Name: 电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送到新鲜分离的初级小鼠肝细胞中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习利用电穿孔技术将CRISPR-Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的原代小鼠肝细胞，实现高效基因编辑并建立代谢疾病模型。该方法操作简便、重复性好，为肝脏疾病研究提供可靠工具。

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RNC 获得了由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIGMS）资助的南卡罗来纳组织再生与形成生物工程中心试点项目基金、美国肝病研究学会基金会以及美国基因与细胞治疗学会的资助。 &amp;#38; 细胞治疗，资助编号分别为 P30 GM131959、2021000920 和 2022000099。本内容仅由作者负责，不代表美国基因与细胞治疗学会的官方观点 &amp;#38; 细胞治疗或美国肝脏疾病研究学会基金会。示意图显示 图1 由 BioRender.com 制作。

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作者无任何竞争利益需要披露。

本方案中所述的肝细胞分离步骤具有挑战性，需要经过练习才能熟练掌握。从肝脏成功分离肝细胞有几个关键步骤。首先，正确插管下腔静脉对于实现肝脏完全灌注至关重要。灌注后若肝脏未出现褪色，提示导管位置发生移位（表1）。本实验采用下腔静脉进行逆行灌注，因其相比门静脉的顺行灌注更为简便且易于操作17,18。某些方案使用缝线固定导管19；然而，缝合会增加操作复杂性。缝合导管可能导致导管错位，并使其无法调整位置。此外，可在不取出针头的情况下直接在肝脏内完成插管，这可能进一步简化肝脏灌注过程。当针头仍在静脉内时，无需将泵连接至导管。此外，这种方法还能降低导管意外脱出和形成血栓的风险。将导管尖端以较平的角度插入静脉有助于提高插管成功率。下腔静脉具有多个分支，若导管插入位置错误，将导致灌注进入身体其他部位而非肝脏（表1）。因此，必须将导管置于避开分支的合适位置。不同小鼠之间的血管结构存在轻微差异，因此在插管前应仔细观察静脉，以确定...

肝脏的先天性代谢缺陷病（IMD）是一类遗传性疾病，其特征是肝脏中参与代谢的关键酶缺乏，导致毒性代谢产物的积累。若不进行治疗，肝脏IMD将导致器官衰竭或过早死亡1,2。目前，肝脏IMD患者唯一的根治方法是原位肝移植，但由于供体器官来源有限以及术后免疫抑制治疗带来的并发症，该疗法的应用受到限制3,4。根据器官获取与移植网络（Organ Procurement and Transplantation Network）收集的最新数据，肝移植等待名单上的成年患者中仅有40%至46%能够获得移植器官，而12.3%的患者在等待期间死亡5。此外，所有罕见肝病中仅有5%拥有经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗方法6。显然，肝脏IMD迫切需要新的治疗手段。然而，开发新的治疗方法依赖于合适的疾病模型。
利用体外（in vitro）和体内（in vivo）系统模拟人类疾病，仍是开发有效疗法及研究肝脏先天性代谢疾病（IMDs）病理机制的障碍。获取患有罕见肝病患者的肝细胞十分困难7。动物模型对于理解疾病病理机制以及测试治疗策略至关重要。然而，一个难点在于难以利用携带致死性突变的胚胎建立模型。例如，尝试通过在Jag1基因5′端附近缺失5 kb序列的纯合子胚胎构建Alagille综合征（ALGS）小鼠模型时，导致胚胎早期死亡8。此外，通过胚胎干细胞基因编辑构建小鼠模型可能耗时且耗费资源9。最后，基因突变可能出现在靶组织以外的部位，引入混杂因素，从而妨碍对疾病本身的研究9。体细胞基因编辑可实现对肝组织更便捷的基因操作，并规避使用胚胎干细胞建模所面临的挑战。
电穿孔通过施加高电压电流使细胞膜通透化，从而将CRISPR-Cas9直接递送至细胞核，适用于多种细胞类型，包括对转染技术难以处理的细胞，如人胚胎干细胞、多能干细胞和神经元10,11,12。然而，细胞存活率低是电穿孔可能存在的缺点；优化操作流程可在实现高效递送的同时降低毒性13。最近一项研究证明，将CRISPR-Cas9组分电穿孔导入原代小鼠和人肝细胞是一种高效可行的方法14。ex vivo肝细胞电穿孔有望被用于构建人类肝脏先天性代谢疾病（IMDs）的新小鼠模型。
本方案提供了从小鼠肝脏中分离肝细胞并随后通过电穿孔导入CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物（包含Cas9蛋白与合成的单导RNA（sgRNA））或Cas9 mRNA与sgRNA组合，以实现高水平靶基因编辑的详细分步操作流程。此外，本方案还提供了在CRISPR-Cas9导入新鲜分离的小鼠肝细胞后，定量检测基因编辑效率、细胞活力及功能性的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 8联管 FLEX-FREE 排管，带透明平盖，自然色</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>6孔胶原板</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>一体化荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>模拟旋涡混合器</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART Wide BORE 过滤吸头 1,000 &amp;micro;L</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>蓝色石蜡解剖托盘</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9&quot; × 6.5&quot; x 1/2&quot;+F21</td></tr><tr><td>细胞刮刀/细胞刮棒</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td><td>无热原，无菌</td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 一次性锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>库博医疗</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100毫米，无菌</td></tr><tr><td>一次性培养皿</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35毫米，无菌</td></tr><tr><td>Epoch 微孔板分光光度计</td><td>BioTek Instruments</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛（70 &amp;micro;m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>库博医疗</td><td>61864</td><td>欧洲-地中海阿德森组织镊</td></tr><tr><td>IV导管&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G × 0.75 英寸</td></tr><tr><td>静脉输液器</td><td>巴克斯特</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 小型离心机</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b 装置</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>使用程序 T-028 对小鼠肝细胞进行电穿孔</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Masterflex</td><td>&amp;nbsp;HV-77120-42</td><td>10 至 60 转/分钟；90 至 260 伏交流电</td></tr><tr><td>精密泵管</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 英尺，硅胶</td></tr><tr><td>原代培养板</td><td>康宁生命科学</td><td>353846</td><td>含氮组织培养板</td></tr><tr><td>血清移液管（25 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL，无菌</td></tr><tr><td>T100热循环仪</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific Precision 微处理器控制 280 系列，2.5 L</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP，5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&amp;nbsp;EGFP mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基质</td><td>康宁生命科学</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11885076</td><td>低葡萄糖，丙酮酸</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞维持培养基（MM）</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞铺板培养基（PM）</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>小鼠白蛋白ELISA试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>小鼠/大鼠肝细胞核转染试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>70011-044</td><td>不含钙或氯化镁</td></tr><tr><td>Percoll（聚乙烯吡咯烷酮溶液）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA提取溶液</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>希夫&amp;rsquo;酸性品红-亚硫酸试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td>酚红</td></tr><tr><td>Vybrant MTT 细胞活力检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;灌注液1（pH 7.4，过滤除菌）&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>4℃下稳定 &amp;deg;2 个月，4 ℃</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14155063</td><td>定容至 200 mL</td></tr><tr><td>EGTA（0.5 M）</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>HEPES（pH 7.3，1 M）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;灌注液2（pH 7.4，滤膜除菌）&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>4℃下稳定 &amp;deg;2 个月，4 ℃</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0（1.8 mM）</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 &amp;micro;1 M 储液的升数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS（无钙、无镁、无酚红）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>定容至 200 mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0（0.8 mM）</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 &amp;micro;1 M 储备液的升数</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;灌流液 3&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>使用前新鲜配制</td></tr><tr><td>溶液2</td><td></td><td></td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>罗氏</td><td>5401127001</td><td>0.094 Wunsch 单位/毫升</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;小鼠麻醉混合剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromzine</td><td></td><td></td><td>0.25 mg/mL 终浓度</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td></td><td></td><td>7.5 mg/mL 终浓度</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td></td><td></td><td>1.5 mg/mL 最终浓度</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;URL&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIDE：通过分解法追踪插入缺失突变</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

电穿孔介导的cas9核糖核蛋白和mrna递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

本方案描述了一种快速高效分离原代小鼠肝细胞并随后通过电穿孔介导递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNPs）和mRNA的方法。采用三步逆行灌注法分离原代小鼠肝细胞，每只肝脏可获得高达50 × 106个细胞，细胞活力达&#62;85%。本方案提供了肝细胞铺板、染色和培养的详细操作步骤。实验结果表明，通过绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞比例测定，电穿孔转染效率高达89%，且小鼠肝细胞保持适度的细胞活力，达&#62;35%。
为验证该方法的实用性，将靶向羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的 CRISPR-Cas9 体系通过电穿孔导入小鼠原代肝细胞，作为概念验证实验，旨在通过基因编辑破坏与肝源性遗传性代谢病（IMD）相关的治疗靶基因。结果显示，核糖核蛋白复合物（RNP）组的靶向编辑效率达到78%，高于mRNA组的47%。随后对肝细胞功能进行了评估 体外 使用白蛋白检测法表明，以核糖核蛋白复合物（RNPs）和mRNA形式递送CRISPR-Cas9在原代小鼠肝细胞中具有相当的细胞活力。该方案的一个有前景的应用是构建用于研究影响肝脏的人类遗传性疾病的鼠标模型。

从肝脏中分离可培养的原代肝细胞 
肝脏灌注与肝细胞分离的整体流程如图所示 图1. 本实验使用野生型、8-10周龄的C57BL/6J小鼠。该操作预计可获得20-50 × 106 每只小鼠细胞数，细胞活力介于85%至95%之间。若活力低于此范围，则 &lt;70% Percoll 处理应被用于去除死细胞。 freshly isolated hepatocytes 应接种于 I 型胶原蛋白包被或含氮组织培养板上。接种后 3–12 小时内，肝细胞应贴附于培养板，24 小时内细胞形态呈现典型的多边形或六边形外观。图2）。肝细胞是肝脏中唯一以糖原形式储存葡萄糖的细胞。为验证分离细胞的纯度，铺板后24 h采用过碘酸-雪夫试剂进行糖原染色。染色后的肝细胞胞质呈洋红色（图3).
将 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物和 mRNA 电穿孔转染...

本方案描述了从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，并通过电穿孔将CRISPR-Cas9以核糖核蛋白复合物和mRNA形式导入细胞，以破坏与遗传性肝代谢疾病相关的治疗靶基因的技术。所述方法在电穿孔后可实现高细胞存活率和高效的基因修饰水平。

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

本方案描述了一种快速高效分离原代小鼠肝细胞并随后通过电穿孔递送CRISPR-Cas9的方法……

本技术的主要优势在于，它是一种简便、快速且可重复的方法，可用于编辑原代小鼠肝细胞中的基因，从而构建体外和体内疾病模型。利用本技术，有可能在分离的肝细胞中敲低目标基因后，将其移植回患者体内，以基因编辑的肝细胞替代病变细胞。经验不足的研究人员可能在插管以及整个灌注过程中保持导管稳定方面遇到困难。建议使用者在开始实验前仔细阅读并练习相关操作步骤及故障排除方法。肝脏灌注和肝细胞分离操作将由临床设施经理蒂娜·帕克（Tina Parker）和研究生研究助理伊莱达·阿特斯（Ilayda Ates）进行演示。电穿孔实验步骤将由我实验室的研究生研究助理卡莉·斯图尔特（Callie Stuart）进行演示。在达到外科麻醉深度的麻醉状态下。使用剪刀在腹部皮肤上做一个U形的侧向切口，然后从两侧扩大切口。继续将皮肤切口向肋骨区域打开。用剪刀剪开腹膜，暴露直至肋骨区域的腹腔。注意不要损伤任何器官。使用镊子的背面或剪刀的钝面将肠管移至右侧。辨认门静脉和下腔静脉。启动泵，使预热的灌注液通过导管冲洗。停止泵并移除导管。然后将连接导管的针头尖端以与静脉呈10至20度的角度插入下腔静脉，随后将针头从导管中取出。然后以与静脉平行的方向轻柔地将导管推入静脉。将管路连接到导管，注意不要使导管进一步进入静脉。以每分钟2 mL的流速启动泵。观察肝脏是否立即变苍白，以此作为灌注成功的标志。使用剪刀剪断门静脉。逐渐将流速增加至每分钟5毫升。当灌注液三流经肝脏时，需仔细监测肝脏的弹性。为判断肝脏是否已软化，可用棉签或镊子轻轻按压肝脏，观察是否在肝脏表面形成压痕。注意避免过度灌注，以防细胞活力丧失。当灌注液三约30至50毫升流过肝脏并使其变软后，停止泵送，移除导管和胆囊，注意不要洒出其内容物。然后仔细解剖肝脏。将肝脏放入含有冰冻的含10% FBS的DME M培养基的100毫米培养皿中。轻轻晃动培养皿以去除可能的血凝块。将肝脏转移至另一个含有冰冻的含10% FBS的DME M培养基的新培养皿中。为了从肝包膜中释放细胞，将培养皿置于冰上，然后使用两把无菌镊子，轻轻撕开所有肝叶的肝包膜。用细胞刮棒在培养基中轻轻搅动肝脏，以释放肝细胞。持续此操作，直至肝脏组织变得非常细小，且悬液呈现棕褐色并变得不透明。将肝脏组织残余物从培养皿中移除，使用设置为低速的25毫升血清移液管，小心地将细胞悬液转移至预冷于冰上的50毫升锥形管中，该锥形管配有100微米细胞筛网。向培养皿中加入新鲜的冰冻DMEM加10% FBS培养基，以冲洗并收集表面残留的细胞，随后转移至50毫升锥形管中。重复此步骤直至收集所有细胞。为洗涤并从非实质细胞中纯化肝细胞，将收集于50毫升锥形管中的细胞在4°C条件下以50 RCF离心5分钟，离心时采用低减速模式或不设刹车。弃去含有碎片和非实质细胞的上清液。然后轻轻旋转离心管，用残留的上清液重新悬浮沉淀。沉淀重悬后，加入3

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送到新鲜分离的初级小鼠肝细胞中

本文详细介绍了利用微电极阵列（MEA）在贴壁哺乳动物细胞培养物中进行siRNA随机序列位点特异性转染的实验方案。...

使用微电极阵列（MEA）对贴壁细胞进行高效、位点特异性siRNA转染

基于转座子的整合载体经水动力尾静脉注射可实现小鼠肝细胞的稳定转染 体内...

组成型与诱导型基因表达系统 体内 通过水动力尾静脉注射法修饰小鼠肝细胞

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统为基因工程提供了有力工具，并实现了外源基因的靶向整合。本文描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的高效DNA靶向整合策略 体内...

CRISPR/Cas9介导的靶向整合 体内 使用基于同源介导末端连接的策略

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

本文介绍了一种分离健康且具有功能的小鼠原代肝细胞的实验方案。同时提供了利用非放射性标记底物检测肝脏新生蛋白质合成的方法，以帮助理解肝脏在能量代谢稳态背景下蛋白质合成的相关机制。...

通过非放射性L-叠氮高丝氨酸标记法分离原代小鼠肝细胞用于新生蛋白质合成分析

本文介绍了一种利用电穿孔管对哺乳动物细胞进行高效CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑的实验方案。...

通过电穿孔转染CRISPR/Cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。...

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

本文介绍了一种单细胞电穿孔技术方案，可用于在不同体外培养年龄的海马脑片中，向兴奋性和抑制性神经元递送基因。该方法可实现单个细胞中基因的精确且高效的表达，可用于研究细胞自主性及细胞间功能。...

小鼠海马兴奋性及类别特异性抑制性神经元在不同脑片培养体系中的单细胞电穿孔

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外...

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

本方案描述了使用“DMF-ection”（一种数字微流控（DMF）电穿孔平台）对原代人T细胞中的TCRα/β受体进行微型化的CRISPR–Cas9基因组编辑。该方法可实现并行、低样本输入的高效基因编辑，并保持高细胞活力，还可进一步适用于将mRNA递送至多细胞3D球状体。...

一种用于悬浮T细胞和三维细胞模型中低量CRISPR基因组编辑与mRNA转染的数字微流控电穿孔平台

学习利用电穿孔技术将CRISPR-Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的原代小鼠肝细胞，实现高效基因编辑并建立代谢疾病模型。该方法操作简便、重复性好，为肝脏疾病研究提供可靠工具。

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

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