Name: 分子和免疫技术在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学习Kit V558Δ/+基因工程小鼠模型的解剖与样本处理技术，用于胃肠道间质瘤转化医学研究。该免疫健全模型支持免疫疗法测试，为肿瘤微环境研究提供可靠方法。

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KitV558Δ/+ 小鼠经基因工程改造，由 Peter Besmer 博士提供10。本研究得到美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01 CA102613 和 T32 CA251063。

所有小鼠均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，并在宾夕法尼亚大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准的情况下，于宾夕法尼亚大学的无病原体环境中饲养。安乐死操作遵循宾夕法尼亚大学实验动物资源部的标准操作程序进行。
1. KitV558Δ/+ 小鼠繁育
<ol>
	<li>回交 试剂盒V558Δ/+ 将小鼠在 C57BL/6J 背景上回交超过 10 代，使用 C57BL/6J 小鼠。为此，将雄性 试剂盒V558Δ/+ 小鼠&#160;以1:2的比例与雌性C57BL/6J小鼠配比。 
	注意：纯合的 试剂盒V558Δ/V558Δ 基因型在子宫内致死。可以繁殖雌性 试剂盒V558Δ/+ 与雄性C57BL/6J小鼠交配时，其产仔数约为野生型雌性C57BL/6J小鼠的一半。此外，雌性 试剂盒V558Δ/+ 小鼠&#160;4月龄后产仔数有限。</li>
	<li>通过断趾法在7-14日龄对仔鼠进行基因型鉴定，以确认目标基因的存在 试剂盒V558Δ/+ 基因型鉴定。使用以下引物和报告探针进行基因分型：上游引物：TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA；报告探针1：CCTCGACAACCTTCCA；下游引物：TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT；报告探针2：TCTCCTCGACCTTCCA。</li>
</ol>
2. KitV558Δ/+ 小鼠处理
<ol>
	<li>在治疗前对KitV558Δ/+小鼠进行年龄和性别匹配。使用年龄和性别相匹配的小鼠进行分组，因为雌性KitV558Δ/+小鼠的肿瘤体积大于雄性小鼠。在小鼠8至12周龄时开始治疗，此时肿瘤已稳定形成（图1）。</li>
	<li>通过口服或腹腔（i.p.）注射给予酪氨酸激酶抑制剂；KitV558Δ/+肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂敏感。可将伊马替尼以600 mg/L的浓度加入饮水中给予，或以45 mg/kg的剂量进行每日两次腹腔注射。在步骤3所示的肿瘤分离后，使用电子天平测量肿瘤重量减少情况，结果显示伊马替尼治疗1周后肿瘤重量减少约50%，4周后减少约80%（图2）。</li>
</ol>
3. KitV558Δ/+ 小鼠器官采集
<ol>
	<li>以每分钟60%腔室体积的流速通过CO2麻醉法处死小鼠。呼吸停止后，将小鼠留在腔室内至少2分钟，随后行颈椎脱位以确认死亡。</li>
	<li>所有器械均需灭菌，操作全程佩戴手套，并维持无菌操作区域。用70%乙醇对皮肤进行消毒。使用剪刀做一条2 cm长的正中垂直切口，进入腹腔。锐性分离任何腹腔内粘连组织。</li>
	<li>为取出引流肠系膜淋巴结，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>识别盲肠并将其肠系膜向上提起。在接近结肠系膜根部约一半位置处，识别肠系膜淋巴结，并进行锐性解剖分离。该淋巴结呈乳白色，大小约为0.5 cm × 0.5 cm。</li>
		<li>根据需要，将淋巴结组织分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。对于单细胞悬液，将淋巴结组织置于20 mL无血清培养基（RPMI）中，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为分离胃肠道间质瘤（GIST）和盲肠，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>在KitV558Δ/+小鼠中，盲肠大部分被GIST所取代。小心地从肿瘤基底部分离回盲肠交界处。为采集盲肠，需在肿瘤基底部近端2 cm处再次切断结肠。</li>
		<li>在50%-60%的KitV558Δ/+小鼠中，肿瘤头部包含一层盲肠组织帽状结构，通常含有浆液性液体，但极少数情况下可能含有脓液（图3）。应锐性解剖分离该帽状组织与肿瘤组织。</li>
		<li>根据需要，将肿瘤组织和/或盲肠分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。对于单细胞悬液，将肿瘤组织或盲肠置于含2% FCS的HBSS中，液体量以覆盖样本为宜，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胃肠间质瘤组织的 Western 印迹分析
<ol>
	<li>配制含有 50 mM TrisHCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% 非变性去垢剂、2 mM Na3VO4、1 mM PMSF、10 mM NaF 和 20 μl/ml 蛋白酶抑制剂混合物的组织裂解缓冲液。</li>
	<li>通过将 1800 mL 去离子水、2 mL Tween 20 和 200 mL 10x Tris-缓冲盐溶液 (TBS) 混合，配制含 1% Tween 20 的 1x Tris-缓冲盐溶液 (TBST)。</li>
	<li>将步骤 3.4.3 中的组织在 FACS 管中用 5 mL/g 组织裂解缓冲液重悬，并在冰上使用机械匀浆器以 15,000 rpm 匀浆两次，每次 15 秒。将裂解物在冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>将裂解物转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以最大转速离心 20 分钟。将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>将裂解物上样于 4% 至 15% 的梯度凝胶进行电泳，然后转移至硝酸纤维素膜，操作方法如文献14所述。</li>
	<li>用 1x TBS 洗涤膜一次，每次 5 分钟，然后在 5% 脱脂奶粉中封闭 1 小时。再次用 1x TBS 洗涤膜一次，每次 10 分钟。</li>
	<li>将膜与以 1:1000 比例溶于 5% BSA 中的一抗在 4 °C 下孵育过夜。用 1x TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。随后将膜与以 1:2500 比例溶于 2.5% 脱脂奶粉中的二抗在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>用 1x TBS 洗涤膜一次，每次 5 分钟。加入足量 HRP 底物覆盖膜，通常为 200–500 μL，并使用数字成像系统检测和定量化学发光信号。</li>
</ol>
5. GIST 组织的免疫组织化学
<ol>
	<li>将步骤 3.3.2 或 3.4.3 中的组织在 4 °C 条件下用 4% 多聚甲醛固定过夜。将组织保存在 70% 乙醇中，直至准备进行后续处理。按照文献15,16所述方法，将组织包埋并切成 5 μm 厚的切片，贴附于玻璃载片上。</li>
	<li>使用基础免疫检测试剂盒完成免疫组织化学检测，具体方法如前所述17。</li>
</ol>
6. 肠系膜淋巴结单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>将步骤 3.3.2 中的含淋巴结样本的 RPMI 培养基倒入 100 μm 滤膜上。将滤膜转移至新的 50 mL 离心管中，用 3 mL 塑料注射器的钝端研磨淋巴结。用 20 mL RPMI 培养基冲洗滤膜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟，收集滤过液。吸除上清液。&#160;</li>
	<li>将沉淀重悬于 20 mL 含 1% FBS 的 PBS（磁珠缓冲液）中，然后倒入 40 μm 滤膜。收集滤过的细胞悬液。使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟，收集滤过液。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于磁珠缓冲液中，调整浓度至 6 × 107 个细胞/mL，用于流式细胞术。</li>
</ol>
7. 胃肠间质瘤的单细胞悬液制备
<ol>
	<li>通过将 250 mg 胶原酶 IV、一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂和 100 µL DNase I 加入 50 mL HBSS 中来配制胶原酶缓冲液。室温下旋转 10 分钟，直至完全溶解。</li>
	<li>将 GIST 组织置于无菌培养皿中，加入 2.5 mL 胶原酶缓冲液。使用无菌手术刀和剪刀将肿瘤组织切碎至细小碎片。用大孔径移液管将肿瘤组织和胶原酶缓冲液吸入 50 mL 离心管中。</li>
	<li>在 37 °C、100 rpm 条件下于摇床中孵育 30 分钟。加入 2 mL FBS 终止反应。</li>
	<li>将含有 GIST 样本的胶原酶溶液通过 100 μm 滤膜过滤，并用 3 mL 塑料注射器的钝端轻轻研磨肿瘤组织，滤液收集至 50 mL 离心管中。用 20 mL HBSS 冲洗滤膜。将滤液在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>将沉淀物重悬于 20 mL 磁珠缓冲液中，再通过 40 μm 滤膜过滤。收集滤液，使用血细胞计数板进行细胞计数。将滤液在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。将细胞重悬于磁珠缓冲液中，调整浓度至 6 × 107 个细胞/mL，用于流式细胞术。</li>
</ol>
8. 盲肠单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>按照步骤 7.1 制备胶原酶缓冲液。用剪刀将盲肠纵向切开，暴露内层黏膜。切成 0.5 cm 的小段，放入含有 5 mL 含 2% 胎牛血清（FBS）的 HBSS 的 50 mL 离心管中。剧烈振荡 30 秒，450 × g 离心 20 秒，然后吸除上清液。</li>
	<li>加入 5 mL 含 2 mM EDTA 的 HBSS。在 37 °C、100 rpm 条件下于摇床中孵育 15 分钟。450 × g 离心 20 秒，吸除上清液。</li>
	<li>加入 5 mL HBSS。剧烈振荡 30 秒，450 × g 离心 20 秒，然后吸除上清液。重复此步骤一次。</li>
	<li>加入 5 mL 胶原酶缓冲液。在 37 °C、100 rpm 条件下于摇床中孵育 30 分钟，每 10 分钟剧烈振荡一次。加入 2 mL 胎牛血清（FBS）终止反应。</li>
	<li>将含有盲肠组织的胶原酶溶液倒入 100 μm 滤网，用 3 mL 塑料注射器的钝端研磨组织。用 20 mL HBSS 冲洗滤网，收集滤过液。</li>
	<li>将滤过液在 4 °C 条件下以 450 × g&#160;离心 5 分钟，吸除上清液。将沉淀重悬于 20 mL 磁珠缓冲液中，过 40 μm 滤网。收集滤过液，并用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将滤过液在 4 °C 条件下以 450 × g&#160;离心 5 分钟，吸除上清液。将细胞沉淀重悬于磁珠缓冲液中，调整浓度至 6 × 107 个细胞/mL，用于流式细胞术。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

KitV558Δ/+&#160;小鼠模型是胃肠道间质瘤（GIST）分子与免疫学分析中的有力研究工具。尽管繁育策略仅需单次杂交，但在分析肿瘤反应的实验中使用KitV558Δ/+小鼠队列仍需大规模繁育。为确保肿瘤重量相近，小鼠需匹配年龄和性别，且在肿瘤形成的8周龄前约有10%的小鼠死亡。若采用CT或MRI等先进成像技术对单个小鼠的肿瘤体积进行追踪，则可采用较简化的繁育策略。尽管如此，KitV558Δ/+小鼠已成功与其他基因敲除或可诱导小鼠模型杂交，揭示了重要的免疫与分子机制12。
肿瘤细胞来自 试剂盒V558Δ/+ 小鼠可通过KIT（CD117）柱层析分选或流式细胞术轻松分离18分离的肿瘤细胞来自 试剂盒V558Δ/+ 小鼠可以培育 体外12...

胃肠道间质瘤（GIST）是人类最常见的肉瘤，在美国每年约有6000例发病1。GIST似乎起源于被称为 Cajal 间质细胞的胃肠道起搏细胞，通常由酪氨酸激酶KIT或PDGFRA中的单一突变驱动2。手术是GIST治疗的主要手段，可能实现治愈；但对于晚期疾病患者，可采用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）伊马替尼进行治疗。自20多年前问世以来，伊马替尼彻底改变了GIST的治疗模式，使晚期疾病的患者生存期从1年提高至5年以上3,4,5。然而，由于KIT基因获得性突变的存在，伊马替尼极少能够实现治愈，因此该肿瘤亟需新的治疗方法。
小鼠模型是研究癌症新疗法的重要研究工具。目前已有多种皮下异种移植和患者来源的异种移植模型被建立并用于胃肠道间质瘤（GIST）的研究6,7。然而，免疫缺陷小鼠并不能完全模拟人类GIST，因为GIST的免疫特征会因其致癌突变类型的不同而有所差异，且调控胃肠道肿瘤微环境可增强酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的效果8,9。KitV558Δ/+&#160;小鼠在Kit基因第11号外显子上具有杂合性种系缺失，该区域编码跨膜近膜区，是人类GIST中最常发生突变的位点10。KitV558Δ/+&#160;小鼠以100%的外显率发展出单一的盲肠GIST，其肿瘤在组织学特征、分子信号通路、免疫细胞浸润以及对治疗的反应方面均与人类GIST高度相似8,11,12,13。本文中，我们描述了KitV558Δ/+&#160;小鼠的繁育、治疗以及样本的分离与处理方法，可用于GIST相关的分子与免疫学研究。

<table><tbody><tr><td>100 微米滤膜</td><td>EMSCO</td><td>1194-2360</td><td></td></tr><tr><td>1× 红细胞裂解缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>赛默飞世尔科技/BD生物科学</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;ndash;15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白胶，10 孔，30 &amp;micro;l</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>40 微米滤器</td><td>EMSCO</td><td>1194-2340</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>70 微米滤膜</td><td>EMSCO</td><td>1194-2350</td><td></td></tr><tr><td>AKT抗体（C67E7）</td><td>细胞信号传导</td><td>4691</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>完全型无EDTA蛋白酶抑制剂</td><td>Thomas Scientific</td><td>C852A34</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自动细胞计数仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>赛默飞世尔科技/Exel国际</td><td>14-840-00</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thomas Scientific</td><td>C756V81</td><td></td></tr><tr><td>Dog1抗体</td><td>abcam</td><td>ab64085</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>ERK 抗体（p44/42）</td><td>细胞信号传导</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thomas Scientific</td><td>C788U23</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 软件</td><td>FIJI</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji</td></tr><tr><td>Fisherbrand 850 匀浆器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15-340-169</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>宾夕法尼亚大学细胞中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸伊马替尼</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1026</td><td></td></tr><tr><td>KIT 抗体（D13A2）</td><td>细胞信号传导</td><td>3074</td><td></td></tr><tr><td>KitV558&amp;Delta;/+ 基因分型</td><td>Transnetyx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型离心管（1.5 mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on Mouse免疫检测基础试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜，预裁，0.45 &amp;micro;m</td><td>Rio-Rad</td><td>1620145</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NC9121673</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 替代品</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT 抗体（S473）</td><td>细胞信号传导</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>p-ERK 抗体（p44/42）</td><td>细胞信号传导</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>p-KIT 抗体（Y719）</td><td>细胞信号传导</td><td>3391</td><td></td></tr><tr><td>PMSF蛋白酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP170050</td><td></td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯流式管（FACS管）</td><td>Falcon/赛默飞世尔科技</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>宾夕法尼亚大学细胞中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氟化钠（NaF）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>原钒酸钠（Na3VO4）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura 延长作用时间底物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>34076</td><td></td></tr><tr><td>TBS缓冲液（10倍浓缩）</td><td>宾夕法尼亚大学细胞中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿（100 mm²）</td><td>赛默飞世尔科技/Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>TrisHCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1757500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Rio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;vivaCT 80 平台</td><td>Scanco Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中应用的分子与免疫学技术

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人类肉瘤，通常由KIT受体中的单一突变驱动。在多种肿瘤类型中，研究人员已开发出大量小鼠模型，用于探索下一代癌症治疗方法。然而，在GIST研究中，大多数体内研究仍采用异种移植小鼠模型，而这类模型具有固有的局限性。本文介绍一种具有完整免疫系统的、经基因工程改造的胃肠道间质瘤小鼠模型，该模型携带KitV558Δ/+突变。在此模型中，导致大多数GIST发生的癌基因突变型KIT由其内源性启动子驱动，从而产生的GIST在组织学形态和免疫细胞浸润特征上均模拟了人类GIST的表现。此外，该模型已成功用于靶向分子治疗和免疫治疗的研究。本文详细描述了KitV558Δ/+小鼠品系的繁育与维持方法，并详述了从KitV558Δ/+小鼠中处理和获取胃肠道间质瘤、引流肠系膜淋巴结及邻近盲肠组织的流程，以及用于分子和免疫学分析的样本制备方法。

KitV558Δ/+ 小鼠模型可用于在免疫功能健全的小鼠模型中研究治疗手段。KitV558Δ/+ 小鼠由于进行性肠梗阻，平均寿命为8个月(图4)。KitV558Δ/+ 小鼠的肿瘤表达胃肠道间质瘤（GIST）的经典标志物，包括酪氨酸激酶KIT和跨膜通道蛋白DOG1(图5)，以及转录因子ETV1（未显示）。可检测这些肿瘤中KIT信号通路的变化，例如下游标志物ERK和AKT(图6)，或其免疫微环境，后者与人类GIST高度相似8,11...

本文的目的是描述KitV558Δ/+&#160;小鼠模型，以及成功解剖和处理小鼠标本的技术。

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人类肉瘤，通常由KIT受体中的单一突变驱动。在肿瘤中……

本方案描述了目前唯一在用的免疫功能健全的小鼠模型GIST的繁育、维持、解剖及标本处理方法。我们希望未来的研究人员能够利用该小鼠模型，进一步推动GIST的转化医学研究。GIST的传统治疗包括使用酪氨酸激酶抑制剂进行靶向分子治疗。该模型使研究人员能够在胃肠道间质瘤（GIST）中测试免疫疗法。开始前，对所有器械进行灭菌，操作全程佩戴手套，并保持无菌环境。用70%乙醇对切口区域进行消毒。使用剪刀做一条两厘米长的正中垂直切口，进入腹腔。锐性分离任何腹腔内粘连组织。为切除引流肠系膜淋巴结，需先辨认盲肠，并将其肠系膜向上提起。在结肠系膜约一半位置至基底部之间，辨认肠系膜淋巴结并进行锐性解剖。根据需要，将淋巴结组织均分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。将淋巴结组织置于 20 毫升 RPMI 培养基中以制备单细胞悬液，并置于冰上保存。在Kit558小鼠中，盲肠大部分被胃肠道间质瘤（GIST）所取代。分离GIST和盲肠时，需仔细从肿瘤基底部离断回结肠连接处。然后，在肿瘤基底部远端2厘米处再次离断盲肠。在50%至60%的Kit558小鼠中，肿瘤头部包含一层盲肠组织帽，该组织通常含有浆液性液体，但偶尔可能含有脓液。需将组织帽与肿瘤组织锐性分离。将肿瘤组织和盲肠各分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。对于单细胞悬液，将肿瘤组织或盲肠置于含有2%FCS的HBSS中，液体量以浸没样本为宜，并置于冰上保存。将含有淋巴结标本的RPMI培养基倒入100微米滤膜中。将滤膜转移至新的50毫升锥形管中，用3毫升塑料注射器的钝端研磨淋巴结。用20毫升RPMI培养基洗涤滤膜。离心样品并吸除上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，并通过40微米滤膜过滤。收集细胞滤液。使用血细胞计数板对细胞进行计数。离心样品后弃去上清液。然后，用磁珠缓冲液重悬，用于流式细胞术。按照文本稿件中的描述配制胶原酶缓冲液。将GIST组织置于无菌培养皿中，并加入2.5毫升胶原酶缓冲液。使用无菌手术刀和剪刀将肿瘤切碎至细小片段。用大口径移液管将肿瘤和胶原酶吸入50毫升离心管中。在37摄氏度、每分钟100转的条件下孵育30分钟，然后加入2毫升胎牛血清（FBS）终止反应。将含有GIST标本的胶原酶溶液倒入100微米滤膜上，用3毫升塑料注射器的钝端研磨肿瘤组织，并收集至50毫升离心管中。用20毫升HBSS洗涤滤膜。将滤液在4摄氏度下以450 RCF离心5分钟，然后弃去上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，倒入40微米滤膜，收集滤过液，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。离心后吸除上清液，再用珠缓冲液重悬，用于流式细胞术。使用剪刀纵向剪开盲肠，以暴露其内层黏膜。将其切成0.5厘米长的片段，放入含有5毫升HBSS和2% FBS的50毫升离心管中。剧烈振荡30秒，然后在450 ×g下离心20秒。随后，弃去上清液。加入5至20毫升含2毫摩尔EDTA的HBSS。在37摄氏度、每分钟100转的条件下孵育15分钟。离心后弃去上清液，然后将沉淀重悬于5至20毫升HBSS中。剧烈振荡混合物30秒，然后在450 RCF下离心20秒，弃去上清液。重复此步骤一次。将沉淀重悬于5 mL胶原酶缓冲液中，于37°C、100 rpm条件下孵育30分钟。每10分钟剧烈振荡一次，用2毫升胎牛血清（FBS）终止反应。将含有盲肠样本的胶原酶溶液倒入100微米滤膜上，用3毫升塑料注射器的软头研磨。用20毫升HBSS洗涤滤膜，并收集滤液。离心并弃去上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，然后过40微米滤膜。收集滤液，使用血细胞计数板进行细胞计数。再次重复离心步骤，并将沉淀重悬于磁珠缓冲液中用于流式细胞术检测。Kit558 小鼠由于进行性肠梗阻，平均寿命为八个月。Kit558 小鼠的肿瘤表达了胃肠道间质瘤（GIST）的经典标志物，包括酪氨酸激酶 KIT、跨膜通道蛋白 Dog1 以及转录因子 ETV1。通过研究KIT信号通路的变化（如下游标志物ERK和AKT）以及免疫微环境来评估肿瘤，该模型高度模拟人类胃肠道间质瘤（GIST）。采用MRI或CT追踪肿瘤体积，以准确评估肿瘤治疗反应。在分离肿瘤时，需将其与回结肠交界处及盲肠帽充分分离，以确保准确获取肿瘤真实重量，并用于后续免疫学和分子分析。在GIST中，该模型已可用于肿瘤微环境以及免疫疗法的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

分子和免疫技术在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中

本文描述了利用人源化小鼠产生和表征肿瘤特异性T细胞的方法。将人胸腺组织和基因修饰的人造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，从而重建工程化的人类免疫系统，以实现在体内研究抗肿瘤免疫应答。...

利用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

本文介绍了一种高效且用途广泛的方案，通过将转座子DNA注射到新生小鼠的脑室内，诱导、监测和分析新型胶质母细胞瘤（GBM）。位于脑室下区的细胞摄取质粒后发生转化、增殖，并形成具有人类GBM组织病理学特征的肿瘤。...

转座子介导的质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型

本文介绍了研究肺泡巨噬细胞在癌症转移中功能的模型和方法。为了阐明这些细胞在转移过程中的作用，采用了同源性乳腺癌（4T1）模型，并结合使用氯膦酸盐脂质体耗竭肺泡巨噬细胞。...

研究肺泡巨噬细胞在乳腺癌转移中的作用

本方案描述了在雌性C57BL/6J小鼠中建立原位膀胱肿瘤并监测肿瘤生长的方法。...

一种小鼠原位膀胱肿瘤模型及肿瘤检测系统

通过节段性腺病毒-Cre感染建立结直肠癌基因工程小鼠模型的方案及其监测 通过...

一种用于散发性结直肠癌的基因工程小鼠模型

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

本文描述了一套用于检测黑色素瘤转移新型候选介质及其作用机制的技术流程。...

一种用于鉴定黑色素瘤转移新介质的可靠发现平台

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。...

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

我们已建立一种方法，用于评估基因工程小鼠中神经系统肿瘤是否能准确再现其人类对应疾病的病理特征。在此，我们将这些组织学技术、明确的病理学标准以及培养方法应用于P0-GGFβ3小鼠模型中发生的神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤。...

在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

学习Kit V558Δ/+基因工程小鼠模型的解剖与样本处理技术，用于胃肠道间质瘤转化医学研究。该免疫健全模型支持免疫疗法测试，为肿瘤微环境研究提供可靠方法。

在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中应用的分子与免疫学技术

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