靶向视网膜内层时效果最佳，但许多研究人员已证实，即使在以外层视网膜为主要病变部位的疾病中，玻璃体内注射同样有效15,17,18,19。玻璃体内注射后功能和病理...

有多种方法可用于将治疗剂递送至视网膜，包括玻璃体内（IVT）、视网膜下、脉络膜上、眼周或局部给药。每种给药途径均需克服血-视网膜屏障或内界膜与外界膜等屏障，其疗效因所递送药物及特定视网膜靶点的不同而有所差异1,2。
玻璃体内药物递送（IVT）是将药物注射到眼球的玻璃体腔内，玻璃体是一种凝胶状物质，占据眼球的后房。玻璃体的主要功能是维持眼球的形状，并固定晶状体和视网膜等眼内组织。玻璃体主要由水组成，含有少量胶原蛋白、透明质酸及其他非胶原蛋白3。玻璃体内注射是一种简单且常见的操作，常规用于治疗多种&#160;眼部疾病，包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞以及多种遗传性视网膜营养障碍4,5。
神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL；巴滕病）是一组致命的溶酶体贮积病，可导致大脑和视网膜严重退化。目前已知有13种NCL亚型，由不同基因（CLN1-8、CLN10-14）突变引起，主要影响儿童，但发病年龄和疾病严重程度各不相同6。NCL具有共同的进行性症状，包括认知和运动功能衰退、癫痫发作以及视力丧失。目前尚无治愈NCL的方法；然而，针对CLN2型疾病的脑靶向酶替代疗法正处于临床试验阶段7,8，而AAV介导的基因治疗在临床前研究中已显示出巨大前景，预计CLN5基因治疗的临床试验将于2022年启动9,10。
许多其他物种会自然发生神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL），包括猫、狗、绵羊和牛。目前在新西兰正在积极研究两种绵羊的NCL模型：一种是Borderdale绵羊中的CLN5病模型，另一种是South Hampshire绵羊中的CLN6病模型。患病绵羊表现出多种与人类疾病相似的临床和病理特征，包括视网膜萎缩和视力丧失10,11。尽管针对CLN5病绵羊的脑部定向CLN5基因治疗可以预防或阻止脑萎缩及临床症状恶化，但经治疗的绵羊仍然会丧失视力9。这凸显了需要对视网膜进行治疗以保护视力并提高生活质量，从而推动建立了绵羊眼部基因治疗的操作方案。
由于绵羊眼球的尺寸、玻璃体体积和视网膜结构与人类眼球相似，因此绵羊眼是研究人类眼睛的良好模型10,12,13。本文详细描述了将小体积（≤100 µL）治疗性病毒载体经玻璃体腔注射递送至绵羊眼的手术操作流程。

<table><tbody><tr><td>1 mL 低残留量安全注射器，带永久性连接的 0.5 英寸针头</td><td>Fisher Scientific, 奥克兰, 新西兰</td><td>05-561-28</td><td>Covidien Monoject 结核菌素安全注射器或类似产品</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323</td><td>使用前需高压灭菌的灭菌管</td></tr><tr><td>带气体工作站和监护仪的麻醉机&amp;nbsp;</td><td>Hyvet Anesthesia, 克赖斯特彻奇, 新西兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生素滴眼液&amp;nbsp;</td><td>Teva Pharma Ltd, 奥克兰, 新西兰</td><td></td><td>商品名：Chlorafast (0.5% 氯霉素)</td></tr><tr><td>BrightMount plus 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Abcam, 剑桥, 英国</td><td>ab103748</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;prime; ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)</td><td>Sigma Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>地西泮镇静剂</td><td>Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td></td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>气管插管</td><td>Flexicare Medical Ltd, 山麓, 英国</td><td></td><td>标准型，带气囊。根据绵羊体型选择 7、7.5 或 8 号</td></tr><tr><td>开睑器</td><td>Capes Medical Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td>KP151/14</td><td>Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)</td></tr><tr><td>带孔手术巾</td><td>Amtech Medical Ltd, 旺格努伊, 新西兰</td><td>DI583</td><td>或类似产品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>滤芯吸头</td><td>Interlab, 奥克兰, 新西兰</td><td></td><td>10、200 和 1,000 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醛溶液 (37%)</td><td>Fisher Scientific, 奥克兰, 新西兰</td><td>AJA809-2.5PL</td><td>用含 0.9% NaCl 的蒸馏水配制成 10%</td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Carlsbad, CA, 美国</td><td>&amp;nbsp;A-11012</td><td>使用稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂</td><td>Attane, Bayer Animal Health, 奥克兰, 新西兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮麻醉/镇痛剂</td><td>PhoenixPharm Distributors Ltd, 奥克兰, 新西兰</td><td></td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>喉镜（兽用）</td><td>KaWe Medical, 丹麦</td><td></td><td>Miller C 型刀片，2 号</td></tr><tr><td>针头&amp;nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td>302025</td><td>BD 皮下注射针头或类似产品</td></tr><tr><td>非甾体抗炎药</td><td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, 奥克兰, 新西兰</td><td>49402/008</td><td>商品名：Metacam 20 (20 mg/mL 美洛昔康)</td></tr><tr><td>无齿镊</td><td>Capes Medical Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td>AB864/16</td><td>或类似产品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无齿止血钳</td><td>Capes Medical Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td>AA150/12</td><td>或类似产品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Thermo Fisher Scientific, 克赖斯特彻奇, 新西兰</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>医用氧气</td><td>BOC Gas, 克赖斯特彻奇, 新西兰</td><td></td><td>D2 气瓶，气体代码 180</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, 克赖斯特彻奇, 新西兰</td><td>10010023</td><td>无菌，经过滤</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Capes Medical Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td>005835</td><td>商品名：Betadine (10% 聚维酮碘)</td></tr><tr><td>兔抗牛胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体</td><td>Dako, Glostrup, 丹麦</td><td>Z0334</td><td>使用稀释比例为 1:2,500</td></tr><tr><td>自互补腺相关病毒血清型 9，携带鸡β-肌动蛋白 (CBh) 启动子和密码子优化的绵羊 CLN5 基因</td><td>北卡罗来纳大学病毒载体核心实验室, 北卡罗来纳州, 美国</td><td>scAAV9/CBh-oCLN5opt</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠静脉注射液</td><td>Capes Medical Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td>AHB1322</td><td>商品名：生理盐水溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>皮下注射抗生素</td><td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, 惠灵顿, 新西兰</td><td></td><td>商品名：Duplocillin LA (150,000 IU/mL 普鲁卡因青霉素和 115,000 IU/mL 苄星青霉素)</td></tr><tr><td>外科尖端钝头弯剪&amp;nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, 陶朗加, 新西兰</td><td>SSSHBLC130</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 注射器鲁尔锁接头</td><td>Amtech Medical Ltd, 旺格努伊, 新西兰</td><td>SH159/SH160</td><td>无菌注射器；10 mL 用于抽取诱导药物，20 mL 用于抽取生理盐水</td></tr><tr><td>Virkon 消毒剂粉末</td><td>EBOS Group Ltd, 克赖斯特彻奇, 新西兰</td><td>28461115</td><td></td></tr></tbody></table>

绵羊眼玻璃体内注射

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

将治疗剂递送至视网膜的方法有多种，包括玻璃体内（IVT）、视网膜下、脉络膜上腔、眼周或局部给药。玻璃体内给药需将药物注射至眼球的玻璃体腔中，玻璃体是一种凝胶状物质，填充于眼球后房并维持眼球的形态。尽管与视网膜下给药相比，玻璃体内给药的靶向特异性较低，但其侵入性显著更小，因此在临床中广泛用于多种眼病的治疗。
我们先前已证明，对患有天然存在的CLN5型神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL）的绵羊，经玻璃体内注射给予腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗产品（AAV9.CLN5）具有治疗效果。患病绵羊的一只眼睛接受了玻璃体内基因治疗，另一只未治疗的眼睛则作为内部对照。治疗后长达15个月内，治疗眼的视网膜结构和功能得以维持，而未治疗眼则表现出功能进行性下降，并在死后解剖时发现严重萎缩。基于绵羊研究结果，CLN5基因治疗产品于2021年9月获美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为研究性新药（IND）候选产品进入临床试验。本文详细描述了将治疗性病毒载体经玻璃体内注射递送至绵羊眼内的手术操作流程。

该研究团队此前已证明，通过玻璃体内注射（IVT）递送CLN5基因治疗载体可有效减轻CLN5型神经元蜡样脂褐质沉积症（CLN5 NCL）绵羊模型中的视网膜功能障碍和退行性病变15。患病绵羊在一只眼中单次注射100 µL包裹于腺相关病毒9型（AAV9）载体中的CLN5基因（AAV9.CLN5），另一只眼则作为未经治疗的内部对照。从注射时龄（3个月）至疾病终末期（18个月），每月评估视力变化。在实验结束后，对治疗眼和未治疗眼进行视网膜组织病理学分析，并与年龄匹配的健康对照组及CLN5患病对照组进行比较。
视网膜电图（ERG）分析显示，治疗眼的视网膜功能得以保留，而未治疗眼的功能下降程度与CLN5病变动物相似（图4）15。治疗眼的视网膜组织学接近正常，其中心区域的总视网膜厚度与健康对照动物相当；相比之下，未治疗眼的视网膜厚度则与CLN5病变动物相近（图5）<sup class=...

在绵羊眼中进行玻璃体内注射，旨在将病毒介导的基因治疗递送至视网膜。

向视网膜递送治疗剂的方法有多种，包括玻璃体内（IVT）、视网膜下、脉络膜上、眼周或……

玻璃体内注射可用于将治疗剂递送至视网膜。本文介绍了一种以绵羊眼作为人眼模型进行玻璃体内注射的实验方案。与其他眼部注射方式相比，玻璃体内注射的侵入性显著降低。玻璃体内注射可成功用于递送基因治疗产品，治疗患有先天性神经元蜡样脂褐质沉积症的绵羊的视网膜变性。待绵羊麻醉后，使用20毫升注射器以1%至5%的聚维酮碘溶液冲洗拟注射的眼部，开始无菌消毒。随后，在眼部上方放置无菌带窗手术巾。将开睑器安装至眼睑以保持眼睛睁开。用镊子夹住眼球背外侧的球结膜，并将眼球向腹内侧旋转。在眼球外侧、距巩膜约7毫米的后方位置插入针头，针头方向略向后倾斜，以避开晶状体。以弹丸式单次注射100 µL，尽可能靠近视网膜，但不扰动视网膜表面。取出开睑器和手术巾前，先用约10至15 mL的1%–5%聚维酮碘溶液冲洗眼睛，随后用10 mL生理盐水冲洗。视网膜电图分析显示，治疗眼的视网膜功能得以保留，而未治疗眼的功能下降程度与CLN5病变动物相似。治疗眼的视网膜组织学接近正常，其中心区域的总视网膜厚度与健康对照动物相当。相比之下，未治疗眼的视网膜厚度则与CLN5病患动物相似。治疗眼中胶质纤维酸性蛋白（GFAP，一种视网膜应激和星形胶质细胞的标志物）的表达水平低于未治疗眼，表明治疗后与疾病相关的炎症反应有所减轻。随着羊眼玻璃体内注射方案的建立，现在可以利用羊来测试多种玻璃体内递送治疗剂的安全性和有效性。

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

玻璃体内注射是视觉科学研究中用于眼部疾病或局部治疗直接给药的常用技术。本视频展示了一种使用1...

建立眼病模型的玻璃体腔注射法

来源：Park, S. W., 等. 小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的角膜缘入路视网膜下注射。J. Vis. Exp.

小鼠模型中向视网膜色素上皮的视网膜下注射病毒载体

兔子被广泛用于研究眼内药物的药代动力学。本文介绍一种利用兔眼进行眼内药物药代动力学研究的方法。...

兔眼在眼内药物药代动力学研究中的应用

本文展示了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）将基因治疗药物递送至视网膜下腔、评估其分布范围并表征光感受器活性的新方法。...

超高分辨率小鼠光学相干断层扫描技术在视网膜基因治疗研究中辅助眼内注射

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本文介绍了一种用于细菌性眼内炎小鼠模型的玻璃体内注射方法及后续细菌定量技术。该方案可进一步扩展用于检测宿主免疫反应以及细菌和宿主基因的表达。...

小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析

在本研究中，通过使用由输注/抽取注射泵、可拆卸气密注射器及显微注射针组成的注射系统，证明了结膜下注射可作为小鼠眼组织有效的载体递送方法。该注射系统也可适用于其他眼内给药途径。...

小动物模型中腺相关病毒载体的结膜下给药

本方案描述了一种通过中央角膜切口和长隧道进入前房的大鼠前房注射技术。该注射方法可最大限度地降低意外组织损伤的风险，从而提高操作的精确性和可重复性。...

大鼠眼内注射技术：低不良反应风险

本方案描述了一种采用经结膜入路注射大鼠视神经的独特技术。...

经结膜途径向大鼠视神经注射

本研究介绍了一种将治疗剂递送至成年大鼠视网膜和视神经的方法。此外，还提出了一种独特的组织获取方法，可自上而下整体切取成年大鼠的视神经和视网膜。...

成人鼠眼部药物递送与先进组织获取

学习绵羊眼玻璃体内注射技术，用于视网膜基因治疗研究。该方法以绵羊为模型，通过向玻璃体腔注射治疗剂，为治疗视网膜退行性疾病提供微创方案。

绵羊眼玻璃体内注射

探索更多视频