Name: 离体 小鼠尿路上皮细胞腺病毒-Cre介导的基因缺失的类器官模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习利用腺病毒-Cre介导的离体基因编辑技术，从小鼠尿路上皮细胞快速构建膀胱癌类器官模型。该方法可将传统需要数年的小鼠繁育流程缩短至一至两周，显著提高基因功能研究效率。

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本研究工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 K08CA252161（Q.L.）、R01CA234162 和 R01 CA207757（D.W.G.）、P30CA016056（NCI 癌症中心核心支持基金）、罗斯韦尔公园联盟基金会以及泌尿学之友基金会的资助。我们感谢 Marisa Blask 和 Mila Pakhomova 对稿件的校对。

所有动物实验程序均经纽约州布法罗市罗斯韦尔公园综合癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（1395M，生物安全编号180501和180502）。 
注意：步骤1-3需在同一天内完成。
1. 小鼠膀胱的解剖
<ol>
	<li>解剖前准备
	<ol>
		<li>准备好所有无菌器械，包括剪刀、镊子、35 mm 培养皿中的无菌 DPBS、70% 乙醇、无菌纱布和干净的纸巾。清洁解剖区域的所有表面。按照 Goodrich 实验室先前所述方法，准备雄性三重条件性敲除小鼠 Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f（4 只，10 周龄）8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死与切口
	<ol>
		<li>使用流速为 2.0 L/min 的 CO2 对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。用 70% 乙醇清洁解剖区域，并覆盖干净的纸巾。</li>
		<li>将小鼠置于解剖区域的纱布上。向小鼠腹部喷洒 70% 乙醇，使用无菌解剖剪在腹中线做下腹部切口，暴露膀胱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膀胱解剖
	<ol>
		<li>使用镊子夹住膀胱并轻轻提起，以识别双侧输尿管膀胱连接处。使用剪刀沿两个输尿管开口之间的边界线切除膀胱底部。</li>
		<li>将膀胱转移至含有 2 mL DPBS 的无菌培养皿中。去除脂肪和结缔组织，然后将膀胱放入另一新培养皿中，加入 2 mL 无菌 DPBS。此时，从 -80 °C 保存条件下取出腺病毒，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 尿路上皮细胞的解离
<ol>
	<li>细胞解离的准备工作
	<ol>
		<li>准备所有无菌器械，包括镊子、手术刀片（10号刀片配手柄）、35 mm培养皿中的无菌DPBS、不含活性炭处理胎牛血清的完全培养基（定义为CCM(-)）、胶原酶/透明质酸酶混合液、用于替代胰蛋白酶的重组酶、含10 µM新鲜Y-27632的DPBS中10%活性炭处理胎牛血清、100 µm无菌细胞筛网以及15 mL离心管。 
		注意：完全培养基（CCM）由乳腺上皮细胞生长培养基补充提供的生长因子、5%活性炭处理胎牛血清、1% L-谷氨酰胺替代物、100 µg/mL普列霉素（primocin）和10 µM新鲜Y-27632组成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膀胱组织的剪碎与消化
	<ol>
		<li>在生物安全柜中，将膀胱转移至35 mm培养皿，并用2 mL无菌DPBS再次清洗。</li>
		<li>从四只小鼠收集膀胱组织至含1 mL CCM(-)的培养皿中，使用手术刀片将每个膀胱切成四个相等的部分。用镊子展开膀胱以暴露尿路上皮表面，使其接触培养基。</li>
		<li>将膀胱组织块及培养基转移至15 mL离心管中。用2 mL CCM(-)清洗培养皿两次，每次2 mL，并将洗涤液收集至离心管中，总体积达5 mL。</li>
		<li>加入胶原酶/透明质酸酶混合液，使终浓度为300 U/mL胶原酶和100 U/mL透明质酸酶，将离心管水平置于37 °C、200 rpm的轨道摇床中孵育30分钟。</li>
		<li>组织消化完成后，向管中加入等体积（5 mL）含10%活性炭处理胎牛血清的DPBS，然后在200 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>移除并弃去上清液。向细胞沉淀中加入2 mL胰蛋白酶替代物，充分混匀。将离心管置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育4分钟。</li>
		<li>孵育结束后，使用标准P1000枪头反复吹打10次。加入5 mL含10%活性炭处理胎牛血清的DPBS。</li>
		<li>将解离后的细胞通过100 µm无菌细胞筛网过滤。收集细胞悬液，并在200 × g条件下离心5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞计数与重悬
	<ol>
		<li>移除并弃去上清液。用1 mL CCM重悬细胞沉淀。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，仅将0.5 × 106个细胞接种至24孔板的一个孔中，加入0.5 mL新鲜CCM。此时，从-20 °C取出Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的基质提取物（见材料表），并在冰上解冻。将6孔板预热于37 °C细胞培养箱中。 
		注意：剩余细胞可经离心后以细胞沉淀形式冻存，用于非病毒转导对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 腺病毒转导与类器官接种
警告：处理腺病毒时请务必小心。实验室人员应遵循生物安全二级操作规范，并使用10%次氯酸钠溶液对腺病毒进行消毒。
<ol>
	<li>向24孔板中加入2 µL腺病毒（Ad5CMVCre；1 × 107 PFU/µL），与解离的尿路上皮细胞充分混匀。</li>
	<li>为提高转导效率，将24孔板在室温下以300 × g 离心30分钟进行自旋感染。随后将24孔板置于37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>将孔中的细胞和培养基转移至15 mL离心管中，以200 × g 离心5分钟。弃去上清液，加入50 µL CCM，充分重悬管底的细胞。</li>
	<li>加入140 µL基质胶提取物，轻柔混匀以避免产生气泡。迅速将混合液以每“穹顶”50 µL的量加入预热的6孔板中，形成类器官培养的“穹顶”结构。</li>
	<li>将6孔板轻轻放入37 °C、5% CO2 培养箱中，使“穹顶”静置凝固5分钟。随后将6孔板倒置，继续凝固25分钟。</li>
	<li>孵育结束后，向每孔加入2.5 mL CCM，并将6孔板放回培养箱中进行类器官培养。</li>
</ol>
4. 类器官培养与传代
<ol>
	<li>每3-4天更换一次培养基。类器官的培养、传代和冻存操作参照Lee等人的方法9。使用样本处理凝胶包埋类器官的操作步骤参照Fujii等人的描述10。</li>
	<li>吸除培养基，每孔加入1 mL分散酶（dispase），用P1000移液器枪头轻轻打碎凝胶 dome 结构，并充分混匀。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟。随后将所有细胞收集至15 mL离心管中，并用4 mL含10%活性炭处理胎牛血清（charcoal-stripped FBS）的DPBS洗涤孔壁。若类器官细胞仍呈较大细胞团块，需执行步骤2.2.6和2.2.7以获得单细胞悬液。</li>
	<li>在200 × g条件下离心5分钟，弃上清，用1 mL CCM培养基重悬细胞并洗涤。</li>
	<li>将细胞重悬于70%基质提取物中，继续按照步骤3.4–3.6进行培养。或者，将细胞重悬于含10 µM新鲜Y-27632的90%活性炭处理胎牛血清和10% DMSO混合液中，进行冷冻保存。</li>
</ol>
5. 将类器官细胞皮下植入 C57BL/6J 小鼠
<ol>
	<li>植入前准备
	<ol>
		<li>准备25G 1.5英寸针头、1 mL注射器、1 mg/mL dispase、基质提取物、含10 µM新鲜Y-27632的10%活性炭处理FBS的DPBS，以及15 mL离心管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官细胞收集
	<ol>
		<li>经过至少5代稳定培养后，收集扩增的类器官细胞用于 体内 注射。按照步骤4.2–4.4操作，并将细胞重悬于1 mL CCM中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞计数与皮下注射
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。在200 x 转速下离心后 g 5分钟，重悬2 × 106 将细胞置于含有100 µL DPBS中50%基质提取物的溶液中。将细胞悬液置于冰上，并转移至动物实验室内生物安全柜中。</li>
		<li>用 4% 异氟烷和 1 L/min 氧气麻醉两只 10 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠2 在腔室中持续通气约4分钟。待小鼠失去翻正反射且呼吸模式变得深而缓慢后，将小鼠转移至含有2%异氟烷和1 L/min氧气的非重复呼吸回路中2 灌流。涂抹眼药膏以保护动物的眼睛免受创伤性损伤。</li>
		<li>在小鼠右侧 flank 区域剃毛，用 70% 乙醇消毒，然后在麻醉状态下用 25 G 针头将 100 µL 细胞悬液直接注射至右侧 flank。</li>
		<li>注射后，停止吸入麻醉，将小鼠置于装有加热灯的笼子中，直至其完全恢复并能自由活动。将小鼠送回饲养笼并监测肿瘤形成情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 肿瘤采集与 体内 扩增
<ol>
	<li>按照步骤 2.1.1 进行准备。通过 CO2 以2.0 L/min的流速进行窒息处死，待肿瘤形成约2.0 cm直径（约2-3周）后实施颈椎脱臼。将小鼠转移至洁净的解剖区域，用70%乙醇喷洒小鼠 flank 部肿瘤区域，使用无菌解剖剪和镊子做切口以分离肿瘤。</li>
	<li>洗涤肿瘤组织&#160;在60 mm培养皿中加入5 mL DPBS，用剪刀去除结缔组织。取一块新鲜肿瘤组织，浸入含4%多聚甲醛的DPBS溶液中固定48 h，随后送样进行石蜡包埋与切片，用于组织学分析。</li>
	<li>将新鲜肿瘤的另一半组织用于细胞解离。简言之，将新鲜肿瘤切成约1 mm大小的组织块3 在60 mm培养皿中加入5 mL CCM(-)，将组织块进行解离。随后，按照步骤2.2.4–2.2.8操作，将解离后的细胞注射至新的C57BL/6J小鼠中 体内 传代操作在步骤 5.3 之后进行，或保持原样 体外 类器官培养按照步骤3.4–3.6进行，或使用含10% DMSO、90%去炭处理FBS及10 µM新鲜Y-27632的冻存液在液氮中直接冻存。</li>
	<li>如有需要，将冻存细胞在37 °C水浴中快速解冻，并用CCM(-)洗涤。随后，将细胞重悬于100 µL含50%基质提取物的DPBS中，用于直接注射至小鼠体内 体内 肿瘤形成。使用至少 2 x 106 解冻后的细胞用于一次 体内 注射</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li>
<li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li>
<li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li>
<li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids%3A+A+tool+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li>
<li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+bladder+cancer+in+mice%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li>
<li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li>
<li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li>
<li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f%28high%29+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407(2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li>
<li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li>
<li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160(2010).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

GEMMs 一直是从正常细胞出发进行癌症建模的金标准，可严格检验潜在致癌性扰动（癌基因激活和/或肿瘤抑制基因丢失）所导致的后果。本文提供了一种快速高效的方案，用于通过 离体 对携带目的基因flox等位基因的正常小鼠尿路上皮细胞进行基因编辑。&amp;#38;E 及免疫组化染色显示，TKO 类器官表现出与高级别尿路上皮尿路上皮一致的组织学特征，同时具有鳞状分化和基底样亚型 体外 类器官以及作为 体内 异种移植。TKO类器官可用于 体外 用于研究……的影响 Trp53, Rb1, 和 Pten 损失、药物筛选以及信号通路的分子评估。在 C57BL/6J 小鼠中快速形成肿瘤将能够实现 体内 旨在评估化疗或免疫治疗等全身性疗法治疗反应的研究。
尿路上皮由一层基底细胞（CK5 和 p63 阳性）、1-2 层中间细胞（Uroplakins 和 p63 阳性）以及伞状细胞（Uroplakins、CK8 和 CK20 阳性）组成<sup class="xr...

膀胱癌是男性中第四大常见癌症，每年在美国影响超过80,000人1铂类化疗药物三十多年来一直是晚期膀胱癌患者的标准治疗方案。近年来，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了免疫治疗药物（抗PD-1和抗PD-L1免疫检查点抑制剂）、erdafitinib（成纤维细胞生长因子受体抑制剂）以及enfortumab vedotin（抗体-药物偶联物），彻底改变了膀胱癌的治疗格局。2,3,4。然而, 目前尚无经临床批准的生物标志物可用于预测化疗或免疫治疗的疗效。迫切需要建立具有信息量的临床前模型，以增进对驱动膀胱癌进展机制的理解，并开发针对不同治疗方式的预测性生物标志物。
膀胱转化研究的主要障碍之一是缺乏能够模拟人类膀胱癌发病机制及治疗反应的临床前模型5,6已开发出多种临床前模型，包括 体外 二维模型（细胞系或条件重编程细胞）， 体外 三维模型（类器官，三维打印），以及 体内 模型（异种移植模型、化学诱导模型、基因工程模型和患者来源异种移植模型）2,6基因工程小鼠模型（GEMMs）在膀胱癌生物学的多种应用中具有重要作用，包括肿瘤表型分析、候选基因和/或信号通路的机制研究，以及治疗反应的临床前评估6,7. GEMMs 可利用位点特异性重组酶（Cre-loxP) 来调控一个或多个肿瘤抑制基因的遗传缺失。构建具有多个基因缺失的特定GEMM耗时较长、 laborious且成本高昂。5该方法的总体目标是开发一种快速且高效的方法 离体 通过Cre递送从携带三重flox等位基因的正常小鼠尿路上皮细胞建立膀胱三重敲除（TKO）模型Trp53, Pten 和 Rb1)8主要优势在于 离体 方法是快速工作流程（1-2 周，而非数年的鼠类繁育）。本文描述了获取带有条件性等位基因（floxed alleles）的正常尿路上皮细胞的方案， 离体 腺病毒转导、类器官培养和 体外 和 体内 在免疫功能健全的C57 BL/6J小鼠中进行表征。该方法可进一步用于在携带任意组合的条件性等位基因（floxed alleles）的免疫功能健全小鼠中建立具有临床相关性的膀胱癌类器官。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;m 无菌细胞筛</td><td>康宁</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>25G 1.5英寸针头</td><td>EXELINT 国际</td><td>26406</td><td></td></tr><tr><td>腺病毒（Ad5CMVCre 高滴度，1E11 pfu/ml）</td><td>UI 病毒载体中心</td><td>VVC-U 爱荷华大学-5-HT</td><td></td></tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>活性炭处理的胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A3382101</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶/透明质酸酶</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07912</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DPBS，1×</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺替代物（GlutaMAX）</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>乳腺上皮细胞生长培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth基质提取物&amp;ndash;霍尔姆&amp;ndash;蜂群小鼠肉瘤（Matrigel）</td><td>康宁</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗-CK20</td><td>DAKO</td><td>M7019</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗-CK7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-23876</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗p63</td><td>Abcam</td><td>ab735</td><td>IHC 1:100，IF 1:50</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗Upk3</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-U103A</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗波形蛋白</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6260</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>单克隆大鼠抗CK8</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>TROMA-I-s</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i CO2 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>多克隆鸡抗CK5抗体</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>IF 1:500</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>重组胰蛋白酶替代物（TrypLE Express 酶）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Signature 台式振荡培养箱 1575 型</td><td>VWR</td><td>35962-091</td><td></td></tr><tr><td>组织标本处理凝胶（HistoGel）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片10号</td><td>Integra Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004377</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T1 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75002383</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo 腺病毒-cre 介导的小鼠尿路上皮细胞基因删除的类器官模型

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

膀胱癌是一个研究相对不足的领域，尤其是在基因工程小鼠模型（GEMMs）中。具有组织特异性Cre和 loxP 位点长期以来一直是条件性或可诱导基因靶向的金标准。为了提供更快且更高效的实验模型，一种 离体 使用携带多种基因突变的腺病毒Cre和正常尿路上皮细胞开发类器官培养系统 loxP 肿瘤抑制基因的等位基因 Trp53, Pten 和 Rb1正常尿路上皮细胞通过酶消化法从四只三重条件性基因敲除小鼠的膀胱中分离获得（Trp53f/fPtenf/fRb1f/f）。尿路上皮细胞被转导 离体 使用由CMV启动子驱动的腺病毒-Cre（Ad5CMVCre）进行转导。转导后的膀胱类器官进行培养、扩增和鉴定 体外 和 体内PCR用于确认基因敲除 Trp53, Pten, 和 Rb1类器官的免疫荧光（IF）染色显示尿路上皮谱系标志物（CK5 和 p63）呈阳性表达。将类器官皮下注射至宿主小鼠体内以实现肿瘤扩增和连续传代。异种移植瘤的免疫组织化学（IHC）结果显示 CK7、CK5 和 p63 呈阳性表达，CK8 和 Uroplakin 3 呈阴性表达。综上所述，通过腺病毒介导的基因敲除对小鼠尿路上皮细胞进行遗传改造后 loxP 位点是一种快速检测特定基因改变致瘤潜能的高效方法。

腺病毒-Cre 介导的小鼠尿路上皮细胞基因删除工作流程如图所示 图1A视频展示了如何从膀胱底部分离尿路上皮细胞，以及如何对三重条件性基因敲除细胞进行转导。 离体 与 Ad5CMVCre 一起。 图1A 结果显示，经酶消化后仅有极少的黏膜下层和肌细胞被解离。为验证腺病毒-Cre 递送的效率，从带有膜定位 tdTomato/膜定位增强型绿色荧光蛋白（mT/mG）的三重 floxed 小鼠中分离得到解离的尿路上皮细胞，并用腺病毒 Cre 进行转导。在接近 100% 的细胞中检测到绿色荧光蛋白（GFP），表明腺病毒转导效率极高（图1B).
稳定的三基因敲除（TKO）类器官按照标准类器官培养方案建立（体外培养超过5代；图2A）。对体外培养的类器官切片进行苏木精-伊红（H&amp;E）染色和免疫荧光（IF...

本方案描述了携带目的基因缺失的小鼠尿路上皮类器官的生成与表征过程。方法包括小鼠尿路上皮细胞的获取、 离体 使用带有CMV启动子驱动Cre表达的腺病毒进行转导，以及 体外 以及 体内 表征

Ex Vivo 腺病毒-Cre 介导的小鼠尿路上皮细胞基因删除的类器官模型

膀胱癌是一个研究较少的领域，尤其是在基因工程小鼠模型（GEMMs）中。具有组织特异性Cre和loxP位点的近交系GEMMs……

我们开发了一种快速高效的方案，通过在体外对携带目的基因条件性等位基因的正常小鼠尿路上皮细胞进行基因编辑，从而生成膀胱癌类器官。该体外方法的实验周期为一至两周，相较于耗时数年的转基因小鼠繁育，效率显著提高，并且在腺病毒介导的Cre重组酶依赖性基因删除方面具有很高的转导效率。实验开始前，准备好所有无菌器械和试剂，包括剪刀、镊子、35毫米培养皿中的DPBS、70%乙醇、纱布和洁净的纸巾。接下来，清洁解剖区域的所有表面，并用干净的纸巾覆盖解剖区域。将已处死的小鼠置于解剖区域的纱布上，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，然后使用无菌解剖剪在腹部正中线下方做一纵向切口，以暴露膀胱。随后，用镊子夹住膀胱并轻轻提起，以辨认双侧输尿管膀胱连接处。使用剪刀沿两侧输尿管开口之间的边界线切除膀胱底部，并将膀胱转移至含有 2 毫升 DPBS 的无菌培养皿中，随后去除脂肪和结缔组织，并将膀胱放入另一个含有 2 毫升 DPBS 的新培养皿中。同时，将腺病毒从 -80 摄氏度冰箱中取出并置于冰上。为进行细胞解离，请按照文稿中的描述准备所有无菌器械和试剂，然后在生物安全柜中将膀胱转移至 35 毫米培养皿中，并用 2 毫升无菌 DPBS 清洗。将四只小鼠的膀胱组织收集到含有1毫升不含活性炭处理胎牛血清的完全培养基的培养皿中。接下来，使用手术刀片将每只膀胱切成大小相等的四块，然后用镊子将膀胱展开，使尿路上皮表面暴露于培养基中。将膀胱组织块及培养基转移至15毫升离心管中。用 2 毫升不含活性炭处理胎牛血清的完全培养基将培养皿洗涤两次，并将洗涤液加入离心管中，使总体积达到 5 毫升。接着，加入胶原酶和透明质酸酶混合液，将离心管水平置于 37°C 摇床培养箱中，以 200 RPM 振荡 30 分钟。组织消化完成后，向离心管中加入等体积的 10% 活性炭处理胎牛血清和 DPBS，然后在 200 ×g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液后，向细胞沉淀中加入2毫升胰蛋白酶替代液，充分混匀，然后将试管置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4分钟。孵育结束后，使用标准P1000枪头将细胞上下吹打10次，并加入5毫升10%炭吸附胎牛血清和DPBS。用100微米无菌细胞滤网过滤解离的细胞，将细胞悬液收集至50毫升离心管中。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，用1毫升完全培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数，并将0.5 × 10⁶个细胞接种至24孔板的每个孔中，每孔加入0.5毫升新鲜完全培养基。接下来，从零下20摄氏度冰箱中取出Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的基质提取物，在冰上解冻。同时，将一个6孔板置于37摄氏度细胞培养箱中预热。进行腺病毒转导时，向24孔板中加入2 µL腺病毒，并与解离的尿路上皮细胞充分混匀。为提高转导效率，将培养板在30

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癌症研究

离体 小鼠尿路上皮细胞腺病毒-Cre介导的基因缺失的类器官模型

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腺病毒介导的培养原代小鼠胚胎成纤维细胞中信号分子的基因剔除

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节段性腺病毒-Cre感染：利用基因工程小鼠模型生成孤立性结直肠癌的技术

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学习利用腺病毒-Cre介导的离体基因编辑技术，从小鼠尿路上皮细胞快速构建膀胱癌类器官模型。该方法可将传统需要数年的小鼠繁育流程缩短至一至两周，显著提高基因功能研究效率。

Ex Vivo 腺病毒-Cre 介导的小鼠尿路上皮细胞基因删除的类器官模型

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