Name: 诱导珊瑚群落息肉获救，获得个体化微繁殖物，用于实验室实验用途 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 了解珊瑚息肉获救诱导技术，通过高盐度和无钙海水处理实现珊瑚微繁殖。该方法为研究珊瑚生理、白化机制及环境胁迫响应提供了可重复的实验室模型，有助于开发珊瑚保护策略。

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我们感谢 Adam Barno 和 Francisca Garcia 在珊瑚息肉实验及监测工作中提供的支持。我们还感谢 KAUST 滨海 &amp;感谢海洋资源核心实验室在水族馆维护和基础设施方面提供的协助。本研究由KAUST基金编号BAS/1/1095-01-01资助。

本研究中，使用潜水员携带锤子和凿子通过水肺潜水从阿尔法哈尔礁（22.305118 N；38.964568 E）采集了一个属于Pocillopora verrucosa珊瑚物种的珊瑚群体。该群体的属级分类通过形态学方法鉴定，其种级分类被确定为P. verrucosa，依据是此前已发表的研究成果，包括对红海Pocillopora属珊瑚的研究，表明从遗传学角度来看，该区域存在的物种为P. verrucosa39,40。阿尔法哈尔礁不属于受保护的环境区域，因此采集珊瑚无需特殊许可。该珊瑚群体在300 L水族箱中饲养一个月后，被进行碎片化处理并诱导其珊瑚虫“逃逸”。水族箱内温度维持在26 °C，配备两个水族加热器、三台水泵和两个光源（见材料表），并保持12小时光照周期。通过将两个加热器分别连接至温度控制器来维持水族箱温度。光照程序设定为早上6点开始，下午6点结束，光辐射强度在中午12点达到峰值，为230 µmol 光子 m−2s−1。
1. 通过蒸发海水提高盐度诱导息肉逃逸
注意：本方法改编自 Shapiro 等人25。若使用除多枝鹿角珊瑚（Pocillopora verrucosa）以外的其他物种，在确定待切割片段大小前，应考虑其息肉的尺寸。
<ol>
	<li>使用斜口剪刀从珊瑚群体上切割小片段（长度小于1 cm）（参见材料表）。 
	注意：应根据所使用的珊瑚物种调整切割工具。斜口剪刀适用于切割具有细长分枝的珊瑚。在本研究中，每种处理使用一个片段，但片段的数量和大小可根据所需珊瑚虫数量进行调整。切割后的片段尺寸不得超过蒸发后水的深度，以确保操作完成后珊瑚始终完全浸没在水中。</li>
	<li>将切割好的片段放入盛有12 mL海水的小培养皿中，该海水应与珊瑚群体原本适应的海水条件一致。可使用人工海水（参见材料表），或使用与珊瑚群体此前所处环境盐度相同的过滤天然海水。 
	注意：必须确保片段完全被水覆盖。若12 mL水量不足以覆盖培养皿中的片段，请相应调整容器和水量。在本研究中，所用海水采自红海，盐度为40 PSU，使用多参数仪（参见材料表）测定。</li>
	<li>将培养皿敞口放置约24小时，室温条件下使水分蒸发，盐度逐渐升高。当观察到珊瑚虫之间出现组织消化现象时，进入步骤1.4。 
	注意：孵育结束后，水中盐度应比初始值高出约40%，此时珊瑚虫应已准备从骨骼上脱离。</li>
	<li>使用1 mL移液器在珊瑚组织附近产生轻柔的水流，帮助已完成周围组织消化的珊瑚虫从骨骼上完全脱离。 
	注意：当用移液器产生水流时，单个或成簇的珊瑚虫应以片状形式从骨骼脱落。若脱落物为浑浊物质，则表明组织发生死亡或解体，说明珊瑚孵育时间过长或处于过度应激状态（本例中为盐度过高）。产生水流时务必轻柔，以免对珊瑚虫造成物理损伤。</li>
	<li>使用移液器缓慢更换培养皿中的水，替换为等渗溶液（使用与步骤1.2相同的水）。在10分钟内完成50%的换水即可使珊瑚虫重新适应非应激性盐度条件。 
	&#8203;注意：本实验使用采自红海的多孔螅科珊瑚物种Pocillopora verrucosa群体，因此进行了测试以确定该特殊环境中珊瑚发生逃逸行为的具体条件。需特别指出的是，红海的盐度显著高于大多数其他珊瑚礁环境。</li>
</ol>
2. 通过高盐度海水诱导珊瑚虫脱离
注意：本方法改编自 Chuang 等人27。
<ol>
	<li>通过向海水中添加 NaCl，直至盐度探头测得盐度升高 85%，制备 3 L 高盐度海水。 
	注意：在本研究中，使用红海的 40 PSU 海水制备了 74 PSU 的高盐度海水。</li>
	<li>按照步骤 1.1 所述方法切割珊瑚小片段。</li>
	<li>将切割后的片段放入一个装有 3 L 等渗海水（本实验中指对珊瑚无胁迫的正常盐度海水，与步骤 1.2 中所用相同）的 10 L 容器中，并连接至蠕动泵（见材料表）。 
	注意：为更好地维持珊瑚健康，可添加温度控制器、气泵和光源，以模拟珊瑚群体先前所处的水族箱环境。在本研究的孵育过程中，珊瑚片段被置于 26 °C 的容器中，接受每日 12 小时的光照周期。通过气泵维持水体流动和温度均匀。</li>
	<li>使用蠕动泵，以 126 mL/h 的速率，在 24 小时内将步骤 2.1 中制备的高盐度海水缓慢加入含有珊瑚片段的容器中。总共加入 3 L 水，使盐度逐步升高约 40%。 
	注意：高盐度海水可通过向普通海水中添加 NaCl 至目标盐度直接获得。</li>
	<li>使用移液器产生轻微水流，使珊瑚虫从骨骼上脱离（步骤 1.4）。</li>
	<li>缓慢将含有珊瑚虫的水更换为等渗海水（步骤 1.5）。随后进入步骤 4 或步骤 5。</li>
</ol>
3. 通过无钙海水培养诱导息肉逃逸
注意：本方法改编自 Pang 等人24。
<ol>
	<li>通过加入 26.29 g NaCl、0.872 g KCl、2.16 g MgSO₄·7H₂O、1.32 g MgCl₂·6H₂O、0.13 g NaHCO₃、0.04 g NaBr、0.023 g H₃BO₃、0.025 g SrCl₂·6H₂O、0.002 g NaF 和 0.001 g Na₂SiO₃·9H₂O 至 1 L 去离子水中，配制无钙人工海水（CaFSW）溶液。4，11.94 g MgCl₂2，3.42 g Na2SO4，以及 0.286 g NaHCO₃3 （参见 材料表) 加入 1 L 去离子水中。 
	注意：本溶液根据先前的方案进行了调整，更适合适应40 PSU盐度的珊瑚。对于适应其他盐度条件的珊瑚，应使用相同比例的盐类，但调整溶质的总质量，以获得更适合所用珊瑚的盐度。</li>
	<li>按照步骤1.1所述，切割珊瑚成小片段。</li>
	<li>将珊瑚碎片浸入盛有先前制备的CaFSW（步骤3.1）的培养皿中，并在转速为80 rpm的旋转摇床中孵育3小时。 
	注意：再次强调，必须确保碎片完全浸没在水中。如果培养皿不足以覆盖碎片，请根据实验需求优化容器及液体体积。</li>
	<li>将片段转移至含有20%杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的培养皿或6孔板中，并 &#65279;100 mg/mL 氨苄青霉素溶液（参见 材料表) 用40 PSU的人工海水配制。将片段在26℃下孵育 &#176;C 和 80 转/分钟，每天更换培养基，直至观察到多孔之间组织消化，且单个息肉开始从骨骼脱离。 
	注意：在大多数情况下，组织消化在该培养基中孵育20小时后即已完成，无需更换培养基。</li>
	<li>使用移液器将珊瑚虫转移至无菌海水中进行初步恢复。孵育1小时后，进行步骤4或步骤5。</li>
</ol>
4. 在培养皿中维持珊瑚虫
<ol>
	<li>将珊瑚虫重新放入具有非胁迫性盐度的过滤海水中后，在体视显微镜下观察组织完整性和纤毛流动引起的运动，以筛选出有活力的珊瑚虫。</li>
	<li>将筛选出的珊瑚虫置于玻璃或塑料培养皿中，并用浮游生物网（200 µm 网孔尺寸，参见材料表）覆盖培养皿，防止珊瑚虫从皿中漂出。 
	注意：网孔的尺寸可根据珊瑚虫的大小进行调整。需注意的是，网孔必须小于珊瑚虫的尺寸，同时允许水体交换和光线透过。</li>
	<li>将培养皿放入水族箱中，提供适合所用珊瑚物种的培养条件。 
	注意：本研究中使用的条件为 26 °C 下 40 PSU 的过滤海水，以及 12 小时光照周期。</li>
	<li>每周至少打开一次培养皿，更换水体并清洗器皿。此步骤至关重要，可防止藻类过度生长，避免其局部释放有毒化合物而与珊瑚虫竞争或造成损伤。</li>
</ol>
5. 在培养箱中维持珊瑚虫
<ol>
	<li>按照步骤 4.1 所述选择有活力的珊瑚虫。</li>
	<li>使用移液管将珊瑚虫放入装有 50 mL 等渗海水的 75 cm2 表面积细胞培养瓶中。 
	注意：本研究中使用从红海采集的过滤海水来维持珊瑚虫。也可使用与步骤 1.2 中特性相同的海水。</li>
	<li>盖紧培养瓶并将其转移至培养箱中。将培养箱设置为 12 小时光照循环，温度 26 °C，转速 40 rpm。每 4 天更换 50% 的水体积，当瓶壁上藻类或生物膜过多导致培养瓶过满时，将内容物转移至洁净的培养瓶中。 
	注意：代表性结果的图像使用配备高清相机的全复消色差变焦系统拍摄（见材料表）。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

多孔螅息肉在经历逃逸过程后的存活率以及完成该过程所需的时间，在以往报道的研究中存在差异25,33,41，这可能归因于各研究中采用的不同实验方法。例如，不同珊瑚物种，甚至同一物种但适应不同环境条件的珊瑚（如红海来源的珊瑚），对盐度水平的耐受阈值也有所不同。所选择的逃逸方法以及实验室或水族箱的培养条件也会对结果产生重要影响。在某些情况下，珊瑚微繁殖体在实验室条件下的维持时间已超过珊瑚细胞培养的存活时间，达到无虫黄藻33,41和有虫黄藻25珊瑚数月的存活期。不同研究中完成息肉逃逸过程所需的时间也各不相同，从数小时25,27,30到暴露于引发逃逸的胁迫因子下数周35不等。在研究息肉逃逸时，另一个需要考虑的变量是息肉在经历诱发其释放的急性胁迫后的恢复情况。目前仍存在争议的是，逃逸后的息肉是否处于足够良好的状态，可作为研究珊瑚生物学的模型。当使用这些微繁殖体时，其在共肉组织降解后的组织恢复情况令人关注。然而，在包括本研究在内的多项研究中，逃逸数周后的息肉仍能在其组织内保留虫黄藻细胞，并保持完整的口-反口极性及触手的外部形态25,27,32,36。先前的研究还发现，当急性胁迫解除后，暴露于高盐度或升温海水中的释放珊瑚息肉能够将与凋亡、蛋白水解和细胞分裂等过程相关基因的表达恢复至逃逸前的水平32,36，甚至可增强与组织修复相关基因的表达36。
关于不同方法之间在存活率方面的差异，需要强调的是，即使采用相同的技术，这一时间在不同实验之间也可能存在变化，这可能与所用片段的健康状况以及出芽后水螅体的适当维护有关。在通过无钙海水孵育诱导出芽的情况下，水螅体的存活时间仅限于1天。因此可以得出结论：该方法并不适合所研究物种的长期存活，或者必须针对红海的疣状瘤珊瑚（P. verrucosa）对该技术进行更优的调整。已有报道显示，采用逐步升高盐度的方法，特别是通过对水螅体滴加高盐度水时，获得了更长的存活时间。与蒸发法相比，该方法能够实现更可控的盐度上升，同时不会导致海水中其他物质（包括珊瑚代谢废物）浓度的增加，而这些物质可能对生物体具有潜在毒性。基于以上所有原因，该方法已被建议作为维持健康水螅体更安全的替代方案27。尽管该方法被假定对水螅体健康更为安全，并能产生更长寿的水螅体——这一事实已在本研究中得到证实——但仍需进一步调查以确认其效果。两种通过高盐度诱导出芽的实验均显示，当盐度在24小时内达到59 PSU时，水螅体完全脱离。若盐度继续升高至出芽完成后的水平之上，将对水螅体造成额外的应激，降低其在急性应激处理后存活和恢复的可能性。因此，不建议将水螅体长时间维持在如此高的盐度条件下。在采用无钙海水暴露法进行出芽诱导时，经过3小时在无钙人工海水中的孵育即可实现水螅体的完全脱离，这意味着进一步暴露于该介质中同样不被推荐。
为了确定更适合在实验室/体外研究中用于珊瑚息肉的方法，本研究仅聚焦于三种耗时接近24小时即可完成逃逸过程的技术，这些技术曾被用于涉及石珊瑚类珊瑚息肉长期维持的研究。其他报道中耗时显著更长的方法未被采用。本研究未尝试使息肉在基质上附着定居，而是专注于产生可用于转移至不同环境或通过一次性移液管轻松收集以进行分析的息肉。结果表明，来自珊瑚物种P. verrucosa的息肉即使未附着于基质，仍可存活长达8周，且伴有共生虫黄藻细胞，外观健康，并保持完整的整体外部解剖结构。这些结果表明，利用本研究中展示的部分技术，可从单个珊瑚碎片获得更多的生物学重复样本。此类生物学重复样本可在受控环境（如培养皿和细胞培养瓶）中维持，并在实验室条件下用于持续数月的实验，适用于多种用途。
自从首次偶然描述了珊瑚虫脱离现象42,43以来，研究人员已建立了新的实验方案，以寻找更标准化的方法来诱导珊瑚虫释放并维持其存活，从而用于未来的科研应用。这些应用包括研究与珊瑚全生物体生理学44及宿主-微生物组相互作用45相关的不同方面、珊瑚白化的分子机制5,25，以及珊瑚全生物体的健康、恢复力与保护12,13,46,47。此外，释放出的珊瑚虫也可用于科研以外的应用，已有研究建议其可用于产生能够附着于基质并生长的繁殖体，一旦脱离技术的标准化方案得到广泛推广，便有望生成多个珊瑚个体，用于珊瑚生态修复28。总体而言，尽管仍需开展更深入的实验以进一步标准化利用脱离珊瑚虫的方法，但已有研究表明，珊瑚虫脱离是一种可重复的技术，可作为珊瑚研究中多种用途的有效工具。

石珊瑚（或造礁珊瑚）是一类能够形成碳酸盐骨骼的刺胞动物，可构建珊瑚礁及结构复杂的生态系统，广泛分布于从深海到浅海的多种水域环境1。热带珊瑚礁拥有极高的生物多样性，并提供重要的生态系统服务功能，例如海岸防护和渔业资源维持2。大多数浅水造礁珊瑚依赖与Symbiodiniaceae科藻类建立的互利共生关系，这些共生藻为珊瑚构建骨骼提供所需的能量。环境胁迫可破坏珊瑚与藻类之间的共生关系，导致珊瑚白化现象3,4,5,6。近年来的温度异常已在全球范围内引发大规模珊瑚白化事件，造成大量珊瑚死亡以及珊瑚礁生态系统的永久性退化7,8,9,10,11。由于该现象本质上是热胁迫后通过细胞凋亡、自噬和胞吐等细胞机制排出共生藻的过程，因此珊瑚白化可被视为一种具有生态系统尺度影响的细胞过程5,6,12，这意味着若能建立珊瑚细胞或组织的in vitro培养体系，将有助于深入研究这一现象。
由于珊瑚礁具有重要生态价值，且在过去二十年中面临严重威胁2，全球范围内针对珊瑚的保护与修复研究日益受到关注13。然而，建立可靠、可重复且对环境影响最小的珊瑚研究方法与实验体系，仍是该领域面临的主要挑战。
微繁殖是指在受控容器中通过培养生物材料，实现生物体基因型的体外增殖14,15。近年来，细胞、组织和器官的培养在植物和动物生物学研究中至关重要。它使得生物体能够在实验室中大规模繁殖，快速评估不同处理方法（如药物和药品），并直接研究细胞功能14,15,16,17。总体而言，体外模型有助于在更可控的物理和化学条件下，补充并深化对不同生物体的研究。由于体外培养技术具有诸多优势，多种动物细胞和组织培养技术已被开发、优化，并作为重要工具广泛应用于多个研究领域，其中大量细胞系已被研究并实现商业化应用16,17,18。
自1882年首次进行动物组织培养以来，细胞与组织培养领域的知识取得了诸多进展17，例如天然与合成培养基的使用、永生化细胞系的建立，以及三维培养体系的发展，使得多种细胞类型得以更有效地培养16,17,18,19。然而，细胞生物学领域主要集中于少数模式生物，许多生物类群至今仍缺乏完善的体外（in vitro）细胞、组织或器官培养体系20。例如，在珊瑚研究中，尚未广泛使用永生化细胞系，这使得珊瑚细胞研究局限于原代细胞培养。这些原代培养物的存活时间通常仅限于数周21，在2021年初之前，尚无研究记录到所有珊瑚组织来源的单个细胞存活超过13天22。首篇关于可持续培养珊瑚细胞系的报道于2021年初发表，其中Acropora tenuis细胞的培养时间长达6个月，但这些细胞在今后研究中的应用潜力仍有待进一步探索23。
为了克服珊瑚细胞培养中的局限性，并维持能够保留珊瑚整体组织结构的实验室培养体系，近期有研究提出将分离的珊瑚虫作为珊瑚生物学研究的模型24,25。珊瑚虫是珊瑚的解剖学基本单位，每个珊瑚虫的口位于其口盘中央，并通过其反口端的共肉组织与其他珊瑚虫相连26。活体珊瑚虫的分离可自然发生于“珊瑚虫逃逸”（polyp bail-out）过程中，该过程由急性应激引发，导致珊瑚虫之间的共肉组织被消化，从而使珊瑚虫从群体骨骼上脱离25,27,28。这一现象已在多种分类群中被报道，包括八放珊瑚29,30,31、黑珊瑚32以及石珊瑚25,27,28,32,33，且与多种环境胁迫因素相关，例如水中缺钙24,34、酸度升高35、高渗环境25,27,32,36、高温36,37、饥饿33、空气暴露25,30以及杀虫剂污染28,38。例如，在鹿角杯形珊瑚科（pocilloporid corals）中已观察到珊瑚虫逃逸现象19，该类珊瑚在全球广泛分布，常被用作珊瑚研究的模式生物。该类群中的物种，如 Pocillopora damicornis 和 Styllophora pistillata，可从一个5 mm的珊瑚碎片产生约30–40个微繁殖个体25。这一数量突显了利用珊瑚虫逃逸进行珊瑚微繁殖的优势，即可以从一小段珊瑚组织中生成大量遗传一致的个体。使用分离的珊瑚虫进行研究还具备与细胞培养相似的优点，例如可在受控的实验室环境（如烧瓶和培养皿）中进行培养。此外，已有微流控平台成功用于维持活体珊瑚虫，表明这些微繁殖个体可在成本较低且易于复制的环境中长期存活，同时实现对水流、基质和温度的精确控制24,25。这些微流控平台还可直接用于在显微镜下观察活体珊瑚结构24,25。
本文总结并展示了已开发的从珊瑚群体中分离单个珊瑚虫的技术，说明了如何在实验室条件下长期培养这些珊瑚虫。所讨论的方法包括通过蒸发和泵入高盐度海水造成高渗环境诱导珊瑚虫逃逸，以及在无钙海水中进行孵育。

<table><tbody><tr><td>5560 电导率/温度探头</td><td>YSI</td><td>5560</td><td>与 ProQuatro 多参数测量仪配合使用的电导率探头</td></tr><tr><td>Ace 5 英寸合金钢斜口钳</td><td>Ace Hardware</td><td>2004083</td><td>用于切割珊瑚碎片</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>用于 DMEM 培养基中</td></tr><tr><td>DMEM (1x) 达尔伯克改良伊格尔培养基</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>用于钙离子缺失型珊瑚息肉脱离法中孵育珊瑚碎片</td></tr><tr><td>Fisherbrand 培养皿，可堆叠盖，60 mm × 15 mm，无菌，聚苯乙烯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>用于蒸发法息肉脱离实验，以及在水族箱中饲养息肉</td></tr><tr><td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 瓦加热棒</td><td>Schego</td><td>548</td><td>水族箱中使用的加热器</td></tr><tr><td>Leica Application Suite 版本 4.2</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>用于示例结果图像采集的软件</td></tr><tr><td>Leica IC80 HD</td><td>Leica Microsystems</td><td>12730216</td><td>用于拍摄示例结果图片的相机</td></tr><tr><td>Leica MDG33</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 450 123</td><td>用于拍摄示例结果图片的体视显微镜支架</td></tr><tr><td>Leica Z6 APO</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>用于拍摄示例结果图片的宏观变倍显微镜</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7487-88-9</td><td>用于配制无钙人工海水</td></tr><tr><td>无水硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td>用于配制无钙人工海水</td></tr><tr><td>Masterflex I/P 易装泵头，精密管路，白色 PPS 外壳，不锈钢转子</td><td>Masterflex</td><td>HV-77602-10</td><td>蠕动泵泵头</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密模块化驱动器，带台式控制器</td><td>Masterflex</td><td>EW-07557-00</td><td>用于泵送高盐度海水的蠕动泵驱动器。可替换为任何能够维持实验方案所述水流的蠕动泵</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密泵管，铂金固化硅胶，L/S 16，25 英尺</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-16</td><td>蠕动泵用管路</td></tr><tr><td>Millex 33 mm PVDF 0.22 &amp;micro;m 无菌 RUO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVR33RS</td><td>用于过滤人工海水</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;Nunclon Delta 表面</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156499</td><td>通常用于细胞培养的烧瓶，用于息肉培养</td></tr><tr><td>轨道摇床，Advanced 5000，VWR</td><td>VWR</td><td>444-2916</td><td>孵育箱内使用的摇床</td></tr><tr><td>Percival 孵育箱 - I-22VL</td><td>Percival</td><td>NA</td><td>用于维持存放于细胞培养瓶中的珊瑚</td></tr><tr><td>浮游生物网，200 &amp;micro;m 网孔尺寸</td><td>KC Denmark</td><td>NA</td><td>用于覆盖含有珊瑚息肉的培养皿</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>VWR Chemicals</td><td>7447-40-7</td><td>用于配制无钙人工海水</td></tr><tr><td>ProQuatro 多参数测量仪</td><td>YSI</td><td>606950</td><td>用于在整个实验过程中测量盐度</td></tr><tr><td>RADION XR15 G5 PRO</td><td>Ecotech</td><td>NA</td><td>水族箱中使用的照明灯</td></tr><tr><td>Red Sea Salt&lt;br/&gt; 优级，中等碱度</td><td>Red Sea</td><td>NA</td><td>用于配制 40 PSU 人工海水</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>用于配制无钙人工海水</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>用于配制无钙人工海水</td></tr><tr><td>无水硫酸钠</td><td>VWR Chemicals</td><td>7757-82-6</td><td>用于配制无钙人工海水</td></tr><tr><td>TRD 112 恒温器</td><td>Schego</td><td>NA</td><td>水族箱中使用的恒温器</td></tr><tr><td>Turbelle Nanostream 6025</td><td>Tunze</td><td>6025 000</td><td>水族箱中使用的水泵</td></tr></tbody></table>

诱导珊瑚群体中息肉脱离以获得用于实验室实验的个体化微繁殖体

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

珊瑚是由称为息肉的模块化单位组成的群体性动物。珊瑚息肉在生理上相互连接，并由组织相连。息肉逃逸现象是一种由急性应激诱导的过程，其中珊瑚息肉会消化将其与其他群体成员相连的组织，最终从骨骼上脱离，以独立个体的形式继续生存。多年来，珊瑚生物学家已认识到息肉逃逸这一过程，但直到最近，通过该过程产生的微繁殖体才被认可为珊瑚生物学研究的模型系统。利用息肉逃逸可从单个珊瑚碎片产生大量克隆单位。另一优势在于，单个息肉或息肉群可在显微镜下轻松观察，并可在成本低廉且高度标准化的环境中（如培养皿、烧瓶和微流控芯片）长期维持。本实验方案展示了可重复诱导珊瑚微繁殖的方法，以及长期维持单个息肉存活的不同策略。该方法已成功将疣状杯形珊瑚（Pocillopora verrucosa）的息肉在逃逸后培养长达8周，体现了利用单个珊瑚息肉进行珊瑚研究的实用性。

多管水螅逃逸现象在属于同一 P. verrucosa 群体的珊瑚碎片中通过三种不同方法诱导产生（图1）。通过蒸发海水诱导高盐度的逃逸方法，在室温下将珊瑚碎片置于初始盐度为40 PSU的培养皿水中孵育24小时后完成，此时水分完全蒸发，最终盐度达到59 PSU（图2A-C,I）。通过添加盐水诱导的逃逸也在24小时孵育后完成：初始盐度为40 PSU的水在12小时后升至52 PSU，并在24小时实验结束时达到59 PSU（图2D-F,I）。在这两个实验中，盐度的升高均导致多管水螅启动组织消化过程。12小时后，高盐条件引起多管水螅收缩，并伴随共肉组织逐渐变薄，最终在24小时后导致多管水螅完全脱离。通过在无钙海水（CaFSW）中孵育诱导逃逸的方法，则在CaFSW中孵育3小时后，再转入20% DMEM培养基中孵育20小时完成（图2G-H）。在这三种方法中，均使用移液器推动使组织与骨骼分离，从而获得独立的珊瑚多管水螅（图3A-C）以及“组织球”。
脱离后，采用三种方法获得的水螅体均被收集起来，并在分配至覆盖有网片的培养皿或细胞培养瓶之前，置于海水中恢复。通过蒸发法和供水法获得的水螅体分别被饲养在水族箱内的培养皿中，存活时间分别为6周和8周（图3D 和 图3F）。这些微繁殖个体保持了水螅体正常的解剖结构，具有触手、基盘和口1。通过无钙海水孵育法获得的水螅体寿命较短，仅存活约1天，随后其组织发生解离。采用海水蒸发法获得并置于培养箱中细胞培养瓶内维持的水螅体，可存活长达3周，且未出现组织解离现象（图3F）。在所有情况下，尽管水螅体无法附着于基质，但外观健康，体色保持正常，其组织内仍可观察到虫黄藻细胞1。
<img alt="利用蒸发和高盐度海水进行珊瑚碎片化过程的示意图，以及培养结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：三种不同测试方法诱导珊瑚虫出逃（左侧）的示意图，以及两种在实验室条件下维持所获珊瑚虫的方法示意图（右侧）。（A）通过水分蒸发诱导珊瑚虫出逃的方法示意图。（B）通过供给高盐度海水诱导珊瑚虫出逃的方法示意图。（C）通过无钙海水培养诱导珊瑚虫出逃的方法示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="珊瑚应激反应实验；进程图像 A-H；盐度图 I；珊瑚礁生态学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用三种不同方法诱导珊瑚物种 P. verrucosa 珊瑚碎片发生息肉逃逸过程的图像。（A-C）采用水分蒸发法，在培养皿中孵育后，分别于 0 h、12 h 和 24 h 观察到的珊瑚碎片。（D-F）采用高盐度海水供给法，在孵育后分别于 0 h、12 h 和 24 h 观察到的珊瑚碎片。（G,H）分别在使用无钙海水孵育法处理前和处理后的珊瑚碎片。在无钙人工海水中孵育时间为 3 h，在 20% DMEM 中孵育时间为 21 h。（I） 在水分蒸发法和高盐度海水供给法诱导息肉逃逸过程中，海水盐度（PSU）随时间变化的图示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="海洋浮游生物的显微成像；生物体形态学；用于环境研究的浮游生物研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：图像 P. verrucosa 通过三种展示的紧急诱导方案获得的息肉。 (A-C分别采用蒸发法、盐水供给法和无钙海水法获得的水螅体图像，均在从骨骼上脱离后立即拍摄。D) 经蒸发法获得的珊瑚息肉图像，该息肉在培养皿中存活了6周。E) 通过海水供应法获得的珊瑚息肉图像，该息肉在培养皿中存活了8周。F通过蒸发法获得的珊瑚息肉图像，该息肉在细胞培养瓶中存活了3周。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

珊瑚息肉逃逸（polyp bail-out）是一种由急性胁迫引发的过程，其中珊瑚息肉消化连接其与群体的组织，并脱离群体以个体形式独立生活。本实验方案描述了如何通过高盐度或无钙海水处理诱导珊瑚息肉逃逸，从而实现珊瑚的微繁殖。

珊瑚是由称为息肉的模块化单位组成的群体性动物。珊瑚息肉在生理上相互关联，并由组织连接。……的现象

珊瑚微繁殖技术仍处于起步阶段。优化水螅体逃逸的实验方案是填补这一空白的关键，可使科学家在实验室环境中利用水螅体作为研究珊瑚的模型。通过水螅体逃逸，能够从小段珊瑚碎片中产生多个繁殖个体。息肉可用于不同的实验，例如有助于观察珊瑚中的微观过程。珊瑚礁正面临威胁。我们的目标是利用这一可重复的模型，高效且非侵入性地开发保护珊瑚免受白化及其他环境威胁的策略。该方法可有助于研究珊瑚生理学、宿主微生物组相互作用以及白化过程中涉及的机制。此类发现可为优化珊瑚益生菌提供依据，例如。使用盐度适宜的海水至关重要。盐度必须从珊瑚自然生存环境的水平开始，并缓慢升高，以避免造成过度有害的胁迫。在正确的时间采集息肉，并选择最完整的个体，对其存活至关重要。直观的演示对于理解这些关键操作步骤十分必要。首先，使用斜口剪钳从珊瑚群体上切下小片段，然后将其放入盛有12毫升海水的小培养皿中，该海水应与珊瑚群体所适应的环境一致。在室温下将培养皿敞口放置约24小时，使水分蒸发，盐度逐渐升高。当观察到珊瑚虫之间出现组织消化现象时，使用1毫升移液器在珊瑚组织附近产生轻柔的液流。水流将缓慢帮助完成已消化周围组织的息肉从骨骼上的脱离，然后用移液管缓慢将培养皿中的水更换为等渗海水。为制备高盐度海水，取正常海水并加入氯化钠，配制3升高盐度海水，使盐度提高85%。按照之前演示的方法切割出小段珊瑚后，将其放入一个10升的容器中，容器内盛有3升与蠕动泵相连的等渗海水。以每小时126毫升的速度，将3升预先配制的高盐度海水加入该容器中，持续24小时，使盐度提高约40%。使用移液管产生轻柔的水流，使息肉从骨骼上释放出来。缓慢用等渗海水替换容器中的水。向一升去离子水中加入26.29克氯化钠、0.872克氯化钾、2.16克硫酸镁、11.94克氯化镁、3.42克硫酸钠和0.26克碳酸氢钠，配制无钙海水，然后用该无钙海水填充培养皿。切割小型珊瑚片段后，将其浸入培养皿中的无钙海水中。将培养皿放入摇床培养箱中，在80 rpm转速下孵育3小时，然后将组织碎片转移至含有20% DMEM的培养皿中，DMEM用盐度为40实用盐度单位的人工海水配制，并含有100毫克/升的氨苄青霉素。在26°C、80 rpm条件下孵育组织碎片。每天更换培养液，直至观察到组织消化现象，即息肉之间出现分离且单个息肉开始从骨骼上脱落，随后将息肉转移至无菌海水并孵育1小时。将水螅体放回具有非胁迫性盐度的过滤海水中后，在体视显微镜下观察组织完整性和纤毛流动引起的运动，以筛选出有活力的水螅体。将选出的水螅体放入培养皿中，并用孔径为200微米的浮游生物网覆盖培养皿，防止水螅体漂出皿外。将培养皿置于适合所用珊瑚物种生长条件的水族箱中。为防止藻类过度生长，应至少每周打开一次培养皿，更换水体并清洁培养皿。如前所述挑选水螅体后，使用移液管将其转移至装有50毫升等渗海水的75平方厘米表面积细胞培养瓶中，然后盖紧瓶盖，放入培养箱中培养，培养条件为12小时光照循环、26摄氏度、转速40 rpm。若培养瓶内出现大量藻类或生物膜，需将内容物转移至洁净的培养瓶中。本研究中，多足水螅的脱离现象通过三种不同方法诱导。水分蒸发法在孵育24小时内导致完全脱离，盐度在24小时后从40升至59个实用盐度单位。盐水供给法在孵育24小时后也导致了多足水螅的脱离。在此，经过12小时孵育后，盐度从40升至52个实用盐度单位，24小时后进一步升至59个实用盐度单位。通过在无钙海水中孵育进行的“中止诱导”方法，在息肉孵育3小时后完成，随后在20%DMEM培养基中继续孵育20小时。这三种方法均可生成单个的珊瑚息肉。通过蒸发法生成的珊瑚息肉可在水族箱内的培养皿中存活六周，而通过高盐度海水供给法生成的息肉则可在培养皿中存活八周。通过海水蒸发法获得的水螅体，在置于培养箱内的细胞培养瓶中可存活长达三周，且组织未发生完全解离。在将水螅体从骨骼上分离时，操作需轻柔。若水螅体未完全脱离，强行通过剧烈吹打水流来促进脱离，会造成损伤并降低存活率。通过这些方法，可以诱导水螅体的附着。水螅体附着研究有助于解答关于其钙化和生长过程的问题。在水螅体逃逸诱导技术建立之后，研究人员得以研究珊瑚骨骼的初始形成过程，并在水螅体尺度上直接观察珊瑚白化现象。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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