Name: 微生物分离株的高通量筛选对 秀丽隐杆线虫 健康的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 了解高通量筛选微生物分离株对秀丽隐杆线虫氧化热应激抗性的影响。该方法使用Caenorhabditis elegans模型评估细菌对宿主健康的作用，适用于药物和益生菌的临床前筛选研究。

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感谢美国明尼苏达州的秀丽隐杆线虫遗传资源中心（CGC Minnesota，美国麦迪逊，NIH - P40 OD010440）提供线虫品系和OP50菌株，感谢德国基尔大学（CAU, Kiel, Germany）的Hinrich Schulenburg教授提供本文所展示的所有环境微生物分离株。本研究由英国科研与创新署-生物技术和生物科学研究理事会（UKRI-BBSRC）向AB提供的基金（BB/S017127/1）资助。JM由兰卡斯特大学健康与医学学部（FHM）博士奖学金资助。

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作者无任何利益冲突披露。

C. elegans 因其体型小、透明、发育迅速、寿命短、成本低廉且易于操作，非常适合同时快速筛选多个实验参数。其基因组、身体结构、神经系统、肠道和微生物组相较于人类虽显著简化，但仍具有足够的复杂性和相似性，因此是一种强大的临床前模型，可在测试生物活性功效或毒性的同时获得机制性认识。随着人们对开发微生物干预疾病疗法的兴趣日益增长8,9,34,35，利用此类临床前模型快速研究益生菌成为一种极具吸引力的选择，因为微生物具有尚未充分开发且近乎无限的治疗潜力34。本文所述方案适用于研究环境细菌对 C. elegans 健康的影响，但也可轻松调整用于其他目的。
多功能性 
构成该实验流程的不同&#34;模块&#3...

人体内寄居着约10万亿至100万亿个活体微生物细胞（细菌、古菌、真菌），主要存在于肠道、皮肤和黏膜环境中1在健康状态下，这些微生物可为宿主提供多种益处，包括维生素的合成、免疫系统的成熟、对病原体的固有免疫和适应性免疫反应的刺激、脂肪代谢的调控、应激反应的调节等，进而影响机体的生长发育、疾病发生及衰老过程2,3,4,5肠道微生物群在人的一生中也会发生显著变化。其中最剧烈的变化发生在婴儿期和幼儿期。6，但随着年龄增长也会发生显著变化，包括减少 双歧杆菌 丰度及增加 梭菌属、乳杆菌属、肠杆菌科 和 肠球菌 物种7生活方式可进一步改变肠道菌群组成，导致菌群失调（有益菌减少，机会性致病菌过度增殖），从而引发多种病理状态，如炎症性肠病、糖尿病和肥胖。5，还与阿尔茨海默病和帕金森病的发生相关8,9,10,11.
这一认识极大地推动了肠-脑轴（GBA）概念的完善，其中肠道生理（现包括其中的微生物）与神经系统之间的相互作用被认为是调控动物代谢和生理功能的主要机制12。然而，微生物群在肠-脑信号传导中的确切作用及其相关作用机制仍远未被充分阐明13。鉴于肠道微生物群是健康衰老的关键决定因素，细菌如何调控衰老过程已成为一个备受关注且存在争议的研究课题6,14,15。
通过秀丽隐杆线虫的示范 秀丽隐杆线虫 宿主拥有一个真正的肠道微生物群，其组成与其他物种一样，以……为主导 拟杆菌门, 厚壁菌门，以及 放线菌门16,17,18,19,20，其作为研究宿主-肠道共生菌相互作用的实验平台的迅速兴起21,22,23,24,25,26 显著扩展了我们的研究工具 arsenal26,27,28,29特别是可用于高通量实验研究的方法 秀丽隐杆线虫 研究基因-饮食、基因-药物、基因-病原体等相互作用，可被用于快速探索细菌分离株及菌群混合物的影响 秀丽隐杆线虫 健康与衰老
本实验方案描述了一种可同时筛选置于多孔板中的细菌分离株阵列或混合物对C. elegans应激抗性影响的方法流程，以此作为健康状况的替代指标，可用于鉴定益生菌。方案详细说明了如何培养大量线虫群体，并在96孔和384孔板体系中处理细菌阵列，随后利用荧光酶标仪对线虫进行自动化应激抗性分析（图1）。该方法基于无标记自动化生存分析（LFASS）30，利用“死亡荧光”现象31，即线虫在死亡时会产生短暂的蓝色荧光，借此可精确定位死亡时间。这种蓝色荧光来源于C. elegans肠道颗粒（一种溶酶体相关细胞器）中储存的犬尿氨酸酸葡萄糖基酯，当线虫肠道在死亡时触发坏死级联反应，这些颗粒会破裂释放荧光物质31。
<img alt="秀丽隐杆线虫氧化应激检测实验方案；时间线，细菌培养准备，幼虫转移步骤，试剂" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63860/63860fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：影响细菌分离株的高通量筛选实验流程 秀丽隐杆线虫 抗应激能力 (A) 线虫与细菌培养及实验设置时间线。B96孔细菌培养板阵列的设置与操作C384孔线虫板设置 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63860/63860fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>直径 10 cm 的培养皿（非透气型）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10720052</td><td>细菌培养无需透气</td></tr><tr><td>直径 15 cm 的培养皿（透气型）</td><td>Fisher Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>384 孔黑色透明平底板</td><td>Corning</td><td>3712 或 3762</td><td>快速应激实验无需无菌</td></tr><tr><td>直径 6 cm 的培养皿（透气型）</td><td>Fisher Scientific</td><td>150288</td><td>线虫培养需要透气，以避免缺氧</td></tr><tr><td>96 孔透明板（Biolite）</td><td>Thermo</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>琼脂（&amp;lt;4% 灰分）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102218041</td><td>高质量琼脂对培养基结构完整性至关重要，可防止线虫钻入</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356</td><td></td></tr><tr><td>Avanti Centrifuge J-26 XP</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液（漂白剂）</td><td>Honeywell</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Difco</td><td>240110</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Invitrogen</td><td>12795084</td><td></td></tr><tr><td>LoBind 吸头</td><td>VWR</td><td>732-1488</td><td>LoBind 可减少转移过程中线虫的损失</td></tr><tr><td>LoBind 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/1100/53</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪 - infinite M nano+</td><td>Tecan</td><td></td><td>单色器设置可实现荧光调节，但使用滤光片的系统亦可满足要求</td></tr><tr><td>酶标仪 - Spark</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Honeywell</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S/3160/63</td><td></td></tr><tr><td>配备透射照明底座的体视显微镜系统</td><td>Leica</td><td>MZ6 或 M80</td><td>需要 0.6–0.8 倍至 40–60 倍的放大倍数，同时需要高质量的透射照明底座，配备可变形、可倾斜或可滑动的反射镜以调节对比度</td></tr><tr><td>t-BHP（&lt;em&gt;tert&lt;/em&gt;-丁基过氧化氢）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>透明粘性封板膜 Nunc</td><td>Fisher Scientific</td><td>101706871</td><td>封板膜必须透明，并能耐受实验过程中的温度变化</td></tr><tr><td>色氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1278-7099</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

由于体型小、生命周期短且遗传操作简便，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为研究微生物分离株对宿主生理的影响提供了便捷的实验平台。此外，该线虫在死亡时会发出蓝色荧光，便于准确判断死亡时间。这一特性已被用于开发高通量、无需标记的C. elegans生存率检测方法（LFASS）。该方法通过对多孔板中的线虫群体进行延时荧光记录，进而推算出群体的中位死亡时间。本研究采用LFASS方法，同时筛选多种微生物分离株对C. elegans抵抗严重热应激和氧化应激能力的影响。本文报道了利用严重应激抗性作为宿主健康指标的微生物筛选流程，该流程特别适用于益生菌的初步筛选。本实验方案详细描述了如何在多孔板阵列中培养C. elegans肠道微生物分离株文库及同步化的线虫群体，并将其合并用于后续检测。示例实验涵盖了在两种线虫品系上平行开展的两个应激检测，共测试47种细菌分离株和一种对照菌株。然而，该方法具有良好的可扩展性，也可应用于多种其他类型的筛选。因此，该体系为快速评估影响C. elegans健康的多参数生物学与生物化学条件提供了一种灵活且高效的实验平台。

LFASS 检测能够同时对多种测试条件进行稳健、高通量且快速的筛选，例如筛选影响抗应激能力和衰老的多种遗传和微生物组参数。实验仅需 2–3 周即可获得涵盖多种测试条件的大量数据集。将 L4 + 36 h 的野生型成虫种群在 48 种肠道微生物分离株上培养 36 小时后，分别暴露于 42 °C 的热应激和 7% t-BHP 诱导的氧化应激条件下。该检测重复进行了四次，每次实验中每种条件均设置四个重复。在所有测试条件下，热应激检测中线虫的中位死亡时间在 40–130 分钟之间，而 t-BHP 诱导的氧化应激检测中则在 90–240 分钟之间。早期成虫期的热应激检测通常比氧化应激检测结果更一致，且日间和日内变异更小，对后续寿命的预测能力也更强30。以不同微生物饮食喂养的线虫在中位死亡时间上的差异，明确说明了肠道共生菌对宿主抗应激能力的影响。图 2 展示了布里斯托尔 N2 野生型线虫在两种感兴趣的肠道微生物分离株及标准实验室菌株 E. coli OP50 上进行的 16 个生物学重复的...

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。

由于其体型小、生命周期短且遗传操作简便，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为研究微生物分离株对……的影响提供了一个便捷的平台

本方案描述了如何在两种 C.elegans 品系中平行筛选 48 种细菌分离物对 C.elegans 氧化热应激抗性的影响。该方法具有多功能性和可扩展性，能够快速筛选多种影响 C.elegans 健康的条件，适用于健康与疾病机制的研究。以应激抗性作为健康的指标，该流程可广泛应用于药物、止吐剂和益生菌在线虫突变体、基因敲低、转基因及疾病模型中的临床前筛选。同时测试多种条件的能力有助于研究其中涉及的复杂相互作用及相关的生理过程，包括宿主与微生物的相互作用、代谢紊乱、应激响应以及衰老。整个过程中必须避免污染。切勿让线虫食物耗尽，并在线虫达到所需阶段后立即进行关键步骤。首先准备浓缩的大肠杆菌OP50菌液，向四个一升的LB培养基瓶中分别接种两毫升OP50起始培养物。然后将瓶子置于摇床培养箱中，在37摄氏度、160 G条件下振荡培养6小时，随后在20摄氏度、3057 G条件下离心15分钟以收集菌体。之后弃去上清液，并用6毫升OP50培养基重悬菌体沉淀。将浓缩的菌液收集至无菌的50毫升锥形管中。每种菌株接种八块六厘米的NGM平板，每板加入100微升在37摄氏度过夜培养的饱和OP50菌液。然后将平板置于20摄氏度培养两天后再使用。接着用解剖刀从近期饥饿处理的NGM平板上切取边长0.5厘米的含线虫琼脂块，并转移至八块已接种的六厘米NGM平板上。将这些培养皿在20摄氏度下孵育三天。接着，使用P1000移液器向六厘米NGM培养皿中加入最多三毫升无菌M9缓冲液，重悬线虫，并将每种菌株八个培养皿中的线虫悬液收集至同一个15毫升锥形管中。然后在4摄氏度下以142 × g离心2分钟，并使用P5000移液器或配有无菌巴斯德移液管或吸头的水泵小心去除上清液。随后，加入10毫升无菌M9缓冲液以洗涤线虫沉淀。接着，去除上清液，并用移液器将线虫转移至添加了浓缩OP50的15厘米OP50接种NGM平板上。将每种线虫品系在15厘米直径的NGM平板上于15°C培养3至4天，每天补充0.5毫升浓缩OP50以重新喂养线虫。收集并用M9缓冲液洗涤后，将每种线虫菌株培养物转移至更多的NGM平板上，在20摄氏度下培养线虫，直至95%的群体发育为产卵成虫。随后按照标准的卵制备方法对产卵成虫进行漂白处理，并将卵转移至两个未接种细菌的15厘米NGM平板上，在15摄氏度下培养24小时，以使所有L1幼虫同步孵化并在后续步骤中同步生长。首先，收集先前在6厘米LB琼脂平板上生长的全部菌体，将其转移至含有1毫升M9缓冲液的已标记1.5毫升微量离心管中。然后涡旋振荡微量离心管，直至细菌沉淀完全重悬。接着在室温下以9,300 × g离心5分钟，弃去700微升上清液。再次通过涡旋振荡重悬细菌沉淀。随后，将每种细菌悬液各200微升转移至一个空的无菌96孔板中的单个孔内。从此板中，使用多通道移液器将10微升细菌溶液接种到八个96孔NGM琼脂板上，每板接种一排，然后盖上盖子，在25摄氏度下孵育24小时。之后，用干净的粘性封板膜密封该96孔悬液板，并在15摄氏度下保存，最多可保存五天。首先，通过观察培养皿来评估同步化线虫群体的发育阶段。当超过90%的线虫达到L4阶段时，将线虫收集到15毫升锥形管中，最多加入10毫升无菌M9溶液。接下来，用10毫升新鲜无菌M9溶液反复洗涤线虫四次，每次在4℃下以142 ×g离心2分钟，以去除OP50细菌。然后去除上清液，并将线虫沉淀重悬于10毫升M9溶液中。取50微升线虫溶液，转移至含有950微升M9溶液的1.5或2毫升低吸附表面离心管中。轻轻混匀管内液体以避免线虫沉淀，随后迅速使用润湿的低吸附枪头，将3至4份独立的10微升液滴滴加到玻璃载片或NGM平板上。在体视显微镜下以16倍放大倍数观察，计数线虫数量，并对三到四个液滴的计数结果取平均值，以确定线虫溶液中每微升所含线虫的数量。将15毫升锥形管中的线虫浓度调整至每微升15条线虫。然后使用多通道移液器或重复移液器，将8微升线虫溶液分别加入八个96孔NGM琼脂糖板的每个孔中。36 小时后，向 96 孔板的每个孔中加入 30 微升 M9 培养基。接着，使用低吸附枪头按照预设布局将线虫转移至 384 孔板中，并确保板式读数仪已正确设置。随后，向 384 孔板中补充更多 M9 培养基，通过每孔加入 40 微升 M9 培养基以达到每个孔终体积为 60 微升，用于热应激实验；或每孔加入含 6 微升 TBHP 的 34 微升 M9 培养基，以建立 TBHP 诱导的氧化应激条件。在加入 TBHP 后两分钟内开始检测。接着，用透明盖子盖上板子，并用封口胶带密封 384 孔板的边缘，确保胶带不覆盖盖子上方或伸入板子下方。然后将板子放入酶标仪中。确定一个荧光值，低于该值的峰与噪声无显著差异，并记录荧光波动在上升前开始减弱的最早时间点。然后记录最小和最大荧光值预期所处的时间点范围，这些时间点将用于曲线拟合。随后，检查不同孔之间的荧光峰振幅是否存在显著差异。在进一步分析之前，使用论文中描述的公式对数据进行归一化处理。首先，从 GitHub 下载 LFASS，在 MATLAB 中启动程序并导航至 LFASS 文件夹。然后在命令窗口中输入并运行 fit folder，按照屏幕上的说明进行操作。在输入拟合文件夹后，输入包含 Excel 文件的数据文件夹名称，例如“我的数据”。然后，在当前方案中，输入连续测量之间的时间间隔为 2，再输入噪声阈值。接下来，通过输入 0.94 设定上限容差阈值，输入 0.06 设定下限容差阈值，以约束 S 形曲线拟合。设置时间间隔以查找最大值和最小值。当提示是否显示拟合曲线和平滑曲线时，输入 Y 表示是，输入 N 表示否，以直观检查拟合的收敛情况。接下来，提供新的、较低的和较高的时间边界，以尝试重新拟合。如果您希望尝试重新拟合，请输入二。但如果您希望接受当前拟合结果并进入下一条曲线，请输入零。如需选择是否分析被识别为噪声的曲线或重新拟合拟合不佳的曲线，请输入 Y 以批准，输入 N 以拒绝。在对所有剩余曲线完成重新拟合或拒绝拟合后，程序结束。从结果文件夹中获取结果文件，并将其保存为 dot XLSX 格式以用于后续分析。在布里斯托尔 N2 野生型线虫上进行了热应激和氧化应激抗性实验，这些线虫分别饲喂 MYB11 或 MYB115 细菌分离株，或大肠杆菌 OP50 对照细菌。36小时后，将成年野生型线虫群体暴露于42摄氏度的热应激以及7% TBHP诱导的氧化应激条件下。在热应激实验中，死亡中位时间介于40至130分钟之间；在氧化应激实验中，死亡中位时间介于90至240分钟之间。为确保线虫在步骤2.5中正常生长，且步骤2.1可能耗时长达两小时，需在步骤4.6中绘制平板布局图，以将线虫从96孔板转移至284孔板。可以增加或替换步骤。例如，可通过分别用肠道细菌分离物替换RNI克隆或细菌突变体，来进行宿主全基因组RNA筛选或细菌遗传筛选。因此，我们目前正利用该方法鉴定新的益生菌，并揭示在感染和衰老背景下参与宿主-微生物相互作用的基因调控网络。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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高通量筛选影响微生物分离物秀丽隐杆线虫健康

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