高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

本方案描述了如何在两种 C.elegans 品系中平行筛选 48 种细菌分离物对 C.elegans 氧化热应激抗性的影响。该方法具有多功能性和可扩展性，能够快速筛选多种影响 C.elegans 健康的条件，适用于健康与疾病机制的研究。

以应激抗性作为健康的指标，该流程可广泛应用于药物、止吐剂和益生菌在线虫突变体、基因敲低、转基因及疾病模型中的临床前筛选。同时测试多种条件的能力有助于研究其中涉及的复杂相互作用及相关的生理过程，包括宿主与微生物的相互作用、代谢紊乱、应激响应以及衰老。

整个过程中必须避免污染。切勿让线虫食物耗尽，并在线虫达到所需阶段后立即进行关键步骤。首先准备浓缩的大肠杆菌OP50菌液，向四个一升的LB培养基瓶中分别接种两毫升OP50起始培养物。

然后将瓶子置于摇床培养箱中，在37摄氏度、160 G条件下振荡培养6小时，随后在20摄氏度、3057 G条件下离心15分钟以收集菌体。之后弃去上清液，并用6毫升OP50培养基重悬菌体沉淀。将浓缩的菌液收集至无菌的50毫升锥形管中。

每种菌株接种八块六厘米的NGM平板，每板加入100微升在37摄氏度过夜培养的饱和OP50菌液。然后将平板置于20摄氏度培养两天后再使用。接着用解剖刀从近期饥饿处理的NGM平板上切取边长0.5厘米的含线虫琼脂块，并转移至八块已接种的六厘米NGM平板上。

将这些培养皿在20摄氏度下孵育三天。接着，使用P1000移液器向六厘米NGM培养皿中加入最多三毫升无菌M9缓冲液，重悬线虫，并将每种菌株八个培养皿中的线虫悬液收集至同一个15毫升锥形管中。然后在4摄氏度下以142 × g离心2分钟，并使用P5000移液器或配有无菌巴斯德移液管或吸头的水泵小心去除上清液。

随后，加入10毫升无菌M9缓冲液以洗涤线虫沉淀。接着，去除上清液，并用移液器将线虫转移至添加了浓缩OP50的15厘米OP50接种NGM平板上。将每种线虫品系在15厘米直径的NGM平板上于15°C培养3至4天，每天补充0.5毫升浓缩OP50以重新喂养线虫。

收集并用M9缓冲液洗涤后，将每种线虫菌株培养物转移至更多的NGM平板上，在20摄氏度下培养线虫，直至95%的群体发育为产卵成虫。随后按照标准的卵制备方法对产卵成虫进行漂白处理，并将卵转移至两个未接种细菌的15厘米NGM平板上，在15摄氏度下培养24小时，以使所有L1幼虫同步孵化并在后续步骤中同步生长。首先，收集先前在6厘米LB琼脂平板上生长的全部菌体，将其转移至含有1毫升M9缓冲液的已标记1.5毫升微量离心管中。

然后涡旋振荡微量离心管，直至细菌沉淀完全重悬。接着在室温下以9,300 × g离心5分钟，弃去700微升上清液。再次通过涡旋振荡重悬细菌沉淀。

随后，将每种细菌悬液各200微升转移至一个空的无菌96孔板中的单个孔内。从此板中，使用多通道移液器将10微升细菌溶液接种到八个96孔NGM琼脂板上，每板接种一排，然后盖上盖子，在25摄氏度下孵育24小时。之后，用干净的粘性封板膜密封该96孔悬液板，并在15摄氏度下保存，最多可保存五天。

首先，通过观察培养皿来评估同步化线虫群体的发育阶段。当超过90%的线虫达到L4阶段时，将线虫收集到15毫升锥形管中，最多加入10毫升无菌M9溶液。接下来，用10毫升新鲜无菌M9溶液反复洗涤线虫四次，每次在4℃下以142 ×g离心2分钟，以去除OP50细菌。

然后去除上清液，并将线虫沉淀重悬于10毫升M9溶液中。取50微升线虫溶液，转移至含有950微升M9溶液的1.5或2毫升低吸附表面离心管中。轻轻混匀管内液体以避免线虫沉淀，随后迅速使用润湿的低吸附枪头，将3至4份独立的10微升液滴滴加到玻璃载片或NGM平板上。

在体视显微镜下以16倍放大倍数观察，计数线虫数量，并对三到四个液滴的计数结果取平均值，以确定线虫溶液中每微升所含线虫的数量。将15毫升锥形管中的线虫浓度调整至每微升15条线虫。然后使用多通道移液器或重复移液器，将8微升线虫溶液分别加入八个96孔NGM琼脂糖板的每个孔中。

36 小时后，向 96 孔板的每个孔中加入 30 微升 M9 培养基。接着，使用低吸附枪头按照预设布局将线虫转移至 384 孔板中，并确保板式读数仪已正确设置。随后，向 384 孔板中补充更多 M9 培养基，通过每孔加入 40 微升 M9 培养基以达到每个孔终体积为 60 微升，用于热应激实验；或每孔加入含 6 微升 TBHP 的 34 微升 M9 培养基，以建立 TBHP 诱导的氧化应激条件。

在加入 TBHP 后两分钟内开始检测。接着，用透明盖子盖上板子，并用封口胶带密封 384 孔板的边缘，确保胶带不覆盖盖子上方或伸入板子下方。然后将板子放入酶标仪中。

确定一个荧光值，低于该值的峰与噪声无显著差异，并记录荧光波动在上升前开始减弱的最早时间点。然后记录最小和最大荧光值预期所处的时间点范围，这些时间点将用于曲线拟合。随后，检查不同孔之间的荧光峰振幅是否存在显著差异。

在进一步分析之前，使用论文中描述的公式对数据进行归一化处理。首先，从 GitHub 下载 LFASS，在 MATLAB 中启动程序并导航至 LFASS 文件夹。然后在命令窗口中输入并运行 fit folder，按照屏幕上的说明进行操作。

在输入拟合文件夹后，输入包含 Excel 文件的数据文件夹名称，例如“我的数据”。然后，在当前方案中，输入连续测量之间的时间间隔为 2，再输入噪声阈值。接下来，通过输入 0.94 设定上限容差阈值，输入 0.06 设定下限容差阈值，以约束 S 形曲线拟合。

设置时间间隔以查找最大值和最小值。当提示是否显示拟合曲线和平滑曲线时，输入 Y 表示是，输入 N 表示否，以直观检查拟合的收敛情况。接下来，提供新的、较低的和较高的时间边界，以尝试重新拟合。

如果您希望尝试重新拟合，请输入二。但如果您希望接受当前拟合结果并进入下一条曲线，请输入零。如需选择是否分析被识别为噪声的曲线或重新拟合拟合不佳的曲线，请输入 Y 以批准，输入 N 以拒绝。

在对所有剩余曲线完成重新拟合或拒绝拟合后，程序结束。从结果文件夹中获取结果文件，并将其保存为 dot XLSX 格式以用于后续分析。在布里斯托尔 N2 野生型线虫上进行了热应激和氧化应激抗性实验，这些线虫分别饲喂 MYB11 或 MYB115 细菌分离株，或大肠杆菌 OP50 对照细菌。

36小时后，将成年野生型线虫群体暴露于42摄氏度的热应激以及7% TBHP诱导的氧化应激条件下。在热应激实验中，死亡中位时间介于40至130分钟之间；在氧化应激实验中，死亡中位时间介于90至240分钟之间。为确保线虫在步骤2.5中正常生长，且步骤2.1可能耗时长达两小时，需在步骤4.6中绘制平板布局图，以将线虫从96孔板转移至284孔板。

可以增加或替换步骤。例如，可通过分别用肠道细菌分离物替换RNI克隆或细菌突变体，来进行宿主全基因组RNA筛选或细菌遗传筛选。因此，我们目前正利用该方法鉴定新的益生菌，并揭示在感染和衰老背景下参与宿主-微生物相互作用的基因调控网络。