用于检测和研究自身免疫性脑炎中新型致病性抗体的海马神经元培养

该方案的意义在于使我们能够确定患者样本中是否含有致病性抗体。该技术的主要优势在于能够区分抗体对细胞表面抗原和细胞内抗原的反应性，而其他方法难以实现这种区分。培养的海马神经元用于鉴定新抗体。

这些新抗体的鉴定最终能够启动针对特定疾病的单药治疗，从而改善患者的治疗效果。该技术具有重要意义，因为它可推广至所有与针对神经元表面蛋白的致病性抗体相关的疾病领域。用精细的弯镊夹住胚胎头部，以精细的直镊在45度角下刺入眼眶。

然后松开精细弯镊。借助手术剪，从枕骨开始沿中线向额骨方向分离皮肤和颅骨。随后用精细弯镊取出脑组织，放入盛有 Hibernate 加 B27 的 6 厘米培养皿中。

待所有胚胎的脑组织取出后，使用精细的直头镊子将端脑进行矢状分离。接着，准备一个直径为10厘米的培养皿，在其中以1厘米间隔呈环形滴加含B27添加剂的Hibernate培养基，每滴放置一个端脑，以便在解剖显微镜下以1.25倍放大倍数进行观察。在显微镜下操作时，小心去除丘脑，并剥离脑膜，以更清晰地观察海马结构。

然后用精密弹簧剪解剖海马体，并将其置于含有Hibernate Plus B27和Istrate two的3.5厘米培养皿中。重复该操作以收集全部海马体。

对于海马体的酶解消化，在含有海马体的50毫升离心管中加入1毫升2.5%胰蛋白酶。用HBSS将管内液体体积补至5毫升后，将离心管置于37摄氏度水浴中孵育15分钟。为进一步稀释胰蛋白酶，加入10毫升预热的HBSS，并将离心管重新放回设定为37摄氏度的水浴中孵育5分钟。

接下来，使用1000微升移液器将呈现为黏液状团块的海马组织转移至一个50毫升离心管中。加入6毫升预热的HBSS溶液，孵育5分钟，操作如图所示。为进行机械解离，将海马组织团块转移至带有锥形底部的2毫升离心管中。

加入一毫升预热的 DMEM 培养基后，用 1000 微升移液器轻轻反复吹打，使沉淀重悬。使用预先拉制的玻璃移液管，将其管尖接触离心管锥形底部，上下吹打 10 至 20 次，注意避免产生气泡，直至混合液呈半透明状。在用交叉振荡动作将细胞均匀分配至 3.5 厘米培养皿之前，先进行细胞计数。

完成后，将培养皿放入含5%二氧化碳的培养箱中。对于体外培养14天的细胞进行荧光免疫染色时，将含有抗NMDAR抗体的样品加入盖玻片中，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。一小时后，用4%多聚甲醛和PBS作为固定液，在室温下处理样品5分钟。

然后用 PBS 每次冲洗样品 5 分钟，共冲洗数次，随后加入 1:1000 稀释的二抗山羊抗人 Alexa Fluor 488，室温孵育 1 小时。接着，用液体封片剂将含有样品的盖玻片封片，并吸去多余液体。通过荧光成像观察神经元。

进行钙成像时，使用体外培养14至18天并生长在盖玻片上的细胞。成像前，用编码pAAV2 CAG GCaMP 5G的病毒载体处理细胞，浓度为每毫升2.5 × 10¹⁰基因组拷贝，处理5至7天。成像前一天，将细胞与患者样本共同孵育24小时。

在成像当天，准备实验装置并将显微镜细胞培养室温度设置为37摄氏度。用蒸馏水填充通道，并通入5%二氧化碳以维持细胞生理条件。用细胞外生理溶液覆盖细胞后，将其转移至显微镜细胞培养室中。

加入10 µM的NBQX以阻断AMPA和KA受体，并观察NMDA受体反应。以每100毫秒采集一帧的频率，获取持续四分钟的图像序列。在开始采集后不久，向培养皿中加入刺激溶液。

刺激后，使用Image J等图像处理软件，从培养物中提取对照组和患者脑脊液（CSF）样本孵育后的荧光信号随时间的变化。观察发现，体外培养一天时，细胞均匀分布并已贴附于培养板，细胞体周围形成片状伪足，初生神经突开始延伸。经过数天培养后，神经突延伸了一段较短距离，细胞表现出明显的极化特征。神经元网络持续生长并逐渐变得复杂。

在第18天，神经元已成熟，相互连接并形成了神经网络。代表性荧光图像显示了使用特异性标记物在第18天观察到的成熟神经元。将培养物与患者样本共孵育后产生强烈的荧光信号，因为样本中含有可识别神经元表面NMDA受体的自身抗体。

相比之下，对照样品在施用于神经元培养物时未产生荧光信号。施用NMDA后，细胞内绿色荧光发生变化，表明荧光强度增加。当施加刺激剂时，经对照脑脊液样品处理的神经元比经患者脑脊液样品处理的细胞显示出更高的荧光强度差异。

海马体的准确识别与精细分离是决定培养细胞纯度的关键因素。细胞聚集程度是一个重要影响因素，尤其是在将培养物用于成像实验时。此外，培养的海马神经元可与免疫沉淀及质谱技术相结合，用于鉴定新型抗体及其靶向抗原。

该技术已实现了对抗体介导疾病的新型类别进行表征，因此在纳米免疫学这一新兴领域的研究中至关重要。