Name: 一种用于微蛋白鉴定和序列分析的综合方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 了解如何使用PhyloCSF在UCSC基因组浏览器上分析基因组区域，以识别具有微蛋白编码潜力的保守短开放阅读框。该方法无需生物信息学背景即可操作，适用于各类研究人员。

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本研究由美国国立卫生研究院（HL-141630 和 HL-160569）以及辛辛那提儿童研究基金会（受托人奖）的资助支持。

以下方案详细说明了如何在 UCSC 基因组浏览器上加载并浏览 PhyloCSF 浏览轨道（由 Mudge 等人49生成）。有关 UCSC 基因组浏览器的一般问题，可在此处查阅详尽的《基因组浏览器用户指南》：&#160;<a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</a>。
1. 将 PhyloCSF 轨道中心加载到 UCSC 基因组浏览器
<ol>
	<li>打开一个互联网浏览器窗口，访问 UCSC 基因组浏览器（<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>）。</li>
	<li>在 Our tools 标题下，选择 Track Hubs 选项。 
	注意：Track Hubs 选项也可在 My Data 标签页下找到。</li>
	<li>在 Public Hubs 标签页中，于 Search terms 搜索框内输入 PhyloCSF ，然后点击 Search Public Hubs 按钮。</li>
	<li>通过点击 Hub 名称为 PhyloCSF （描述：由 PhyloCSF 测量的进化蛋白质编码潜力）对应的 Connect 按钮，连接至 PhyloCSF。 
	&#8203;注意：该 Track Hub 将加载至多个基因组组装版本，包括人（hg19 和 hg38）以及小鼠（mm10 和 mm39）。</li>
	<li>点击 connect 后，请等待页面重定向至 UCSC 基因组浏览器网关页面（<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a>）。</li>
</ol>
2. 使用基因标识符定位目标基因
<ol>
	<li>选择要查询的物种和基因组组装版本。若要查询其他物种（例如小鼠），请在浏览/选择物种标题下点击相应的图标以选择目标物种，或在标有输入物种、通用名称或组装ID的文本框中输入物种名称。 
	注意：基因组组装版本在查找位置标题下方直接列出。通常默认为人类基因组组装版本（例如，2009年12月 [GRCh37/hg19]）。</li>
	<li>在查找位置标题下的下拉菜单中选择要搜索的基因组组装版本。</li>
	<li>在位置/搜索词框中输入位置、基因符号或搜索关键词，然后点击前往，以在基因组浏览器中定位到目标基因。</li>
	<li>如果搜索结果包含多个匹配项，请等待页面跳转至需要选择特定目标位置的页面，然后点击相应的目标基因。</li>
</ol>
3. 使用序列信息导航至感兴趣的基因组区域
<ol>
	<li>访问 UCSC 基因组浏览器（<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>），在&#160;Our tools 标题下选择 BLAST 类似比对工具（BLAT），以查询特定的 DNA 或蛋白质序列。或者，将光标悬停在 Tools 选项卡上，选择 Blat 选项，或直接访问此链接：&#160;<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a>。</li>
	<li>使用下拉菜单选择感兴趣的物种（Genome）和 Assembly 版本。</li>
	<li>使用下拉菜单定义 Query type。</li>
	<li>将感兴趣的序列粘贴到 BLAT 搜索基因组 文本框中，然后点击 提交。</li>
	<li>点击 ACTIONS 标题下的 browser 链接，以跳转至感兴趣的基因组区域。</li>
</ol>
4. 利用 PhyloCSF 轨道数据鉴定保守的 sORF
<ol>
	<li>在感兴趣的基因组区域内，目视扫描具有正得分的 PhyloCSF 区域（图1). 
	注意：有关如何在 UCSC 基因组浏览器上直观解读 PhyloCSF 得分的详细说明，请参见下文的代表性结果部分。</li>
	<li>使用 缩放 功能可放大特定区域，以检查序列特征并查找起始/终止密码子。要手动缩放，请按住 移位 关键和 点击 和 保持 的 鼠标按钮 在拖动感兴趣区域的同时。或者，使用 放大 和 缩小 使用页面顶部的按钮进行导航（可选 1.5x、3x、10x 或原始倍率缩放选项）。 
	注意：在使用之前 放大/缩小 按钮，需要重新定位基因，使目标区域位于屏幕中央。执行此操作时，可单击图像并左右拖动，以水平移动基因组区域至所需位置，或使用 移动 页面顶部的箭头。</li>
	<li>放大至核苷酸（碱基）序列可见。 
	注意：核苷酸序列将直接显示在 +1 平滑 PhyloCSF 得分的上方。</li>
	<li>目视扫描正得分 PhyloCSF 区域起始和末端附近的核苷酸序列，以识别潜在的起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA/TAA/TAG）。 
	注意：如果目标基因位于DNA的负链上，则起始密码子和终止密码子应为反向互补序列（即起始密码子为CAT，终止密码子为TCA/TTA/CTA）。</li>
</ol>
5. 查看其他基因组中的同源区域
<ol>
	<li>将鼠标悬停在页面顶部的 查看 标题上，然后点击 在其他基因组中（转换） 选项。</li>
	<li>使用 新基因组 标题下方的下拉菜单，定义感兴趣的基因组。</li>
	<li>使用 新组装 标题下方的下拉菜单选择感兴趣的基因组组装版本，然后点击 提交 按钮。</li>
	<li>当浏览器返回新组装中具有相似性的区域列表后，点击 染色体位置 链接，以跳转至感兴趣的同源区域。 
	注意：每个列出的区域将标明其所覆盖的总碱基（核苷酸）百分比及跨度。匹配碱基的百分比越高，表明该区域的保守性越高。</li>
	<li>按照第4节中详述的相同导航策略来分析序列。</li>
</ol>
6. 生成目标微蛋白的多物种序列比对
<ol>
	<li>点击 目的基因 在 GENCODE 轨道 在 UCSC 基因组浏览器上（用括号标出） 图1A 单击蓝色框）以跳转至基因描述页面。</li>
	<li>在……之下 序列及工具与数据库链接 标题，点击表格中显示的链接 其他物种 FASTA.</li>
	<li>点击与目标物种相关的复选框以进行选择。点击 提交将页面底部以FASTA格式显示的序列复制并粘贴到文字处理文档中。</li>
	<li>打开第二个浏览器窗口并导航至 Clustal Omega 多序列比对 工具52 在欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）网站上53,54: <a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a>.</li>
	<li>将仍位于剪贴板中的序列文件粘贴到框中 步骤 1 读取 任何支持格式的序列滚动至页面底部并点击 提交在比对结果（黑色字体）下方查看表示每个氨基酸保守程度的符号（符号定义见 表1). 
	注意：生成比对可能需要几分钟时间。</li>
	<li>要以颜色查看氨基酸特性，请点击 显示颜色 直接在序列上方链接，以根据氨基酸的性质（在文中定义）为其着色 表 2).</li>
	<li>将序列比对结果复制并粘贴到文字处理或幻灯片程序中，以生成图表或插图文件（例如， 图2). 
	注意：请使用等宽字体（如 Courier）进行序列比对。</li>
	<li>要查看该系统的其他输出 Clustal Omega 结果页面，点击相应的标签（即 引导树 或 系统发育树).</li>
	<li>点击 结果查看器 使用 Jalview 查看序列信息的选项标签，Jalview 是一款专注于多序列比对编辑、可视化和分析的免费软件55，或访问直接链接至 MView 和 简单的系统发育分析56.</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文提供的实验方案详细介绍了如何在用户友好的 UCSC 基因组浏览器上，利用 PhyloCSF 对感兴趣的基因组区域进行分析，以评估其编码微蛋白的潜力。48,49,50,51如上所述，PhyloCSF 是一种强大的比较基因组学算法，通过整合系统发育模型和密码子替换频率，识别出典型蛋白质编码基因的进化特征48,49PhyloCSF 已被广泛用于鉴定先前注释为非编码的基因组区域中的功能性微蛋白38,39,40,41<s...

自人类基因组计划启动以来，鉴定基因组中全部编码元件一直是主要目标之一，并且仍是理解生物系统及基于遗传的疾病病因学的核心目标1,2,3,4。下一代测序（NGS）技术的进步已实现了对大量生物体（包括脊椎动物、无脊椎动物、酵母和植物）的全基因组测序5。此外，高通量转录测序方法进一步揭示了细胞转录组的复杂性，并鉴定了数千种具有蛋白质编码和非编码功能的新型RNA分子6,7。解读这一海量序列信息仍是一个持续进行的过程，全面的基因注释工作仍面临诸多挑战8。
近年来，转译谱型技术的发展，包括核糖体谱型分析9,10和多聚核糖体测序11，提供了证据表明，数百个非常规翻译事件定位于基因组中目前尚未注释的小开放阅读框（sORF），有可能产生被称为微蛋白或微肽的小分子蛋白质12,13,14,15,16,17。由于尺寸较小（&#60;100个氨基酸）且缺乏经典蛋白编码基因的特征，微蛋白此前一直被标准基因注释方法所忽视，现已成为一类新发现的多功能蛋白质8,12,18,19,20。微蛋白几乎在所有生物体中均有报道，包括酵母21,22、果蝇17,23,24和哺乳动物25,26,27,28，并已被证明在发育、代谢和应激信号传导等多种生物学过程中发挥关键作用19,20,29,30,31,32,33,34。因此，迫切需要继续挖掘基因组中这一长期被忽视的功能性小蛋白家族的更多成员。
尽管微蛋白在生物学上的重要性已得到广泛认可，但这类基因在基因组注释中仍严重缺失，其精确鉴定仍然是该领域持续面临的挑战，阻碍了相关研究的进展。近年来已开发出多种计算工具和实验方法，以克服识别微蛋白编码序列所面临的困难（已在多篇综述中进行了详尽讨论8,35,36,37）。许多近期的微蛋白鉴定研究38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 高度依赖于一种名为 PhyloCSF48,49 的算法，这是一种强大的比较基因组学方法，可用于区分基因组中保守的蛋白质编码区与非编码区。
PhyloCSF 利用多物种核苷酸比对和系统发育模型，通过比较密码子替换频率（CSF）来检测蛋白质编码基因的进化特征。这种基于经验模型的方法依赖于一个前提：蛋白质的保守性主要体现在氨基酸水平，而非核苷酸序列水平。因此，编码相同氨基酸的同义密码子替换，或替换为具有保守性质（如电荷、疏水性、极性）氨基酸的密码子替换，得分较高；而包括错义和无义替换在内的非同义替换则得分较低。PhyloCSF 在全基因组数据上进行训练，已被证明在无需完整序列的情况下，能够有效对编码序列（CDS）的短片段进行评分，这在分析微蛋白或标准蛋白质编码基因的单个外显子时尤为必要48,49。
值得注意的是，近期加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz，UCSC）基因组浏览器中整合了 PhyloCSF 轨道中心49,50,51，使得各领域研究人员均可通过用户友好的界面，便捷地查询感兴趣基因组区域的蛋白质编码潜力。下述方案详细说明了如何在 UCSC 基因组浏览器中加载 PhyloCSF 轨道中心，并进一步分析感兴趣的基因组区域，以探测高置信度的蛋白质编码区域（或其缺失情况）。此外，若观察到显著的 PhyloCSF 正分值，本文还列出了进一步分析微蛋白编码潜力的步骤，并高效生成所鉴定氨基酸序列的多物种比对，以展示跨物种的序列保守性。最后，在讨论部分介绍了若干其他公开可用的资源与工具，用于系统分析所鉴定微蛋白的特征，包括预测的结构域结构以及对微蛋白潜在功能的深入理解。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;网站&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;网站地址&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;要求&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Clustal Omega 多序列比对工具</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/&quot;&gt;https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>用于高效比对 FASTA 序列的多序列比对程序（例如用于已鉴定微蛋白的跨物种比较）</td></tr><tr><td>COXPRESSdb</td><td>&lt;a href=&quot;https://coxpresdb.jp&quot;&gt;https://coxpresdb.jp&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>提供共调控基因关系以估计基因功能</td></tr><tr><td>EMBL-EBI 生物信息学工具常见问题解答</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ&quot;&gt;https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>EMBL-EBI 工具常见问题解答（FAQs）。包含蛋白质序列比对的颜色编码说明</td></tr><tr><td>欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）&lt;br/&gt; 工具与数据资源</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.ebi.ac.uk/services/all&quot;&gt;https://www.ebi.ac.uk/services/all&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>免费提供的网站、工具及数据资源综合列表</td></tr><tr><td>Expasy - 瑞士生物信息学资源门户</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.expasy.org&quot;&gt;https://www.expasy.org&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>由瑞士生物信息学研究所（SIB）维护的一套用于蛋白质序列分析的生物信息学工具与资源</td></tr><tr><td>美国国家生物技术信息中心（NCBI）&lt;br/&gt; 保守结构域搜索</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi&quot;&gt;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>用于识别蛋白质或编码核苷酸序列中保守结构域的搜索工具</td></tr><tr><td>Pfam 35</td><td>&lt;a href=&quot;http://pfam.xfam.org&quot;&gt;http://pfam.xfam.org&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>蛋白家族（Pfam）数据库提供了蛋白家族和结构域的比对与分类</td></tr><tr><td>PhyloCSF 轨道中心描述</td><td>&lt;a href=&quot;https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5QedaCd4ir8aZ65ryaD&amp;&db=mm10&amp;amp；c=chr2&amp;&g=hub_109801_PhyloCSF_smooth&quot;&gt; https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q&lt;br/&gt;edaCd4ir8aZ65ryaD&amp;&db=mm10&lt;br/&amp;>&amp;amp;c=chr2&amp;amp;g=hub_109801_&lt;br/&gt;PhyloCSF_smooth&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>平滑 PhyloCSF 轨道与 PhyloCSF 轨道中心的详细说明&lt;br/&gt;&amp;nbsp; &amp;nbsp;&lt;br/&gt;&amp;nbsp; &amp;nbsp;&lt;br/&gt;&amp;nbsp; &amp;nbsp;&lt;br/&gt;&amp;nbsp; &amp;nbsp;&lt;br/&gt;&amp;nbsp; &amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>SignalP 6.0</td><td>&lt;a href=&quot;https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0&quot;&gt;https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>预测信号肽的存在及其切割位点的位置</td></tr><tr><td>TMHMM - 2.0</td><td>&lt;a href=&quot;https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0&quot;&gt;https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>蛋白质中跨膜螺旋的预测</td></tr><tr><td>UCSC基因组浏览器BLAT搜索</td><td>&lt;a href=&quot;https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat&quot;&gt;https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>利用 DNA 或蛋白质序列信息查找基因组区域的工具</td></tr><tr><td>UCSC基因组浏览器网关</td><td>&lt;a href=&quot;https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway&quot;&gt;https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>UCSC基因组浏览器网关的直接链接</td></tr><tr><td>加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器主页</td><td>&lt;a href=&quot;https://genome.ucsc.edu/&quot;&gt;https://genome.ucsc.edu/&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>UCSC基因组浏览器主页网站</td></tr><tr><td>UCSC基因组浏览器轨道数据中心</td><td>&lt;a href=&quot;https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs&quot;&gt;https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>直接链接至 Track Data Hubs/公共中心数据库，用于搜索并加载 PhyloCSF 轨道</td></tr><tr><td>UCSC基因组浏览器用户指南</td><td>&lt;a href=&quot;https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html&quot;&gt;https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>全面用户指南：详细介绍如何使用 UCSC 基因组浏览器</td></tr><tr><td>WoLF PSORT</td><td>&lt;a href=&quot;https://wolfpsort.hgc.jp&quot;&gt;https://wolfpsort.hgc.jp&lt;/a&gt;</td><td>网络浏览器</td><td>蛋白质亚细胞定位预测工具</td></tr></tbody></table>

一种用于微蛋白鉴定与序列分析的整合方法

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

下一代测序技术（NGS）推动了基因组学领域的发展，已获得多种动物物种和模式生物的全基因组序列。然而，尽管存在大量序列信息，全面的基因注释工作仍面临挑战，尤其是对于小蛋白质而言。值得注意的是，传统的蛋白质注释方法在设计时有意排除了由长度小于300个核苷酸的短开放阅读框（sORF）编码的潜在蛋白质，以过滤掉基因组中数量呈指数级增长的虚假非编码sORF。因此，数百种被称为微蛋白（microprotein）的功能性小蛋白（长度&#60;100个氨基酸）被错误地归类为非编码RNA或完全被忽视。
本文提供了一项详细方案，用于利用免费且公开的生物信息学工具，基于进化保守性对基因组区域进行查询，以评估其编码微蛋白的潜力。具体而言，我们逐步介绍了如何在用户友好的加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器上，使用系统发育密码子替换频率（Phylogenetic Codon Substitution Frequencies, PhyloCSF）分析序列保守性和编码潜力。此外，我们还详细说明了如何高效生成已鉴定微蛋白序列的多物种比对，以可视化氨基酸序列的保守性，并推荐了可用于分析微蛋白特征的资源，包括预测的结构域结构。这些强大的工具可用于帮助识别非经典基因组区域中潜在的微蛋白编码序列，或排除在特定非编码转录本中存在具有翻译潜力的保守编码序列的可能性。

本文将以经过验证的微蛋白 mitoregulin（Mtln）为例，说明一个保守的小开放阅读框（sORF）如何产生正的 PhyloCSF 评分，并可在 UCSC 基因组浏览器上直观地展示和分析。mitoregulin 之前被注释为非编码 RNA（人类基因 ID 曾为 LINC00116，小鼠基因 ID 为 1500011K16Rik）。比较基因组学和序列保守性分析方法在其最初发现过程中发挥了关键作用40,57,58,59,60,61，凸显了这些方法的强大能力。本示例将使用小鼠 GRCm38/mm10（2011 年 12 月）基因组组装版本。可通过基因标识符（mitoregulin、Mtln）或基...

本文所述方案提供了在用户友好的 UCSC 基因组浏览器上，利用 PhyloCSF 分析目标基因组区域是否具有编码微蛋白潜力的详细操作步骤。此外，还推荐了多种工具和资源，用于进一步研究已鉴定微蛋白的序列特征，以深入了解其可能的功能。

下一代测序（NGS）推动了基因组学领域的发展，已为多种动物物种和模式生物生成了全基因组序列……

本文所述方案提供了在用户友好的 UCSC 基因组浏览器上利用 phyloCSF 分析目标基因组区域蛋白质编码潜力的详细操作指南。phyloCSF 能够有效识别当前注释为非编码区域中具有微蛋白编码潜力的保守短开放阅读框。本文描述的方法操作简便，无需生物信息学或比较基因组学背景或专业知识，各类研究背景的科研人员均可轻松实施。首先，打开一个互联网浏览器窗口，访问加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器。在“我们的工具”标题下，选择“track hubs”选项。在“公共hub”标签页的搜索框中输入 phyloCSF。然后，点击“搜索公共中心”按钮。通过点击名为 phyloCSF 的中心对应的连接按钮，连接到 phyloCSF。点击连接后，请等待页面跳转至 UCSC 基因组浏览器网关页面。若要查询其他物种，请在“浏览或选择物种”标题下点击相应的图标以选择目标物种，或在提示“输入物种常用名或基因组组装ID”的文本框中输入物种名称。使用下拉菜单在“定义位置”标题下选择要搜索的基因组组装版本，然后在“位置或搜索词”框中输入位置、基因符号或搜索关键词，点击“前往”按钮，以在基因组浏览器中定位目标基因。如果搜索结果返回多个匹配项，请等待页面跳转至需要选择特定位置的页面，然后点击相应的目标基因。进入UCSC基因组浏览器后，在“我们的工具”标题下选择“类似BLAST的比对工具”（BLAT），以查询特定的DNA或蛋白质序列。或者，将光标悬停在工具选项卡上，选择 blat 选项，或点击提供的链接。在下拉菜单中选择感兴趣的物种、基因组和组装版本。然后，定义查询类型，将感兴趣的序列粘贴到 blat 搜索基因组文本框中，然后点击提交。接下来，点击“操作”标题下的浏览器链接，导航至目标基因组区域。在目标基因组区域内目视扫描具有正得分的 phyloCSF 区域。使用缩放功能放大感兴趣的区域，以检查序列特征，并搜索起始密码子和终止密码子。手动放大时，按住 Shift 键，同时点击并按住鼠标按钮，沿目标区域拖动。或者，使用页面顶部的放大和缩小按钮进行导航。持续放大直至核苷酸或碱基序列清晰可见。在正得分的 phyloCSF 区域的起始和末端附近，目视扫描核苷酸序列，以识别潜在的起始密码子和终止密码子。将鼠标悬停在页面顶部的视图标题上，点击“在其他基因组中转换”选项，然后在新基因组标题下方的下拉菜单中选择目标基因组。在新组装标题下选择感兴趣的基因组组装版本，然后点击提交按钮。当浏览器返回新组装结果中具有相似性的区域列表后，点击染色体位置链接，以导航至同源的目标区域。按照前文所述的导航策略，对序列进行分析。要导航至基因描述页面，请在 UCSC 基因组浏览器的基因编码轨迹中点击感兴趣的基因。在“序列及工具与数据库链接”标题下方，点击表格中显示为“其他物种（更快）”的链接。勾选与目标物种相关的复选框以选择这些物种。然后，点击提交。将页面底部以更快格式显示的序列复制并粘贴到文字处理文档中。接着，打开第二个浏览器窗口，并访问欧洲生物信息研究所网站上的 Clustal Omega 多序列比对工具。将剪贴板中的序列文件粘贴到第一步中标注为“以任何支持的格式输入序列”的框中。滚动至页面底部并点击提交。在下方比对结果中观察符号，这些符号表示每个氨基酸保守程度的高低。要查看氨基酸的性质并进行着色，请点击序列正上方的“显示颜色”链接，以根据氨基酸的性质对其进行着色。然后将序列比对结果复制并粘贴到文字处理或幻灯片演示程序中，以生成图表或插图文件。如需查看Clustal Omega结果页面的其他输出内容，请点击“引导树”或“系统发育树”标签页。最后，单击结果查看器的选项卡，以使用 Jalview 查看序列信息，或访问 mview 和简单系统发育分析的直接链接。对 mitoregulin 基因进行的代表性 phyloCSF 分析表明，存在一个与已验证的微蛋白相对应的高序列保守区域。完整的 mitoregulin 编码序列位于第一外显子内，在 phyloCSF 负一轨道上的得分非常高。在 phyloCSF 负一轨道中，正得分区域的起始位置可以观察到一个保守的起始密码子。Mitoregulin 第一个外显子中的正得分区域直接起始于一个起始密码子，并在终止密码子处结束。此处展示了八种不同物种的微蛋白 mitoregulin 的多序列比对结果。对长链非编码RNA hot air的分析显示，在全部六个读数轨道上，该基因的整个区域均呈现负分值，表明其序列缺乏保守性，支持hot air被正确注释为非编码RNA。对小鼠one, eight, one, zero, zero, five, eight, I 24 rike基因的PhyloCSF分析显示，一个保守的开放阅读框跨越了三个外显子，其正向PhyloCSF分值从外显子一的+2轨道跃升至外显子二的+3轨道，随后又回到外显子三的+2轨道。对meet one基因位点的PhyloCSF分析也被有效用于识别单个RNA分子内多个不同的编码开放阅读框。需要注意的是，尽管较高的phyloCSF得分强烈提示存在微蛋白编码能力，但这一证据本身并不足以确证，必须通过实验加以验证。一旦鉴定出潜在的微蛋白编码区，即可对其氨基酸序列进行分析，以寻找保守结构域或序列特征，从而推测其功能。phyloCSF已成功用于在先前被认为是非编码的基因组区域中发现新的微蛋白，未来仍将是微蛋白鉴定研究中的有力工具。

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