在胃肠道间质瘤基因工程小鼠模型中应用的分子与免疫学技术

本方案描述了目前唯一在用的免疫功能健全的小鼠模型GIST的繁育、维持、解剖及标本处理方法。我们希望未来的研究人员能够利用该小鼠模型，进一步推动GIST的转化医学研究。GIST的传统治疗包括使用酪氨酸激酶抑制剂进行靶向分子治疗。

该模型使研究人员能够在胃肠道间质瘤（GIST）中测试免疫疗法。开始前，对所有器械进行灭菌，操作全程佩戴手套，并保持无菌环境。用70%乙醇对切口区域进行消毒。

使用剪刀做一条两厘米长的正中垂直切口，进入腹腔。锐性分离任何腹腔内粘连组织。为切除引流肠系膜淋巴结，需先辨认盲肠，并将其肠系膜向上提起。

在结肠系膜约一半位置至基底部之间，辨认肠系膜淋巴结并进行锐性解剖。根据需要，将淋巴结组织均分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。将淋巴结组织置于 20 毫升 RPMI 培养基中以制备单细胞悬液，并置于冰上保存。

在Kit558小鼠中，盲肠大部分被胃肠道间质瘤（GIST）所取代。分离GIST和盲肠时，需仔细从肿瘤基底部离断回结肠连接处。然后，在肿瘤基底部远端2厘米处再次离断盲肠。

在50%至60%的Kit558小鼠中，肿瘤头部包含一层盲肠组织帽，该组织通常含有浆液性液体，但偶尔可能含有脓液。需将组织帽与肿瘤组织锐性分离。将肿瘤组织和盲肠各分为三部分，分别用于蛋白质提取、组织学分析和单细胞悬液制备。

对于单细胞悬液，将肿瘤组织或盲肠置于含有2%FCS的HBSS中，液体量以浸没样本为宜，并置于冰上保存。将含有淋巴结标本的RPMI培养基倒入100微米滤膜中。将滤膜转移至新的50毫升锥形管中，用3毫升塑料注射器的钝端研磨淋巴结。

用20毫升RPMI培养基洗涤滤膜。离心样品并吸除上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，并通过40微米滤膜过滤。

收集细胞滤液。使用血细胞计数板对细胞进行计数。离心样品后弃去上清液。

然后，用磁珠缓冲液重悬，用于流式细胞术。按照文本稿件中的描述配制胶原酶缓冲液。将GIST组织置于无菌培养皿中，并加入2.5毫升胶原酶缓冲液。

使用无菌手术刀和剪刀将肿瘤切碎至细小片段。用大口径移液管将肿瘤和胶原酶吸入50毫升离心管中。在37摄氏度、每分钟100转的条件下孵育30分钟，然后加入2毫升胎牛血清（FBS）终止反应。

将含有GIST标本的胶原酶溶液倒入100微米滤膜上，用3毫升塑料注射器的钝端研磨肿瘤组织，并收集至50毫升离心管中。用20毫升HBSS洗涤滤膜。将滤液在4摄氏度下以450 RCF离心5分钟，然后弃去上清液。

将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，倒入40微米滤膜，收集滤过液，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。离心后吸除上清液，再用珠缓冲液重悬，用于流式细胞术。使用剪刀纵向剪开盲肠，以暴露其内层黏膜。

将其切成0.5厘米长的片段，放入含有5毫升HBSS和2% FBS的50毫升离心管中。剧烈振荡30秒，然后在450 ×g下离心20秒。随后，弃去上清液。

加入5至20毫升含2毫摩尔EDTA的HBSS。在37摄氏度、每分钟100转的条件下孵育15分钟。离心后弃去上清液，然后将沉淀重悬于5至20毫升HBSS中。

剧烈振荡混合物30秒，然后在450 RCF下离心20秒，弃去上清液。重复此步骤一次。将沉淀重悬于5 mL胶原酶缓冲液中，于37°C、100 rpm条件下孵育30分钟。

每10分钟剧烈振荡一次，用2毫升胎牛血清（FBS）终止反应。将含有盲肠样本的胶原酶溶液倒入100微米滤膜上，用3毫升塑料注射器的软头研磨。用20毫升HBSS洗涤滤膜，并收集滤液。

离心并弃去上清液。将沉淀重悬于20毫升珠缓冲液中，然后过40微米滤膜。收集滤液，使用血细胞计数板进行细胞计数。

再次重复离心步骤，并将沉淀重悬于磁珠缓冲液中用于流式细胞术检测。Kit558 小鼠由于进行性肠梗阻，平均寿命为八个月。Kit558 小鼠的肿瘤表达了胃肠道间质瘤（GIST）的经典标志物，包括酪氨酸激酶 KIT、跨膜通道蛋白 Dog1 以及转录因子 ETV1。

通过研究KIT信号通路的变化（如下游标志物ERK和AKT）以及免疫微环境来评估肿瘤，该模型高度模拟人类胃肠道间质瘤（GIST）。采用MRI或CT追踪肿瘤体积，以准确评估肿瘤治疗反应。在分离肿瘤时，需将其与回结肠交界处及盲肠帽充分分离，以确保准确获取肿瘤真实重量，并用于后续免疫学和分子分析。

在GIST中，该模型已可用于肿瘤微环境以及免疫疗法的研究。