Name: 海马神经元培养检测和研究自身免疫性脑炎中涉及的新型致病抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习利用海马神经元原代培养技术检测自身免疫性脑炎患者样本中的致病性抗体。该方法通过免疫荧光成像区分细胞表面与胞内抗原反应性，为神经免疫学诊断提供可靠方案。

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我们感谢Merche Rivas、Maria Marsal、Gustavo Castro、Jordi Cortés、Alina Hirschmann和Angel Sandoval（ICFO-光子科学研究所）以及Mercedes Alba、Marija Radosevic、David Soto、Xavier Gasull、Mar Guasp和Lidia Sabater（巴塞罗那大学巴塞罗那临床医院IDIBAPS）在技术支援和试剂提供方面的帮助，感谢Josep Dalmau和Myrna R. Rosenfeld（巴塞罗那大学巴塞罗那临床医院IDIBAPS）对稿件的审阅和指导。本研究由西班牙卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III, ISCIII）资助，并由欧洲联盟和FIS（PI20/00280，J.P.）共同资助，同时获得Fundació CELLEX（P.L-A.）以及西班牙经济与竞争力部—卓越研究中心Severo Ochoa计划&amp;#38;D（CEX2019-000910-S，P.L-A.）；CERCA 计划与 Laserlab-Europe（871124，P.L-A.）；科学与创新部（MCIN/AEI/10.13039/501100011033，P.L-A.）；以及欧洲社会基金（PRE2020-095721，M.C.）。

所有实验程序均经巴塞罗那大学当地伦理委员会批准，符合欧洲关于实验动物使用与护理的法规（2010/63/UE）。已从患者处获得书面知情同意，且本研究使用人类样本的部分已获当地机构审查委员会批准（Hospital Clínic，HCB/2018/0192）。
注意：本实验方案包含三个部分。第一部分用于建立神经元培养，第二部分用于利用活神经元培养检测表面抗体，第三部分用于确定这些抗体的致病性。
第一部分：分离的胎鼠海马神经元培养物的建立
1. 准备步骤
<ol>
	<li>培养表面的多聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine）包被（解剖前3天）
	<ol>
		<li>通过将2.38 g硼酸和1.27 g硼砂加入500 mL蒸馏水中，搅拌15分钟至完全溶解，制备硼酸盐缓冲液。在通风橱内，用滤膜（0.2 µm孔径）过滤缓冲液以灭菌，贴标签后室温（RT）保存。 
		注意：该溶液稳定，可使用6个月。 
		注意：配制硼酸盐缓冲液时，请穿戴推荐的个人防护装备。</li>
		<li>通过将1 g多聚-L-赖氨酸（PLL）加入10 mL蒸馏水中并搅拌至溶解，制备PLL储存液（100 mg/mL）。将PLL储存液分装为500 µL每份。为获得终浓度1 mg/mL的溶液，取500 µL PLL分装液加入50 mL硼酸盐缓冲液中，轻轻旋转混匀至溶解，并通过过滤（0.2 µm孔径）灭菌。 
		注意：该溶液稳定，可使用6个月。</li>
		<li>准备用于包被的表面。免疫染色实验使用直径12 mm的盖玻片，活神经元成像研究使用玻璃底培养皿。若使用盖玻片，需先高压灭菌，然后将五片盖玻片放入每个培养皿（直径3.5 cm）中。 
		注意：盖玻片的厚度会影响所获取图像的信号质量和强度。大多数显微镜物镜设计适用于#1.5规格的盖玻片。请根据成像设备和实验技术选择合适的盖玻片。</li>
		<li>在通风橱内，向每个培养皿（玻璃底培养皿或含五片盖玻片的3.5 cm培养皿）中加入1.5 mL PLL溶液。确保所有盖玻片均被浸没，并在室温下放置24小时。</li>
		<li>解剖前2天，吸除PLL溶液，用无菌无内毒素水清洗，确保盖玻片完全浸没。在培养皿中保留水，并于室温下继续存放24小时。</li>
		<li>解剖前1天，吸除水，更换为NB + B27培养基（见下文），并将培养皿置于37 °C培养箱中孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基与储存液的配制（解剖前1天）
	<ol>
		<li>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）：向500 mL不含L-谷氨酰胺和酚红的高糖DMEM（4.5 g/L）中，加入50 mL马血清、50 mL胎牛血清（FBS）、10 mL L-谷氨酰胺（200 mM）、10 mL丙酮酸钠（100 mM）和10 mL青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）。过滤（0.2 µm孔径）后分装为5 mL每份，盖紧瓶盖，4 ᵒC保存。 
		注意：该溶液稳定，可使用1个月。</li>
		<li>添加B27的Neurobasal培养基（NB + B27）：向50 mL不含酚红的Neurobasal培养基中加入1 mL B27添加剂。</li>
		<li>添加B27的Hibernate-E培养基（Hibernate + B27）：向50 mL Hibernate-E培养基中加入1 mL B27添加剂。</li>
		<li>细胞外生理溶液（EPS）：向1 L无菌水中加入以下成分至指定终浓度：NaCl（140 mM）、KCl（3.5 mM）、HEPES（10 mM）、葡萄糖（20 mM）和CaCl2（2 mM）。搅拌至完全溶解，用NaOH（0.5 M）或HCl（0.5 M）调节pH至7.4。在通风橱内过滤灭菌（0.2 µm孔径），4 ᵒC保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仪器及其他实验材料准备（解剖当天）
	<ol>
		<li>将水浴锅预热至37 °C。加热以下分装液：50 mL HBSS和5 mL DMEM。</li>
		<li>将以下器械浸入盛有无水乙醇的烧杯中进行灭菌（图1B）：镊子、弯头镊、剪刀、精细弯头镊、精细直头镊、手术剪、精细角头镊和精密弹簧剪。 
		注意：为保护器械，建议在烧杯底部放置软性材料（如科学级擦拭纸）。</li>
		<li>准备两个冰盘，并放置以下物品。
		<ol>
			<li>冰盘1（图1C）：将手术器械置于盛有无水乙醇的烧杯中，另备一个盛有HBSS的烧杯用于冲洗手术器械，一个直径10 cm的培养皿盛HBSS用于放置胚胎，一个直径6 cm的培养皿盛HBSS用于放置胚胎头部，以及一个直径6 cm的培养皿盛Hibernate + B27用于放置胚胎脑组织。</li>
			<li>冰盘2：放置1 mL 2.5%胰蛋白酶分装液和一个盛有Hibernate + B27的3.5 cm培养皿，用于存放已解剖的海马体。 
			&#8203;注意：该步骤所需时间取决于操作者的经验及待解剖胚胎数量。因此，冰块必须维持足够长时间的冻结状态。建议使用聚苯乙烯材质的冰盘。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 解剖与接种（图1）
<ol>
	<li>海马体分离 
	注意：根据巴塞罗那大学当地伦理委员会的规定，并遵循欧洲关于实验动物使用与护理的法规（2010/63/UE），在本方案开始前立即对妊娠18天（E18）的大鼠实施安乐死。本方案中使用二氧化碳（CO₂）2采用吸入法实施安乐死。
	<ol>
		<li>使用镊子和剪刀在腹膜水平解剖大鼠。取出带有E18胚胎的子宫，置于预先在冰上预冷的10 cm培养皿中。 
		注意：应避免大鼠毛发附着到胚胎上。建议使用大量70%乙醇对腹部进行消毒。从本步骤开始，所有操作均需在冰盒1中的超净台内进行。</li>
		<li>打开胚囊，将胚胎转移至含有HBSS的10 cm培养皿中，确保胚胎完全浸没。</li>
		<li>用剪刀移除胚胎头部，并将其放入含有HBSS的6 cm培养皿中。对所有胚胎重复此操作。 
		注意：为避免污染，除胚胎头部外的所有组织均应弃置于带螺旋盖的容器中。</li>
		<li>用精细弯镊夹住胚胎头部，再用一对精细直镊以45°角刺入眼眶，随后松开精细弯镊。 
		注意：镊子不得穿过脑组织，因此进入时保持角度至关重要。</li>
		<li>使用手术剪从枕骨开始向前额骨方向解剖皮肤和颅骨。用精细弯镊取出脑组织，放入含有Hibernate + B27的6 cm培养皿中。重复此操作，直至所有脑组织均被采集。</li>
		<li>使用精细直镊将端脑沿矢状方向分离。 
		注意：从这一步开始，海马体的解剖需在体视显微镜下进行。建议使用可调节的照明灯，使光线从侧面照射解剖表面。同时建议使用黑色背景，以提供更高的对比度，便于更清晰地辨识海马体。</li>
		<li>在10 cm培养皿中，每隔1 cm滴加一滴Hibernate + B27（例如呈圆形排列）。每滴中放置一个端脑，并通过解剖显微镜观察（建议使用1.25倍物镜放大倍数）。</li>
		<li>小心剥离脑膜并移除丘脑，以更清楚地观察海马体。</li>
		<li>使用精密弹簧剪解剖海马体，并将其置于含有 Hibernate + B27 的3.5 cm培养皿中，放置于冰盒2内。对每个端脑重复此操作，直至收集完所有海马体。</li>
		<li>用巴氏吸管小心收集所有海马体，并转移至50 mL离心管中。 
		注意：收集海马体时，使用 Hibernate + B27 的最小体积，以免稀释胰蛋白酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞解离
	<ol>
		<li>海马体的酶解离
		<ol>
			<li>在含有海马体的50 mL离心管中，加入1 mL 2.5%胰蛋白酶，并用HBSS定容至5 mL。于37 °C水浴中孵育15分钟。</li>
			<li>为稀释胰蛋白酶，加入10 mL预热的HBSS，在37 °C水浴中孵育5分钟。</li>
			<li>将此时呈黏液状的海马体用1,000 µL移液器转移至50 mL离心管中，加入6 mL预热的HBSS，于37 °C水浴中孵育5 min。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>海马体的机械分离
		<ol>
			<li>将组织转移至带有锥形底部的2 mL离心管中，尽量减少液体体积。加入1 mL预热的DMEM培养基。使用1,000 µL移液器轻轻反复吹打，使沉淀充分匀浆。 
			注意：吸取时应避免产生气泡，因为气泡可能导致细胞裂解。</li>
			<li>用预拉制的玻璃移液管（上下吹打10至20次），使管尖接触试管锥形底部。避免产生气泡。此步骤结束时，混合液必须呈半透明状。</li>
			<li>一旦混合均匀至呈半透明状，立即将混合物转移至含有4 mL 37 °C DMEM培养基的离心管中，并使用玻璃移液管反复吹打混匀。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>计数细胞。可根据标准实验室操作规程对溶液中的神经元数量进行计数。 
		注意：在用于抗体检测和钙活性成像的实验中，每3.5 cm培养皿接种50,000个细胞为最佳浓度。</li>
		<li>保持细胞悬浮状态，吸取计算好的体积，接种于含有PLL包被盖玻片的3.5 cm培养皿或PLL包被的玻璃底培养皿中。</li>
		<li>通过轻轻交叉晃动培养皿（先前后，再左右；根据需要重复）使细胞均匀分布，并将培养皿放入 CO₂ 培养箱中2 (5%) 培养箱 
		注意：使用交叉移动方式至关重要，以避免细胞沉降在培养皿的边缘区域。</li>
		<li>每周添加约 1 mL NB + B27，以防止培养物干燥。 
		注意：14天后（2周） 体外 [div]），神经元已成熟，并表达所有可用于实验的因子。采用本方案获得的神经元总数平均约为 2.5 x 106 来自每只孕鼠平均12个E18胚胎的神经元</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
 
&#160; &#160; 
第二部分：利用海马神经元培养物检测神经元细胞表面蛋白中的抗体
&#8203;注意：本实验方案部分展示了如何利用海马神经元培养物检测抗NMDAR脑炎患者血清和/或脑脊液中的抗NMDAR抗体。通过荧光免疫染色法可观察活神经元中的抗体反应性，但也可采用其他可视化方法。本实验的适当对照应为健康个体的血清或脑脊液。使用人源样本时，需注意可能需要获得机构伦理委员会的批准。
3. 活细胞荧光免疫染色
<ol>
	<li>使用在盖玻片上培养的14个div细胞（每3.5 cm培养皿中接种50,000个细胞，含五张盖玻片）。</li>
	<li>在超净台内，用预热至37 °C的NB缓冲液清洗盖玻片。</li>
	<li>加入样本，本实验中为抗NMDAR抗体（作为一抗），用NB培养基按血清1:200或脑脊液1:2的比例稀释，于37 °C孵育1小时（置于含5% CO2的培养箱中）。</li>
	<li>在室温下用PBS小心清洗3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入固定液（PBS中含4%甲醛），室温孵育5分钟。 
	警告：操作4%甲醛时，应在超净台内进行，并佩戴推荐的个人防护装备。</li>
	<li>用PBS清洗3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入二抗山羊抗人IgG-AF488，按1:1000稀释，室温避光孵育1小时。 
	注意：孵育过程中需用铝箔包裹以避免光照。</li>
	<li>用PBS清洗3次，每次5分钟。随后用去离子水冲洗。</li>
	<li>用液体封片剂（例如含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，约7 µL）封片，吸去多余液体后用去离子水冲洗。神经元现可进行荧光成像。 
	警告：操作封片剂时，应佩戴推荐的个人防护装备。</li>
</ol>
 
&#160; &#160;
第3部分：使用钙成像技术演示抗体的致病效应
注意：本实验方案部分旨在演示如何确定患者体内的抗体是否对培养细胞产生功能性影响，从而提示其致病性。为了增强效应的显著性，使用了来自八名患者的脑脊液混合样本。通过化学刺激（NMDA + 甘氨酸）后，利用GECI荧光钙离子指示剂（GCaMP5G）记录活体培养细胞的钙离子活性。这些研究需要配备细胞培养腔的倒置荧光显微镜，以维持神经元所需的生理条件。
4. 钙成像
<ol>
	<li>使用在盖玻片上培养的14-18代细胞（每个3.5 cm培养皿接种50,000个细胞，放置五张盖玻片）</li>
	<li>成像前1周，向细胞中加入病毒载体pAAV2-CAG-GCaMP5G（浓度为2.5 × 1010 GC/mL），孵育5-7天。 
	注意：该商业化预包装的AAV2型病毒载体在CAG启动子驱动下过表达基因编码的钙离子指示剂GCaMP5G。</li>
	<li>成像前1天，加入患者样本（本示例中为用NB + B27以1:25稀释的脑脊液混合液），孵育24小时。使用前务必对人源样本进行过滤（0.2 µm孔径），以避免污染。 
	注意：本研究中需平行运行健康受试者的对照脑脊液样本。</li>
	<li>成像当天，准备成像系统，将显微镜细胞培养室温度设为37 °C，槽道中加入蒸馏水，并通入5% CO2，以维持细胞生理状态。</li>
	<li>在生物安全柜中，用3 mL预热至37 °C的EPS缓冲液清洗第3步的细胞</li>
	<li>向细胞中加入2.45 mL EPS缓冲液覆盖，并转移至显微镜细胞培养室。加入NBQX（10 µM）以阻断AMPA和KA受体，从而特异性观察NMDA受体反应。</li>
	<li>在配备汞灯和FITC滤光片组的倒置荧光显微镜下，以每100 ms采集一帧的速度记录2分钟的视频（记录自发活动）。 
	注意：本实验使用20倍NA 0.75的干镜物镜，通过&#160;sCMOS相机以每100 ms采集一幅图像（512 × 512像素，16位灰度）。</li>
	<li>以每100 ms采集一帧的速度记录第二段4分钟的视频。在开始采集后不久，向培养皿中加入刺激溶液（NMDA [100 µM] + 甘氨酸 [1 µM]）。 
	注意：向培养皿中添加液体可能引起湍流，从而干扰成像条件（如焦距、荧光强度和/或非特异性背景信号）。为降低此类干扰的发生概率，向已装有2.5 mL液体的培养皿中添加的溶液体积不得超过50 µL。</li>
	<li>使用图像处理软件（本实验使用ImageJ），提取经刺激后分别与患者和对照脑脊液样本共孵育的细胞培养物中的荧光信号随时间变化的数据。 
	注意：GCaMP探针在结合游离钙离子后会发生构象改变，导致荧光增强。因此，荧光强度的增加反映了因神经元去极化引起的钙离子内流。</li>
	<li>确定待分析的兴趣区域（ROI）。手动勾画神经元胞体，并将ROI添加至ROI管理器（分析 &#62; 工具 &#62; ROI管理器 &#62; 添加）。从ROI管理器菜单中保存ROI（更多 &#62; 保存）。</li>
	<li>设置测量参数（分析 &#62; 设置测量值），选择平均灰度值。点击更多 &#62; 多重测量，提取细胞胞体的平均荧光强度曲线，并将生成的数据表保存为.xls格式的电子表格。</li>
	<li>进行统计学分析，比较不同组别（患者脑脊液 vs. 对照脑脊液）之间的荧光强度差异。</li>
</ol>

<ol><li>Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+synaptic+receptors+and+neuronal+cell+surface+proteins+in+autoimmune+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).</li>
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</ol>

作者无利益冲突。

抗体介导的自身免疫研究领域日益发展，为发现可用于改善患者诊断与治疗的神经元自身抗体提供了重要契机。海马神经元培养是鉴定抗体的重要工具，因此，采用标准化操作流程以获得可靠且可重复的结果至关重要。本文讨论了该过程中需重点关注的关键步骤、局限性以及常见问题的解决方案。
该方案的关键步骤可根据其对海马神经元纯度、均一性或活性的影响，分为三类。
纯度&#160;—为了获得最佳的原代细胞培养，研究者必须具备信心、经过训练并能够快速操作，尤其是要尽量缩短解剖时间。尽管锥体神经元是主要的细胞类型，海马体中仍包含多种中间神经元14。为了获得胶质细胞最少的培养物，必须尽可能去除周围组织，仅提取海马体。在解剖过程中使用黑色背景有助于在体视显微镜下识别海马体的边界。此外，还应考虑到，较低的细胞密度会导致旁分泌支持减少，从而更难维持培养13。因此，保持这种平衡至关重要。这一点在使用较少细胞数量（每3.5 cm培养皿50,000个神经元）的成像研究中尤为重要。为了获得更充裕的海马体提取时间，应使用可保存组织活性的Hibernate培养基17。使用合适的外科工具也至关重要。高精度工具较为精密，因此应妥善保护，以确保技术的可重复性。
均一性&#160;— 为建立无细胞聚集体的培养体系，机械性细胞解离方法已得到改进，通过结合使用预拉制的玻璃移液器与标准的1,000 µL移液器实现。
存活率&#160;— 在本实验方案中，未添加任何抗生素，因为抗生素会影响神经元的兴奋性，并改变培养神经元的电生理特性18。因此，若未严格维持无菌操作的最高标准，则极有可能发生污染。温度也是一个关键因素。在海马体分离过程中保持组织低温，可减缓代谢活动，减少细胞降解。因此，组织在细胞解离前始终置于冰上保存。此外，在酶解法细胞解离过程中，必须找到适当的平衡，既要使细胞充分解聚，又要避免明显的细胞裂解。在本方案中，胰蛋白酶孵育时间以及后续洗涤步骤的时间均已优化，以获得足够分散的单个细胞，为形成适当的神经元网络提供充足的空间。
在神经元培养物的荧光活细胞免疫染色和钙活性记录中也存在关键步骤。为了成功进行活细胞免疫染色以检测患者样本中针对细胞表面蛋白的抗体，必须避免细胞通透化，否则抗体会进入细胞内并与胞内蛋白结合。此外，应根据抗体的滴度相应调整孵育时间和样本稀释比例（例如，滴度过高可能导致背景染色，从而难以解读结果）。在利用钙成像评估自身抗体致病性时，需使用适合细胞活性检测的培养基（例如，培养基中镁离子（Mg2+）的抑制对获得良好实验效果至关重要）。此外，进行荧光成像时应避免使用含有pH指示剂（如酚红）的培养基，因其会引入非特异性背景信号。
使用海马神经元培养存在两个主要局限性。首先，与稳定细胞系相比，原代培养需要持续制备，这意味着必须定期使用实验动物。诱导性多能干细胞（iPSC）系有可能替代动物模型的使用，但目前iPSC的分化方案仍不完善。其次，由iPSC衍生的神经元不表达全套的表面蛋白，因此，若使用此类细胞，缺乏反应性并不一定意味着样本为阴性19。
目前有三种方法可用于筛查疑似自身免疫性脑炎（AE）患者血清或脑脊液中是否存在自身抗体：使用大鼠脑组织的组织法检测（TBA）、使用转染表达神经元蛋白的HEK细胞的细胞法检测（CBA），以及本文所报道的利用海马神经元活体培养的方法19。培养海马神经元方法的重要性在于其能够区分针对细胞表面抗原和细胞内抗原的免疫反应，而这类区分在TBA中难以实现。此外，与转染HEK细胞的CBA不同，原代神经元培养不受转染蛋白种类的限制。另外，将培养的海马神经元与免疫沉淀和质谱分析相结合，可用于鉴定新型抗体及其靶抗原，从而拓宽可识别抗体的范围。最后，该方法还可通过活细胞成像技术评估自身抗体的致病效应，实时监测细胞活动的变化。总之，新自身抗体的鉴定最终有助于启动特异性免疫治疗，从而改善患者的预后。

自身免疫性脑炎（AE）是一类新近发现的中枢神经系统（CNS）疾病，由靶向神经元表面或突触蛋白的抗体介导1,2。其临床表现因抗体类型而异，但通常包括记忆和认知功能障碍、行为改变及精神症状、异常运动、睡眠障碍、意识水平下降以及癫痫发作。这类疾病可影响所有年龄段的个体，其中某些类型的AE主要累及儿童和年轻成人2。
在过去15年中，已描述了17种针对特定神经元表面/突触蛋白抗体的自身免疫性脑炎（AE）综合征（表1）。一些神经元靶点的例子包括突触兴奋性受体NMDAR3,4和AMPAR5、突触抑制性受体GABAbR6、神经元分泌蛋白LGI17以及细胞黏附分子IgLON58。对于大多数这类AE，研究显示抗体可破坏其靶抗原的结构或功能，有力支持其致病作用。例如，在抗NMDAR脑炎中，抗体与NMDAR的GluN1亚基的N端结构域发生反应，导致这些受体发生选择性且可逆的内化，从而引起显著的神经精神功能障碍4,9,10,11。因此，在患者血清或脑脊液中检测到这17种已知抗体中的任何一种，均可作为诊断试验，确立特定AE的诊断。
用于鉴定和表征这些抗体的技术中，较为常用的一种是利用分离的胎鼠海马神经元培养。此类培养物具有多个优势：胚胎脑组织易于解离，且胶质细胞含量较低，而胶质细胞是神经元培养中最主要的污染来源12；与其他中枢神经系统区域相比，海马区的细胞群体相对均一，其中锥体细胞占绝大多数13,14；培养物取自发育晚期胚胎，此时锥体神经元的生成已基本完成，而颗粒细胞尚未发育，进一步提高了培养物的均一性；在体外培养条件下，锥体神经元可表达其大部分主要表型特征，能够形成充分发育的树突，并建立具有突触连接的神经网络，可用于结构和电生理学研究12,13；由于抗体无法穿透活神经元，因此使用活体培养物有助于识别位于细胞表面的抗原靶点；此外，通过从神经元培养物中免疫沉淀抗体-抗原复合物，可进一步鉴定目标抗原5。
采用神经元培养的研究成功与否在很大程度上取决于培养物的质量以及用于评估患者血清或脑脊液（CSF）免疫反应性的实验方案。可能影响培养效果的因素包括：培养前分离海马组织的操作步骤、组织的解离方法、接种密度、所用生长表面以及培养基的组成13,15,16。本文提供了一种优化的原代细胞培养方案，结合荧光免疫染色技术，用于培养胎鼠海马神经元，以检测针对已知自身免疫性脑炎（AE）抗原及潜在新发细胞表面靶点的抗体。此外，本文还举例说明了如何利用表达GCaMP家族钙指示蛋白GCaMP5G的培养海马神经元，通过活细胞成像技术来研究NMDAR抗体的致病效应。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶蛋白</td>
			<td>蛋白功能</td>
			<td>细胞定位</td>
			<td>主要综合征</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDAR</td>
			<td>离子通道</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>抗NMDAR脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPAR</td>
			<td>离子通道</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>边缘性脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluK2</td>
			<td>离子通道</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABAaR</td>
			<td>离子通道</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABAbR</td>
			<td>代谢型受体</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>边缘性脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGluR1</td>
			<td>代谢型受体</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGluR2</td>
			<td>代谢型受体</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGluR5</td>
			<td>代谢型受体</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2R</td>
			<td>代谢型受体</td>
			<td>突触蛋白</td>
			<td>基底节脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LGI1</td>
			<td>黏附分子</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>边缘性脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASPR2</td>
			<td>黏附分子</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>边缘性脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgLON5</td>
			<td>黏附分子</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>抗IgLON5病</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurexin-3α</td>
			<td>黏附分子</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNER (Tr)</td>
			<td>跨膜蛋白</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEZ6L</td>
			<td>跨膜蛋白</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphiphysin</td>
			<td>结构分子</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>边缘性脑炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPX</td>
			<td>肽酶</td>
			<td>细胞表面蛋白</td>
			<td>脑炎</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：神经元细胞表面及突触蛋白抗体。

<table><tbody><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Nunc</td><td>12-565-020</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 圆形盖玻片</td><td>Fisher</td><td>NC9708845</td><td></td></tr><tr><td>20x NA 0.75 S Fluor 干镜物镜</td><td>Nikon</td><td>CFI Super Fluor 20X</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 细胞培养皿</td><td>Nunc</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 细胞培养皿</td><td>Nunc</td><td>12-565-94</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 烧杯</td><td>Pirex</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>硼砂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>FST</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖（4.5 g/L），不含 L-谷氨酰胺，不含酚红</td><td>Capricorn</td><td>DMEM-HXRXA</td><td></td></tr><tr><td>雌性Wistar大鼠（妊娠18天）</td><td>Janvier</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>尖角镊子</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>细弯镊</td><td>FST</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>细直镊</td><td>FST</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>FITC 滤光片组</td><td>Nikon</td><td>Standard Series</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Capricorn</td><td>HBSS-1A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-E 培养基</td><td>Gibco</td><td>A12476-01</td><td></td></tr><tr><td>马血清（HS）</td><td>Thermofisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>人抗NMDAR抗体（脑脊液）</td><td>患者样本</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>人抗NMDAR抗体（血清）</td><td>患者样本</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.50i</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44675</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biowest</td><td>X0550-100</td><td></td></tr><tr><td>汞灯</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>显微镜用细胞培养腔室</td><td>定制</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Tocris</td><td>373</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的Neurobasal培养基</td><td>Gibco</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-CAG-GCaMP5G</td><td>VectorBiolabs</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Thermo scientific</td><td>J199943-K2</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸（PLL）</td><td>Peptide international</td><td>OKK-35056</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯冰盒</td><td>-</td><td>-</td><td>重复使用的聚苯乙烯盒盖</td></tr><tr><td>精密弹簧剪</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>Molecular Probes</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Biowest</td><td>L0642-100</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>FST</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>无菌无内毒素水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测和研究自身免疫性脑炎中新型致病性抗体的海马神经元培养

Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis

在过去的15年中，一类新的中枢神经系统（CNS）抗体介导性疾病被逐步阐明，并被定义为&#34;自身免疫性脑炎&#34;（AE）。目前已知有17种AE综合征，均与针对神经元细胞表面或突触蛋白的抗体相关。其临床表现复杂，且随相关抗体类型的不同而有所差异。其中最广为人知的是抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）脑炎，这是一种以严重记忆障碍和行为异常为特征的显著神经精神疾病。相关抗体靶向作用于NMDAR的GluN1亚基N端结构域。目前用于发现和表征AE抗体的主要方法包括培养分离的胎鼠海马神经元。在抗体表征过程中，将活体培养的神经元暴露于患者的血清或脑脊液（CSF）中，若检测到反应性，则提示该患者血清或脑脊液样本中含有针对神经元表面抗原的抗体。海马神经元培养还可用于评估患者体内的抗体是否具有潜在致病性，即通过观察其是否引起神经元结构或功能的改变。此类研究的成功程度取决于培养物的质量以及获取和检测患者样本反应性的实验方案。本文提供了一种优化的原代培养胎鼠海马神经元的方法，并结合免疫染色技术，用于检测患者血清或脑脊液中是否存在抗体。同时，还展示了如何利用培养的神经元和钙成像技术来评估NMDAR抗体潜在致病效应的示例。

分离的胎鼠海马神经元培养物的建立 
本文所述方案基于 Banker 和 Goslin 在神经细胞培养领域具有重要影响的研究。15该方案已优化，可用于获得形态、密度和纯度均适宜进行神经元表面抗体检测研究的神经元培养物。解剖与接种方案分为三个部分（图1A）。第一部分为海马体分离，包括活体组织的手术取出（图1A，左侧面板）。如图所示，妊娠第18天（E18）胚胎的Wistar大鼠是成功培养的关键起始材料。从E18胚胎中取出脑组织后，在体视显微镜下进行显微手术。使用适当的工具（图1B）并进行精确操作，即可将海马体从其余神经组织中分离出来。特定培养基中组织的放置方式如图所示。 图1C第二部分实验方案包括海马细胞的解离，该步骤进一步分为两个子步骤（图 1A，中图：海马组织的酶解法解离与机械法解离，可获得完整且分散的单细胞。采用该方法可获得无细胞聚集体的细胞培养物，如图所示 图 2A-D. 本实验方案的第三部分包括细胞接种（图1A，右侧面板）。该部分方案对于调整培养板中神经元培养物的密度和均一性至关重要。对细胞进行计数后，在直径3.5 cm培养皿的特定区域接种50,000个神经元，可获得理想的细胞密度，不仅适用于检测神经元细胞表面蛋白抗体存在的实验，图3）还可以通过钙成像分析这些抗体的致病性（图4).
<img alt="海马神经元细胞培养示意图：分离、酶解/机械解离、细胞接种步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig01.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：原代海马神经元细胞培养的可视化操作流程。（A）流程图显示了从E18胚胎大鼠制备海马神经元单细胞悬液培养的三个步骤：1. 海马组织分离，2. 细胞解离，3. 细胞接种。（B）推荐用于海马组织分离的工具分类示意图，分为三类：(1- 镊子，2- 弯头镊，3- 剪刀) 用于胚胎采集；(4- 细弯镊，5- 细直镊，6- 手术剪) 用于脑组织取出；(7- 细角镊，8- 精密弹簧剪) 用于海马组织分离。（C）冰盒1的示意图，展示海马组织分离所需培养皿与培养基。胚胎和头部置于HBSS中，脑组织则置于Hibernate培养基 + B27中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
18 天体外培养的海马神经元已成熟、相互连接，并表达结构与功能蛋白 
在神经元培养的生长与成熟过程中，可观察到两个不同的分化阶段：神经元的极化阶段（图 2A、B）以及树突发育与突触网络构建阶段（图 2C、D）。在体外培养第 1 天（div 1），细胞均匀分布并已贴附于培养板上，细胞体周围形成片状伪足，初生神经突开始向外延伸（图 2A）。培养数天后，神经突延伸一定距离，细胞表现出明显的极化特征，但总体生长不显著（图 2B）。此后阶段，突触形成显著增加，神经元开始相互连接，神经网络持续生长并日趋复杂（图 2C）。至 18 天时，神经元已完全成熟并相互连接，神经网络已建立（图 2D）。一旦突触棘形成并完成连接，神经元即实现完全极化，并表达全部功能性和结构性蛋白。在众多由成熟培养神经元表达的蛋白中，本研究选取神经元受体 NMDA（图 2E）和突触蛋白 PSD95（图 2F）作为代表性标志物。此外，可通过标记神经丝蛋白（NF）特异性显示轴突（图 2G），并通过靶向 MAP2 蛋白来可视化树突（图 2H）。<img alt="神经元发育阶段，免疫荧光显微图像；DIV 1-18，NMDAR，PSD95，NF，MAP2。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：离体海马神经元单细胞培养成熟过程的时间进程。（A–D）海马神经元在培养前 18 天内的相差显微图像。（A）div 1 时神经元贴附于聚赖氨酸（PLL）包被的基质表面。（B）div 5 时神经元长出短小的神经突。（C）div 11 时神经元已发育出较长的神经突，进一步伸长并具备轴突特征。（D）div 18 时神经元已成熟并形成神经网络。标尺（A–D） = 40 µm。（E–H）采用共聚焦激光扫描显微镜获取的代表性荧光图像，利用特异性标志物显示 div 18 时成熟的神经元。神经元培养物经固定后，使用特异性抗体进行免疫荧光染色，分别标记（E）神经元受体（NMDAR）、（F）突触标志物（PSD95）、（G）轴突标志物（神经丝蛋白，NF）以及（H）树突标志物（MAP2）。标尺（E–H） = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
患者样本中的抗体与神经元细胞表面抗原发生反应 
从抗NMDAR脑炎患者中获取的样本（血清和脑脊液）含有可识别神经元表面NMDAR的自身抗体。将患者样本与神经元培养物共同孵育后，可在细胞表面和树突上观察到强烈的荧光信号（图3A、C）。相比之下，对照样本作用于神经元培养物时则不产生荧光信号（图3 B、D）。这些结果表明，该培养系统可用于筛查患者样本中的抗体，并有助于发现靶向神经元细胞表面的新抗体。
患者脑脊液样本降低了NMDA诱导的海马神经元培养物中的细胞内钙离子浓度 
为评估患者抗体对神经元活性的影响（经24小时处理后），在NMDA介导的刺激下，实时光学监测了培养神经元中的细胞内钙瞬变。NMDA的施加引起荧光强度升高，表现为细胞内绿色荧光的变化（图4A 及 补充视频1）。与接受患者脑脊液样本处理的细胞相比，接受对照脑脊液样本处理的神经元在施加刺激时表现出更高的荧光强度差异（56%）。通过测量荧光强度差异，并比较从细胞胞体提取数据所得的NMDA介导刺激曲线（图4B,C），结果显示在两种情况下均存在细胞内钙离子流入，但接受患者脑脊液处理的培养物（灰色线）的反应低于对照处理的培养物（黑色线）。这些结果表明，患者脑脊液中存在的抗体通过与NMDAR相互作用，降低神经元细胞活性，从而产生致病效应。
<img alt="显示患者与对照血清及脑脊液、树突标记物的神经元免疫荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：患者抗体与神经元培养物表面发生反应。（A,E）抗NMDAR脑炎患者的血清和脑脊液与活体大鼠海马神经元的细胞表面发生反应；（B,F）而对照组个体的血清和脑脊液无任何反应性。比例尺（A,B,E,F）= 20 µm。树突的高倍放大图像（63×），显示了（C,G）患者血清和脑脊液典型的表面反应模式，以及（D,H）对照组无反应。图像由共聚焦激光扫描显微镜拍摄。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经元刺激荧光、脑脊液比较；图表、显微镜图像、箱形图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：患者抗体降低表达 GCaMP5G 的大鼠神经元中的钙离子内流。（A）在神经元培养物中加入刺激溶液（NMDA [100 μM] + 甘氨酸 [1 μM]）可引发钙离子内流，表现为细胞内绿色荧光增强（刺激峰），与刺激前图像相比明显升高。刺激后 120 秒，荧光强度下降并趋于稳定（刺激后）。经患者脑脊液处理的培养物中，NMDA 介导的钙离子升高幅度显著降低（减少 56%），与对照脑脊液处理组相比差异明显。图像通过荧光显微镜采集。比例尺 = 20 μm。（B）三次独立实验之一的结果图，显示在 NMDA 刺激（蓝色箭头）下，对照脑脊液（黑线）和患者脑脊液（灰线）处理的培养物随时间（180 秒）变化的荧光强度。n（对照脑脊液）= 20 个细胞；n（患者脑脊液）= 28 个细胞。数据以均值 ± 标准误表示。（C）箱形图显示中位数、第 25 和第 75 百分位数。须线表示最小值和最大值。显著性评估采用双因素方差分析（ANOVA；p &lt; 0.0001）和 Mann-Whitney U 检验（p &lt; 0.0001）。p &lt; 0.05 被认为具有统计学显著性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充视频 1：并排显示两个表达 GCaMP5G 的海马神经元的视频：经对照脑脊液处理的神经元（左侧）与经患者脑脊液处理的神经元（右侧）。在两种情况下，施加 NMDAR（刺激）均引起细胞内荧光强度增加，但经对照脑脊液处理的神经元荧光增强水平显著高于经患者脑脊液处理的神经元。图像通过荧光显微镜采集，并使用 ImageJ 软件应用 Fire 查找表（LUT）进行编辑。共 1700 帧（170 秒）；加速 5 倍。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

自身免疫性脑炎是一类新型的中枢神经系统抗体介导性疾病。海马神经元可用于发现和鉴定这些抗体。本文提供了一种原代细胞培养和免疫染色的实验方案，用于检测患者血清和脑脊液中的自身抗体。

在过去的15年中，一类新的中枢神经系统（CNS）抗体介导性疾病已被明确界定，现定义为……

该方案的意义在于使我们能够确定患者样本中是否含有致病性抗体。该技术的主要优势在于能够区分抗体对细胞表面抗原和细胞内抗原的反应性，而其他方法难以实现这种区分。培养的海马神经元用于鉴定新抗体。这些新抗体的鉴定最终能够启动针对特定疾病的单药治疗，从而改善患者的治疗效果。该技术具有重要意义，因为它可推广至所有与针对神经元表面蛋白的致病性抗体相关的疾病领域。用精细的弯镊夹住胚胎头部，以精细的直镊在45度角下刺入眼眶。然后松开精细弯镊。借助手术剪，从枕骨开始沿中线向额骨方向分离皮肤和颅骨。随后用精细弯镊取出脑组织，放入盛有 Hibernate 加 B27 的 6 厘米培养皿中。待所有胚胎的脑组织取出后，使用精细的直头镊子将端脑进行矢状分离。接着，准备一个直径为10厘米的培养皿，在其中以1厘米间隔呈环形滴加含B27添加剂的Hibernate培养基，每滴放置一个端脑，以便在解剖显微镜下以1.25倍放大倍数进行观察。在显微镜下操作时，小心去除丘脑，并剥离脑膜，以更清晰地观察海马结构。然后用精密弹簧剪解剖海马体，并将其置于含有Hibernate Plus B27和Istrate two的3.5厘米培养皿中。重复该操作以收集全部海马体。对于海马体的酶解消化，在含有海马体的50毫升离心管中加入1毫升2.5%胰蛋白酶。用HBSS将管内液体体积补至5毫升后，将离心管置于37摄氏度水浴中孵育15分钟。为进一步稀释胰蛋白酶，加入10毫升预热的HBSS，并将离心管重新放回设定为37摄氏度的水浴中孵育5分钟。接下来，使用1000微升移液器将呈现为黏液状团块的海马组织转移至一个50毫升离心管中。加入6毫升预热的HBSS溶液，孵育5分钟，操作如图所示。为进行机械解离，将海马组织团块转移至带有锥形底部的2毫升离心管中。加入一毫升预热的 DMEM 培养基后，用 1000 微升移液器轻轻反复吹打，使沉淀重悬。使用预先拉制的玻璃移液管，将其管尖接触离心管锥形底部，上下吹打 10 至 20 次，注意避免产生气泡，直至混合液呈半透明状。在用交叉振荡动作将细胞均匀分配至 3.5 厘米培养皿之前，先进行细胞计数。完成后，将培养皿放入含5%二氧化碳的培养箱中。对于体外培养14天的细胞进行荧光免疫染色时，将含有抗NMDAR抗体的样品加入盖玻片中，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。一小时后，用4%多聚甲醛和PBS作为固定液，在室温下处理样品5分钟。然后用 PBS 每次冲洗样品 5 分钟，共冲洗数次，随后加入 1:1000 稀释的二抗山羊抗人 Alexa Fluor 488，室温孵育 1 小时。接着，用液体封片剂将含有样品的盖玻片封片，并吸去多余液体。通过荧光成像观察神经元。进行钙成像时，使用体外培养14至18天并生长在盖玻片上的细胞。成像前，用编码pAAV2 CAG GCaMP 5G的病毒载体处理细胞，浓度为每毫升2.5 × 10¹⁰基因组拷贝，处理5至7天。成像前一天，将细胞与患者样本共同孵育24小时。在成像当天，准备实验装置并将显微镜细胞培养室温度设置为37摄氏度。用蒸馏水填充通道，并通入5%二氧化碳以维持细胞生理条件。用细胞外生理溶液覆盖细胞后，将其转移至显微镜细胞培养室中。加入10 µM的NBQX以阻断AMPA和KA受体，并观察NMDA受体反应。以每100毫秒采集一帧的频率，获取持续四分钟的图像序列。在开始采集后不久，向培养皿中加入刺激溶液。刺激后，使用Image J等图像处理软件，从培养物中提取对照组和患者脑脊液（CSF）样本孵育后的荧光信号随时间的变化。观察发现，体外培养一天时，细胞均匀分布并已贴附于培养板，细胞体周围形成片状伪足，初生神经突开始延伸。经过数天培养后，神经突延伸了一段较短距离，细胞表现出明显的极化特征。神经元网络持续生长并逐渐变得复杂。在第18天，神经元已成熟，相互连接并形成了神经网络。代表性荧光图像显示了使用特异性标记物在第18天观察到的成熟神经元。将培养物与患者样本共孵育后产生强烈的荧光信号，因为样本中含有可识别神经元表面NMDA受体的自身抗体。相比之下，对照样品在施用于神经元培养物时未产生荧光信号。施用NMDA后，细胞内绿色荧光发生变化，表明荧光强度增加。当施加刺激剂时，经对照脑脊液样品处理的神经元比经患者脑脊液样品处理的细胞显示出更高的荧光强度差异。海马体的准确识别与精细分离是决定培养细胞纯度的关键因素。细胞聚集程度是一个重要影响因素，尤其是在将培养物用于成像实验时。此外，培养的海马神经元可与免疫沉淀及质谱技术相结合，用于鉴定新型抗体及其靶向抗原。该技术已实现了对抗体介导疾病的新型类别进行表征，因此在纳米免疫学这一新兴领域的研究中至关重要。

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海马神经元培养检测和研究自身免疫性脑炎中涉及的新型致病抗体

本视频演示了一种利用大鼠海马神经元培养物来鉴定样本中针对特定抗原的抗体的技术。通过将培养的神经元暴露于含有靶向N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）自身抗体的患者样本中，可通过免疫染色揭示结合在神经元表面的自身抗体的存在。...

利用海马神经元培养检测人血清中自身抗体的实验方法

蛋白质棕榈酰化修饰的可逆性添加是细胞内蛋白质转运的重要调控机制。这一过程在神经元中尤为关键，因为许多突触蛋白均会发生棕榈酰化修饰。我们采用一种简单的生物化学方法来检测培养神经元中的棕榈酰化蛋白，该方法可适用于多种细胞类型和组织。...

海马神经元培养物中蛋白质棕榈酰化检测的免疫沉淀与酰基-生物素交换（ABE）法

近年来，基于活细胞的检测方法已成功用于检测针对细胞表面和构象性抗原的抗体。本文介绍了一种利用高通量流式细胞术的方法，可实现对大规模患者队列的分析。新抗体的发现将有助于改善免疫介导性疾病的确诊与治疗。...

高通量流式细胞术细胞检测法用于检测人血清中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体或抗多巴胺-2受体抗体

我们在人胚胎肾细胞（HEK293）中异位表达了绿色荧光蛋白标记的NMDA受体NR1亚基，作为抗原用于检测疑似自身免疫性脑炎患者血液中针对NMDA受体的自身抗体。这种简单的方法可能适用于临床环境中的筛查。...

一种基于细胞的简单免疫荧光法检测血液中抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体自身抗体

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本文介绍了一种在分离的原代海马神经元培养物中研究谷氨酸受体（GluR）转运的方法。该方法结合使用抗体标记技术对内源性或过表达的受体进行标记，并联合药理学手段，通过调控受体的内吞或再循环过程，从而鉴定调节GluR表面表达的分子机制。...

一种通过抗体饲喂法研究分离原代海马神经元培养中谷氨酸受体转运的方法

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本文介绍了一种从大鼠大脑皮层分离胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞以建立原代培养的实验方案，用于在hSOD1G93A大鼠模型中研究肌萎缩侧索硬化症病理生理机制时，进行细胞内Ca2+动态变化的延时视频成像。...

大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化研究中的应用

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。...

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

学习利用海马神经元原代培养技术检测自身免疫性脑炎患者样本中的致病性抗体。该方法通过免疫荧光成像区分细胞表面与胞内抗原反应性，为神经免疫学诊断提供可靠方案。

用于检测和研究自身免疫性脑炎中新型致病性抗体的海马神经元培养

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