微生物分离株的高通量筛选对 秀丽隐杆线虫 健康的影响

该协议描述了如何筛选对秀丽隐杆线虫氧化热应激抵抗力影响的细菌在两个秀丽隐杆线虫菌株上并行48细菌分离株。此方法是通用且可扩展的。它提供了对秀丽隐杆线虫影响健康的多种疾病的快速筛查，适用于健康和疾病机制的研究。

该管道使用抗应激性作为健康的代表，随时适用于线虫突变体、敲低、转基因和疾病模型上的药物、止吐剂和益生菌的临床前筛选。并行测试许多条件的能力能够研究所涉及的复杂相互作用并为生理过程服务。这些包括宿主微生物相互作用、代谢紊乱、压力处理和衰老。

避免全程污染至关重要。不要让蠕虫耗尽食物，并在蠕虫到达所需阶段后立即执行关键步骤。首先制备浓缩的大肠杆菌OP50细菌培养物，方法是将四瓶一升的溶原肉汤接种，每瓶接种两毫升OP50发酵剂。

然后将瓶子放入37摄氏度和160克的振荡培养箱中6小时，然后在3057克和20摄氏度下沉淀细菌15分钟。之后，弃去上清液，用6毫升OP50培养基重新悬浮沉淀。将浓缩的培养物收集在无菌的50毫升锥形管中。

每个菌株接种八个六厘米的NGM板，每板在37摄氏度下用100微升饱和OP50培养物生长过夜。然后在使用前将盘子保持在 20 摄氏度下两天。然后用手术刀从最近饥饿的NGM平板上用蠕虫切割0.5厘米的方形琼脂块，并转移到八个接种的6厘米NGM平板中的每一个上。

将这些板在20摄氏度下孵育三天。接下来，使用 P1000 移液管将最多 3 毫升无菌 M 9 缓冲液添加到 6 厘米 NGM 板中，重新悬浮蠕虫，并将蠕虫溶液从每个菌株的所有八个板中收集在单个 15 毫升锥形管中。然后在 4 摄氏度下以 142 倍 G 离心两分钟，并使用 P5000 移液器或配备无菌巴斯德移液管或吸头的水泵小心地除去上清液。

之后，加入10毫升无菌M九缓冲液洗涤蠕虫颗粒。接下来，除去上清液并将蠕虫转移到15厘米的OP50接种的NGM板上，并使用移液管补充有浓缩的OP50。每天用 0.5 毫升浓缩 OP50 重新喂食蠕虫，在 15 摄氏度下在 15 厘米的 NGM 平板上种植每个蠕虫菌株三到四天。

收集并洗涤M 9缓冲液后，将每个蠕虫菌株培养物转移到更多的NGM平板上，并在20摄氏度下繁殖蠕虫，直到95%的种群是妊娠成虫。然后按照标准的卵子制备方法漂白妊娠成虫，并将卵转移到两个未播种的15厘米NGM平板上，在15摄氏度下24小时，以使所有L one幼虫在后续步骤中孵化并同步生长。首先，收集先前在6厘米LB琼脂平板上生长的所有细菌块，并将其转移到含有1毫升M nine缓冲液的标记1.5毫升微量离心管中。

然后涡旋微量离心管，直到细菌沉淀完全重新悬浮。接下来，在室温下以9，300倍G旋转5分钟，并除去700微升上清液。再次通过涡旋重新悬浮细菌沉淀。

接下来，将200微升每种细菌悬浮液转移到空无菌96孔板的单个孔中。从该板中，使用多通道移液器用10微升细菌溶液接种八个96孔NGM琼脂糖板，并在25摄氏度下盖上盖子孵育24小时。之后，用干净的粘性天花板薄膜密封96孔悬挂板，并将其在15摄氏度下存放长达五天。

首先，通过观察平板来评估同步蠕虫种群的发育阶段。一旦超过90%的蠕虫达到L四阶段，将蠕虫收集在15毫升锥形管中多达10毫升的无菌M 9溶液中。接下来，通过在 142 倍 G 下在 4 摄氏度下旋转两分钟来广泛清洗蠕虫四次，同时在每次洗涤之间加入 10 毫升新鲜无菌 M 9 以去除 OP50 细菌。

然后除去上清液，并将蠕虫沉淀重新悬浮在10毫升M 9中。将50微升蠕虫溶液转移到含有950微升M nine的1.5或2毫升低表面结合管中。轻轻混合试管内容物以避免蠕虫沉淀后，快速使用湿润的低结合移液器吸头将三到四滴独立的 10 微升液滴转移到载玻片或 NGM 板上。

在16X放大倍率的体视显微镜下，计数蠕虫的数量，并将计数平均为三到四滴，以确定蠕虫溶液中每微升的蠕虫数量。在 15 毫升锥形管中将蠕虫浓度调节至每微升 15 个蠕虫。然后使用多通道移液器或重复移液器将8微升蠕虫溶液转移到八个96孔NGM琼脂糖板的每个孔中。

36小时后，将30微升M nine分配到96孔板的每个孔中。接下来，使用低保留吸头根据设置布局将蠕虫转移到 384 孔板，确保正确设置读板器。之后，在 384 个孔板中加入更多的 M 9，目标是通过添加 40 微升 M 9 用于热应力测定和 34 微升 M 9 在 6 微升 TBHP 中用于 TBHP 诱导的氧化应激，使最终体积达到每孔 60 微升。

然后在添加TBHP后两分钟内开始测定。接下来，用透明盖关闭板，并用遮蔽胶带密封 384 孔板的边缘，确保胶带不会越过盖子或板下方。然后将板插入读板器。

确定一个荧光值，低于该值的峰值与噪声没有显著差异，并注意荧光波动在上升之前减弱的最早时间点。然后注意最小和最大荧光值预计下降的时间点，因为它们将用于曲线拟合。然后，检查孔之间荧光峰的振幅是否显着变化。

在进一步分析之前，使用手稿中描述的公式对数据进行归一化。首先，从GitHub下载LFASS，启动MATLAB，然后导航到LFASS文件夹。然后按照屏幕上的说明在命令窗口中键入并运行 fit 文件夹。

在适合文件夹中键入后，键入 Excel 文件所在的数据文件夹的名称作为我的数据。然后输入 2 作为当前协议中连续测量之间的时间间隔，并键入噪声阈值。接下来，通过键入 0.94 来分配容差上限阈值，通过键入 0.06 来分配容差下限阈值以约束 Sigmoid 拟合。

设置时间间隔以查找最大值和最小值。要目视检查收敛拟合，请键入 Y 表示是，键入 N 表示否表示在出现提示时不显示拟合曲线和平滑曲线。接下来，提供新的、下限和较高的时间边界以尝试重新拟合。

如果要尝试改装，请键入 2。但是，如果您希望接受改装并继续下一条曲线，请键入零。为了选择是分析被识别为噪声的曲线还是修改拟合不良的曲线，要么类型 Y 表示批准，要么键入 N 表示拒绝。

尝试或拒绝所有剩余曲线的重新拟合后，程序结束。从结果文件夹中检索结果文件，并另存为点 XLSX 以进行下游分析。对布里斯托尔N两种野生型蠕虫进行耐热和抗氧化应激测定，这些蠕虫以MYB11或MYB115细菌分离株或大肠杆菌OP50对照细菌为食。

36小时后，成年野生型蠕虫种群暴露于42摄氏度的热应激和7%TBHP诱导的氧化应激下。热应力测定的中位死亡时间在40至130分钟之间，氧化应激测定的中位死亡时间在90至240分钟之间。为了确保蠕虫在步骤2.5中生长，并且步骤2.1可能需要长达两个小时，绘制板布局以在步骤4.6中制备从96孔到284孔板的蠕虫。

可以添加或替换步骤。例如，可以通过分别用肠道细菌分离物代替RNI克隆或细菌突变体来进行宿主全基因组RNA筛选或细菌遗传筛选。因此，我们目前正在使用这种方法来识别新的益生菌，并揭示在感染和衰老背景下参与宿主微相互作用的基因调控网络。