推进液体和冰中病毒组件的高分辨率成像

这里描述了使用透射电子显微镜制备适用于纳米级液体电镜和冷冻电镜分析的病毒组件的协议。

近年来，人们对液体电子显微镜的兴趣激增，因为我们现在可以在纳米级实时过程中进行可视化。对这些柔性结构的了解的提高可以帮助我们开发新型试剂来对抗SARS-CoV-2等新兴病原体。在流体环境中观察蛋白质有助于模仿生物系统，并让我们有机会以更动态的方式观察蛋白质。

这个实验将向您展示如何在玻璃冰和液体环境中使用和可视化蛋白质的新技术。最近的结果包括候选疫苗在液体成像的基于抗体的疗法中的动态见解。相关的液体和冷冻电镜应用提高了我们可视化分子动力学的能力，为人类健康和疾病提供了独特的背景。

采用传统TEM或冷冻电镜技术的读者可以考虑实施液体电镜工作流程，以补充其当前策略的方式为其样品提供新的动态观察。市售的液态电镜系统可以提供流动、混合、电化学刺激和温度控制，这对于许多实时成像应用至关重要。这里介绍的微芯片夹心方法描述了一种简单的入门级方法，在跳跃到更复杂的商业系统进行原位实验之前，首先查看液体中的样品。

首先，通过将每个芯片在150毫升丙酮中孵育两分钟，然后在150毫升甲醇中孵育两分钟来清洁氮化硅微芯片。让芯片在层流气流中干燥。使用辉光放电仪器使用氩气在标准条件下运行 45 秒的等离子体清洁干燥的芯片。

接下来，将干燥的基础微芯片装入样品支架的尖端，并将大约 0.2 微升的样品添加到基础芯片中。孵育一到两分钟后，将顶部芯片放在含有样品的湿基芯片上。将组件放在一起，形成一个密封的外壳，由三个黄铜螺钉机械地固定到位。

使用涡轮泵送干泵站将尖端泵送到 10 至负 6 托。支架现在已准备好插入 TEM。等离子体使用辉光放电仪器清洁微芯片和碳网格45秒。

并将大约两微升样品添加到放置在凝胶包上的发光放电微芯片中。使用滤纸或移液管取出多余的溶液，孵育一到两分钟。然后将发光放电的碳网格添加到包含样品的湿微芯片中。

在室温下使用单个倾斜试样支架将组件种植在一起，以形成密封的外壳。或者，使用自动加载网格夹并将三明治组件放在底部 C 夹上。将顶部夹放在组件的顶部，并使用标准夹紧工具将组件密封在一起。

试样现在已准备好插入TEM。检查在低温条件下或室温下放置在自动进样器中的样品。对于液电镜成像，将样品支架装入配备场发射枪的 TEM 中，并在 200 千伏下运行。

打开喷枪，使用摆动功能调整显微镜载物台相对于标本的共心高度，将样品在柱中从零下 15 度倾斜到正 15 度。此过程在Z方向上调整载物台以适应样品厚度，并有助于确保图像记录期间的准确放大倍率。使用串行数据采集软件包将图像记录为长帧短片或单个图像，实现自动成像程序。

在低剂量条件下以 28， 000X 到 92， 000X 和每秒 40 帧的放大倍率采集图像。调整曝光时间以尽量减少光束对标本的损坏，并在指定放大倍率下使用负一到四微米的散焦范围。如果遇到厚溶液，请使用更高的散焦值或选择不同的感兴趣区域。

通过将电子束聚焦在不用于数据收集的牺牲区域上，直到形成气泡，确保溶液在整个成像过程中存在于样品中。使用 RELION-3.0.8 程序或任何其他图像处理软件分析电影中的 SARS-CoV-2 颗粒。使用 MotionCor2 程序执行运动校正。

更正后，使用程序软件包中的自动拾取工具提取颗粒。液体标本的典型框尺寸为 330 像素，冰标本的典型框尺寸为 350 像素。使用程序的 3D 初始模型例程和数据处理软件包中的从头模型选项使用 C1 对称性计算初始重建。

然后在数据处理软件中执行细化协议。使用分子结构分析软件包检查结果，同时评估动态变化。此处显示了腺相关病毒亚型 3 或 AAV 中液体电镜和冷冻电镜结构的比较。

代表性图像显示了AAV在溶液和冰中的结构。此处显示了从液体和冰结构中提取的AAV VP1亚基的旋转视图。这些图像表示使用分子结构分析软件中的形态图函数生成的液体结构中的动态值。

来自多个病毒组件的平均结构显示出构象变化，使用EM数据测量了近5%的直径变化。此处显示了从 COVID-19 患者的血清组分中分离出的 SARS-CoV-2 亚病毒组件的图像。这些白色气泡表示样品中存在液体。

这里显示了这些亚病毒组件的EM重建，通过地图显示了五纳米切片的彩色径向密度。代表性图像描述了使用微芯片夹心技术在玻璃体冰中制备的轮状病毒双层颗粒的分析。液体电镜成像应尽量减少或避免使用去垢剂、甘油、聚乙烯、乙二醇和高浓度糖。

这些试剂可能会引入伪影，产生过多的鼓泡、水解产物和束损伤引起的自由基。这些协议的使用将使科学家能够研究原子细节的动态过程。这跨越了多个科学领域，包括医学、生命科学和材料研究。

这里介绍的协议描述了最先进的工具如何提供一种令人兴奋的方法，通过新的眼睛可视化生物大分子。液体电子显微镜领域可能会提升我们研究这些对人类健康构成威胁的新型病毒的方式，甚至可能有助于我们的大流行防范措施。