分子和免疫技术在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中
May 2nd, 2022
本手稿的目的是描述 试剂盒V558Δ/+小鼠模型以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。
我们的方案描述了目前唯一使用的免疫活性小鼠模型GIST的育种，维护，解剖和标本处理。我们希望未来的研究人员能够利用这种小鼠模型，以便在GIST中进一步进行转化研究。GIST的传统疗法包括使用酪氨酸激酶抑制剂进行靶向分子治疗。
该模型使研究人员能够在GIST中测试免疫疗法。首先，对所有器械进行消毒，在整个过程中戴上手套，并保持无菌状态。用70%乙醇准备切口区域。
用剪刀做一个两厘米的中线垂直切口，进入腹腔。锐利地裂开任何腹腔内粘连。要切除引流肠系膜淋巴结，请识别盲肠并上位抬高其肠系膜。
大约在结肠肠系膜底部的中间，识别肠系膜淋巴结并急剧解剖。根据需要，将淋巴结组织分成三分之一，用于蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。将淋巴结组织置于20毫升RPMI培养基中以进行单细胞悬浮液并保持在冰上。
盲肠在Kit558小鼠中大多被GIST取代。为了分离GIST和盲肠，小心地将回肠结肠连接处与肿瘤的底部分开。然后，再次将盲肠分开，在肿瘤基部远端两厘米处。
在50%至60%的Kit558小鼠中，肿瘤的头部含有盲肠组织的盖子，其通常含有浆液，但可能很少含有脓液。尖锐地解剖帽状组织，使其远离肿瘤组织。将肿瘤组织和盲肠分成三部分，用于蛋白质分离、组织学和单细胞悬浮液。
对于单细胞悬浮液，将肿瘤组织或盲肠置于含有2%FCS的HBSS中，足以覆盖样品，并保持在冰上。将RPMI培养基与淋巴结标本一起倒入100微米过滤器上。将过滤器移动到新的50毫升圆锥形，并用三毫升塑料注射器的软端捣碎淋巴结。
用 20 毫升 RPMI 介质清洗过滤器。离心样品并吸出上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，并倒在40微米过滤器上。
收集细胞滤液。使用血细胞计数器计数细胞。离心样品并弃去上清液。
然后，重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。按照文本手稿中所述制备胶原酶缓冲液。将GIST放入无菌皿中，加入2.5毫升胶原酶缓冲液。
使用无菌手术刀和剪刀，切碎肿瘤，直到它变成细小的碎片。使用大口径移液管将肿瘤和胶原酶吸入50毫升管中。以每分钟100转的速度在37摄氏度下孵育30分钟，然后用两毫升FBS淬灭反应。
将胶原酶与GIST标本一起倒在100微米的过滤器上，并用三毫升塑料注射器的软端捣碎肿瘤并收集在50毫升管中。用20毫升HBSS清洗过滤器。将滤液在450 RCF下在四摄氏度下离心五分钟，然后弃去上清液。
将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，倒在40微米过滤器上收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。离心并吸出上清液，然后重悬于磁珠缓冲液中以进行流式细胞术。使用剪刀，纵向分开盲肠以暴露内粘膜。
将其切成0.5厘米的部分，并将其放入50毫升的管中，其中含有5毫升的HBSS和2%的FBS。剧烈摇晃30秒，以450 RCF离心20秒。然后，丢弃上清液。
加入 5 至 20 毫升 HBSS 和 2 毫摩尔 EDTA。在37摄氏度下以每分钟100转的速度孵育15分钟。离心并弃去上清液，然后将沉淀重悬于5至20毫升HBSS中。
剧烈摇动混合物30秒，然后在450 RCF下离心20秒，弃去上清液。再次重复此过程。将沉淀重悬于5毫升胶原酶缓冲液中，然后在37摄氏度下以每分钟100转的速度孵育30分钟。
每10分钟剧烈摇动一次，并用两毫升FBS淬灭反应。将胶原蛋白酶与盲肠标本倒在100微米的过滤器上，并用三毫升塑料注射器的软端捣碎。用20毫升HBSS洗涤过滤器并收集滤液。
离心并弃去上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，并倒在40微米过滤器上。收集滤液并使用血细胞计数器计数细胞。
再次重复离心过程，并将沉淀重悬于珠缓冲液中以进行流式细胞术。由于进行性肠梗阻，Kit558小鼠的平均寿命为八个月。来自Kit558小鼠的肿瘤表达GIST的规范标志物，包括酪氨酸激酶KIT，跨膜通道Dog1和转录因子ETV1。
研究了肿瘤中KIT信号通路的变化，例如下游标志物ERK和AKT或免疫微环境，其密切模仿人类GIST。MRI或CT用于跟踪肿瘤体积，作为肿瘤反应的准确测量。将肿瘤从回肠结肠连接处和盲肠帽剥离对于捕获真正的肿瘤重量以及免疫和分子分析非常重要。
在GIST中，该模型允许研究肿瘤微环境以及免疫疗法。
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概述
本手稿描述了Kit V558Δ/+小鼠模型，并概述了成功解剖和处理小鼠标本的技术。该协议旨在使用这种免疫能力正常的模型促进胃肠道间质瘤（GIST）的转化研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 转化研究
背景
- Kit V558Δ/+小鼠模型目前是GIST的唯一免疫能力正常的模型。
- GIST的传统治疗涉及靶向分子治疗。
- 该模型允许测试免疫疗法。
- 正确的解剖和标本处理对于研究准确性至关重要。
研究目的
- 描述Kit V558Δ/+小鼠模型的培育和维护。
- 提供详细的解剖和标本处理协议。
- 增强对GIST的理解并改善研究方法。
使用的方法
- Kit V558Δ/+小鼠模型的培育和维护。
- 器具的灭菌和保持无菌场。
- 用70%乙醇准备切口区域。
- 详细的解剖和标本处理技术。
主要结果
- 该协议确保标本的成功解剖和处理。
- 促进Kit V558Δ/+模型在未来研究中的使用。
- 为GIST中的免疫疗法测试提供基础。
结论
- Kit V558Δ/+小鼠模型是GIST研究的宝贵工具。
- 解剖和处理的正确技术对于可靠的研究结果至关重要。
- 本研究旨在支持GIST的未来转化研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
The KitV558Δ/+ genetically engineered mouse model provides an immunocompetent, disease-relevant system for translational research in gastrointestinal stromal tumor (GIST). This model enables rigorous evaluation of both targeted molecular and immune therapies, addressing the limitations of xenograft models and supporting predictive confidence in preclinical oncology pipelines. Its alignment with human GIST histology and immune microenvironment enhances mechanistic de-risking and informs portfolio advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of KIT-driven oncogenic pathways in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by recapitulating human GIST immune infiltrate and histology.
- Facilitates mechanistic de-risking for both molecular and immunologic therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated tumor and lymphoid tissues for downstream molecular and immunologic assays.
- Enables reproducible preparation of single-cell suspensions for flow cytometry and quantitative analysis.
- Supports assay standardization and scalability for compound and immunotherapy screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical findings with human disease biology, enhancing translational biomarker relevance.
- Enables longitudinal imaging and quantitative tumor response assessment via MRI or CT.
- Supports risk-adjusted advancement of immunotherapies and targeted agents in GIST.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation for GIST, supporting robust hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and immune microenvironment analysis in KIT-mutant GIST.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for molecular and immunologic assays.
- Analytics: Enables measurement of tumor volume, immune cell populations, and pathway activation markers.
- Translational Research: Provides a platform for biomarker alignment and preclinical efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, immunocompetent model for ongoing GIST research and therapeutic evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in GIST research.
- Operational Value: Standardizes specimen processing and assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in oncology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of novel GIST therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetically engineered mouse model breeding and maintenance.
- Demands access to sterile surgical instrumentation and advanced imaging modalities.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for integration with diverse molecular and immunologic assay platforms.
- Model lifespan and tumor progression rates must be considered in experimental design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
KitV558Δ/+ Mouse Organ Harvest
2:26
Single-Cell Suspension of Mesenteric Lymph Node
3:09
Single-Cell Suspension of GIST
4:22
Single-Cell Suspension of Cecum
6:06
Results: Investigation of Therapeutics in an Immunocompetent Mouse Model
6:49
Conclusion
