推进病毒组装在液体和冰中的高分辨率成像

近年来，液相电子显微镜技术受到广泛关注，因为我们如今能够在纳米尺度上实时观察动态过程。对这些柔性结构的深入理解有助于我们开发新型试剂，以应对诸如SARS-CoV-2等新发病原体。在液体环境中观察蛋白质有助于模拟生物系统，使我们能够以更动态的方式研究蛋白质的结构与行为。

本实验将向您展示如何在玻璃态冰和液体环境中使用和观察蛋白质的新技术。近期的研究成果包括在液体环境中成像获得的基于抗体疗法中疫苗候选分子的动态信息。关联液体与冷冻电镜技术的应用提升了我们对分子动态过程的观察能力，为人类健康与疾病提供了独特的研究视角。

采用传统透射电子显微镜（TEM）或冷冻电镜（cryo-EM）技术的研究人员可考虑引入液相电镜工作流程，以补充现有研究策略，获得样品在动态环境下的新观测结果。市面上可获取的液相电镜系统能够提供流体控制、混合、电化学刺激以及温度调控功能，这些对于许多实时成像应用至关重要。本文介绍的微芯片夹心法提供了一种简易的入门级方法，可用于在液体环境中初步观察样品，为后续过渡到更复杂的商用原位实验系统奠定基础。

首先，通过将每片氮化硅微芯片在150毫升丙酮中孵育两分钟，随后在150毫升甲醇中孵育两分钟来清洗芯片。在层流空气中使芯片自然干燥。使用氩气在标准条件下运行辉光放电仪器45秒，对干燥后的芯片进行等离子清洗。

接下来，将一块干燥的基底微芯片装入样品 holder 的尖端，并向基底芯片上加入约 0.2 微升的样品。孵育一到两分钟后，将上层芯片放置在含有样品的湿润基底芯片上。将组件整体压合，形成一个由三枚黄铜螺丝机械固定的气密密封腔室。

使用涡轮分子泵驱动的无油抽气站，将样品室抽至 10⁻⁶ 托。此时样品台已准备就绪，可插入透射电子显微镜中。使用辉光放电仪对微芯片和碳支持膜网格进行等离子体清洗，处理时间为 45 秒。

将约两微升样品加入置于凝胶包上的辉光放电处理过的微芯片中。使用滤纸或移液器去除多余溶液，并孵育一至两分钟。然后将经过辉光放电处理的碳支持膜网格置于含有样品的湿润微芯片上。

使用单倾样品杆在室温下将组件整体装入，形成一个密封的腔室。或者，使用自动进样网格夹具，将三明治结构组件放置在底部C形夹上。将顶部夹具置于组件上方，并使用标准夹紧工具将组件密封固定。

标本现已准备好插入透射电子显微镜（TEM）。在冷冻条件下或室温下检查置于自动进样器中的样品。对于液相电子显微成像，将标本载台装入配备场发射枪的透射电子显微镜中，并在200千伏条件下操作。

打开电子枪，通过使用摇摆（wobbler）功能，在镜筒内将样品从负15度倾斜至正15度，调节显微镜载物台相对于样品的齐焦高度。该步骤通过在Z方向上调节载物台以适应样品厚度，有助于在图像记录过程中确保准确的放大倍数。使用序列数据采集软件包，以长时间帧电影或单张图像的形式记录图像，并执行自动成像程序。

在低剂量条件下，以 28,000X 至 92,000X 的放大倍数和每秒 40 帧的速度采集图像。调整曝光时间以最小化电子束对样品的损伤，并在指定放大倍数下使用负一至四微米的欠焦范围。若遇到较厚的溶液，可采用更大的欠焦值或选择其他感兴趣的区域。

在整个成像过程中，通过将电子束聚焦于未用于数据采集的牺牲区域，直至形成气泡，以确保溶液始终存在于样品中。使用 RELION-3.0.8 程序或任何其他图像处理软件分析 SARS-CoV-2 粒子的电影图像。使用 MotionCor2 程序进行运动校正。

校正后，使用程序软件包中的自动颗粒挑选工具提取颗粒。液体样品的典型盒尺寸为 330 像素，冰样品为 350 像素。利用数据处理软件包中的程序 3D 初始模型流程和从头模型选项，采用 C1 对称性计算初始重构。

然后在数据处理软件中执行优化流程。使用分子结构分析软件包检查结果，同时评估动态变化。此处展示了腺相关病毒3型（AAV）的液相电子显微镜（liquid-EM）与冷冻电镜（cryo-EM）结构的比较。

代表性图像展示了溶液中和冰中 AAV 的结构。此处显示了从液体和冰的结构中提取的 AAV VP1 亚基的旋转视图。这些图像代表了使用分子结构分析软件中的 morph map 功能生成的液体结构中的动态数值。

来自多种病毒组装体的平均结构显示出构象变化，通过电镜数据测量发现其直径变化接近5%。此处展示的是从COVID-19患者血清组分中分离出的SARS-CoV-2亚病毒组装体的图像。这些白色气泡表明样品中存在液体。

此处展示的是这些亚病毒组装结构的电子显微三维重构图，图中显示了穿过密度图每5纳米切片的彩色径向密度。代表性图像描述了采用微芯片夹心法制备的、在玻璃态冰中保存的轮状病毒双层颗粒的分析结果。进行液体电镜成像时，应尽量减少或避免使用去垢剂、甘油、聚乙二醇以及高浓度糖类。

这些试剂可能会因电子束损伤而引入假象，产生过度气泡、水解产物和自由基。采用这些方案将使科学家能够以原子级分辨率研究动态过程，其应用范围涵盖医学、生命科学和材料研究等多个科学领域。

本文所述方案展示了前沿工具如何通过全新的视角，为观察生物大分子提供令人振奋的手段。液相电子显微镜领域的发展有望提升我们对威胁人类健康的新发病毒的研究能力，甚至可能为我们的大流行病防控准备工作作出贡献。