Name: 从肉鸡雏鸡胚胎中分离出前脂肪细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学习从肉鸡胚胎脂肪组织中分离前脂肪细胞的方法，通过酶解消化和差速离心获得高活性细胞，利用油红O染色评估成脂分化能力，为家禽和人类脂肪发育研究提供双用途模型。

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作者感谢田纳西大学农业研究所和动物科学系对本方案的支持与优化。本工作由美国农业部资助项目资助。

所有动物实验程序均经田纳西大学机构动物护理和使用委员会批准。新鲜受精的商品代肉鸡蛋（Cobb 500）取自当地孵化场。鸡蛋在38 °C、相对湿度60%的条件下孵化，直至胚胎发育第16至18天（E16-E18）进行解剖。脂肪组织采集自皮下（股部）脂肪库。
1. 分离与培养的准备工作
<ol>
	<li>准备培养罩和仪器。
	<ol>
		<li>开始解剖前，在层流罩内设置工作区域。用70%乙醇擦拭工作区域及所有仪器以进行消毒。所有操作均需使用无菌材料。 
		注意：每次将容器和仪器放回细胞培养罩前，务必用70%乙醇擦拭。建议在罩内放置台式仪器灭菌器，以便在处理不同胚胎之间快速对器械进行灭菌。 
		警告：使用仪器灭菌器时，应充分冷却高温器械，以防烫伤和组织损伤。建议至少冷却3分钟。使用前用70%乙醇擦拭。</li>
		<li>在罩内准备好以下仪器和器皿：直头镊子（120 mm）、小镊子（110 mm）、两对弯头镊子（100 mm）、两对直剪刀（140 mm）、弯头手术剪刀（115 mm）、组织筛（250 µm 尼龙网）、细胞筛（40 µm 尼龙网）、锥形离心管（15 mL 和 50 mL）、培养皿（60 mm 和 100 mm）、小烧杯（100 mL）、70%乙醇喷雾器、无菌纱布、纸巾和台面清洁布（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤配制酶解液、收集培养基和培养基。 
	注意：提前配制溶液并保存于4 °C备用。组织收集前需将培养基置于冰上。本步骤所用所有试剂详见材料表。
	<ol>
		<li>通过向DMEM/F12（含2.50 mM L-谷氨酰胺和15 mM HEPES缓冲液的Dulbecco改良Eagle培养基）中添加2.5 µg/mL两性霉素B和1×青霉素/链霉素（P/S，100 U/mL），配制用于脂肪组织收集和酶解液配制的培养基。配制后保存于4 °C备用。 
		注意：该培养基在4 °C保存条件下可稳定保存1年。</li>
		<li>将聚维酮碘（Betadine）用1×PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4，不含钙、镁或酚红）稀释至20%（v/v），并加入2.5 µg/mL两性霉素B，配制消毒液。保存于4 °C备用。 
		注意：该溶液在4 °C保存条件下可稳定保存2年。</li>
		<li>将I型胶原酶（1 mg/mL）溶解于含2.5 µg/mL两性霉素B和1×P/S的DMEM/F12培养基（步骤1.2.1）中，配制酶解液。胶原酶溶液需新鲜配制，并在解剖过程中保持在冰上。使用前约10分钟，将溶液置于37 °C水浴中预热，以激活其酶活性。 
		注意：每100 mg脂肪组织约需1 mL胶原酶溶液（1 mg/mL）。</li>
		<li>通过向DMEM/F12培养基中添加1×P/S和10%胎牛血清（FBS），配制用于细胞接种和扩增的生长培养基。保存于4 °C备用。 
		注意：该溶液在&#160;4 °C保存条件下可稳定保存1年。</li>
		<li>向1×PBS中添加2.5 µg/mL两性霉素B，配制洗涤液。调节溶液至所需pH值7.4。保存于4 °C备用。 
		&#8203;注意：该溶液在4 °C保存条件下可稳定保存2年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脂肪组织的采集与消化
<ol>
	<li>处死胚胎。
	<ol>
		<li>在胚胎发育第16天（E16），将鸡蛋从培养箱中取出。微生物污染的主要潜在来源是蛋壳表面；因此，在敲开鸡蛋前，需用浸有70%乙醇的无菌纱布擦拭蛋壳。擦拭后，将鸡蛋尖端朝下垂直放置于一个内衬纸巾的小烧杯（100 mL）中，以缓冲蛋壳与玻璃之间的接触。</li>
		<li>使用镊子手柄轻敲鸡蛋的钝端，将蛋壳敲破。小心移除蛋壳，形成足够大的开口以便取出胚胎（见步骤2.1.3）。轻轻撕开白色的壳膜以暴露胚胎（图1A）。使用无菌镊子小心刺破羊膜（图1B）。 
		注：羊膜是一种透明膜，内含羊水，包裹着胚胎。</li>
		<li>用直头镊子轻轻夹住胚胎颈部，将胚胎从蛋中取出。切断卵黄囊，使其与胚胎分离，并将胚胎转移至一个100 mm的培养皿中。</li>
		<li>立即使用手术剪和镊子进行断头处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行脂肪组织采集。
	<ol>
		<li>用70%乙醇擦拭胚胎体表，并用无菌纱布轻轻擦洗皮肤表面以去除羽毛，因为羽毛可能在后续消化后的过滤步骤中造成干扰。使用台面擦拭工具，防止皮肤和羽毛接触已收集的组织。</li>
		<li>切开腿部与腹部区域之间的皮肤，以暴露一对股部脂肪库。</li>
		<li>用一只手使用弯头镊子夹住腿部周围的皮肤，另一只手使用弯头镊子轻轻将股部皮下脂肪从腿部剥离。 
		注：脂肪垫与腿部之间粘连的结缔组织相对较少，整个脂肪垫应能仅用镊子完整取出。可通过反向握持镊子，使弯曲部分（而非尖端）夹住脂肪垫，以更易完成操作。
		<ol>
			<li>如有必要，可用弯头剪刀将脂肪垫剪下。根据需要对另一侧脂肪垫及其他胚胎重复此操作。 
			注：在E16阶段，大多数胚胎可获得约80 mg的皮下脂肪（图1C）。这通常可获得约1 × 106个细胞，足以接种一个T-25培养瓶。在此步骤中，建议称量几个胚胎的脂肪垫重量，以评估起始材料的量，因为脂肪垫重量可能因特定肉鸡品系、种母鸡年龄和饮食等不可控因素而有所差异。通常从五个鸡蛋中常规采集皮下脂肪，以确保获得足够细胞用于多个培养瓶的接种。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将组织转移至含有约5 mL收集培养基的15 mL离心管中，并对剩余鸡蛋重复解剖操作。</li>
		<li>将采集的脂肪垫转移至含有灭菌液的60 mm培养皿中，轻轻晃动数次，进行短暂冲洗。</li>
		<li>将脂肪垫转移至含有1×PBS的60 mm培养皿中，冲洗掉灭菌液，轻轻晃动。再将脂肪垫转移至第二个含有1×PBS的60 mm培养皿中，重复此冲洗步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行酶消化和前脂肪细胞的分离。
	<ol>
		<li>将脂肪组织转移至含有酶消化液的15 mL离心管中，每100 mg组织加入约1 mL预热的酶消化液。将一对长直剪浸入管中，在溶液中将脂肪组织尽可能精细地剪碎（至约1 mm3大小）（图2A）。 
		注：若组织未充分剪碎，细胞得率将降低。</li>
		<li>将剪碎的组织和酶消化液转移至25 mL灭菌锥形瓶中，用石蜡膜封口。将锥形瓶置于培养箱内的旋转摇床上，于37 °C进行消化步骤的振荡。 
		注：也可使用振荡水浴。无论采用哪种方式，振荡速度应足以防止组织碎片沉降至瓶底，但不可过快，以免碎片被甩至瓶顶粘附于玻璃壁，或液体溅至石蜡膜盖上。</li>
		<li>约30分钟后，将1 mL移液枪头末端剪至直径约3 mm。将组织混合物上下吹打数次，以帮助细胞从脂肪组织中释放。随后将锥形瓶放回培养箱或水浴中继续振荡。</li>
		<li>再经过15分钟后，检查消化是否完全。从摇床上取出锥形瓶后，液体表层会形成一层乳白色细胞层。若仍有组织碎片残留，可剪去另一移液枪头末端，轻轻吹打混合物，然后继续振荡15分钟。 
		注：完全消化的组织/胶原酶混合物外观类似乳白色食糜。通常情况下，轻柔振荡1小时后组织已充分消化。若此时仍残留大量碎片，可能提示所用胶原酶存在问题。持续振荡可提高细胞得率，但长时间酶处理和机械应力也可能损伤细胞。</li>
		<li>消化完成后，轻轻吹打混匀。使用移液器将混合物通过250 µm细胞筛网过滤至15 mL离心管中，以去除未消化的组织碎片和杂质。
		<ol>
			<li>用4 mL生长培养基吹洗锥形瓶，回收可能粘附于玻璃壁上的细胞，并将洗液过滤至同一15 mL离心管中。再用额外生长培养基吹洗筛网，使滞留细胞松脱，总体积不超过14 mL。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在室温下以300 × g离心5分钟（50 mL管为7分钟）使细胞成团沉淀。 
		注：每次返回细胞培养操作台前，务必用70%乙醇擦拭离心管。</li>
		<li>吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用移液器将沉淀轻轻重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中（见材料表），上下吹打混匀，室温孵育5分钟。随着红细胞裂解，溶液将变为微红色（图2B）。 
		注：使用前将红细胞裂解缓冲液置于室温。鸡的红细胞为有核红细胞9，可附着于组织培养皿，与前脂肪细胞共存。使用红细胞裂解缓冲液可裂解这些细胞，防止其干扰细胞计数的准确性。</li>
		<li>向含细胞的离心管中加入5 mL生长培养基，稀释裂解缓冲液，并通过移液器上下吹打轻轻混匀。使用移液器将混合物通过40 µm细胞筛网过滤至新的50 mL离心管中，并用额外5 mL生长培养基冲洗筛网。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心7分钟使细胞成团沉淀。小心吸除上清液，用移液器将沉淀细胞轻轻重悬于1 mL生长培养基中。
		<ol>
			<li>使用血细胞计数板、细胞计数仪和台盼蓝染色进行细胞计数并测定细胞活力。取10 µL样品，与10 µL台盼蓝混合，吹打混匀。取10 µL混合液加入血细胞计数板，进行测定10。 
			&#8203;注：若初次离心后细胞沉淀不明显，可将离心速度提高至600 × g。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 前脂肪细胞的接种与培养
<ol>
	<li>在T-25培养瓶中加入4 mL预热的生长培养基，接种约1 × 106个细胞。若使用其他类型的培养容器，应保持相同的接种密度。将培养瓶放入组织培养孵箱中，过夜培养使细胞贴壁。 
	注：细胞在38 °C、含5% CO2的湿润环境中培养。禽类细胞生长的最适温度为38 °C，在37 °C时生长较慢11。</li>
	<li>次日，吸除培养基，用1× PBS轻轻洗涤细胞，通过移液去除未贴壁或死亡的细胞，然后加入4 mL新鲜生长培养基。在显微镜下观察细胞，细胞应呈细长形，类似成纤维细胞（图2A）。 
	&#8203;注：前脂肪细胞通常贴壁较快（数小时内）。此时（培养24小时后）可确认细胞分离是否成功。</li>
	<li>每2天更换4 mL新鲜生长培养基，当细胞融合度达到70%–80%时进行传代或冻存（图3C）。</li>
</ol>
4. 传代培养与冷冻保存
<ol>
	<li>吸弃旧培养基，用 4 mL 1× PBS 轻柔洗涤细胞，使用移液器操作。吸弃 PBS，向 T-25 培养瓶中加入 2 mL 0.1% 胰蛋白酶以覆盖细胞表面（其他培养容器请按比例调整体积），然后在 38 °C 下孵育 3–4 分钟。 
	注意：观察细胞是否已从培养皿上脱落。可轻敲培养皿以促进细胞脱落。胰蛋白酶消化时间过长会损伤细胞。</li>
	<li>加入等体积预热的生长培养基以终止胰蛋白酶反应。反复吹打细胞表面数次，倾斜培养皿以松动残留的细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟（若使用 50 mL 管，则离心 7 分钟）。吸弃上清液。</li>
	<li>若进行传代培养，用 1 mL 生长培养基通过移液上下吹打重悬细胞沉淀。按照步骤 2.3.9.1 所述方法计数细胞，然后按照步骤 3.1 中初始接种密度重新接种。</li>
	<li>若进行冷冻保存，为一个汇合度为 90% 的 T-25 培养瓶准备 4 mL 冷冻培养基。 
	注意：冷冻培养基由 10% DMSO、30% FBS 和 60% DMEM/F12 组成。</li>
	<li>用冷冻培养基重悬细胞沉淀，并将 1 mL 冷冻液转移至冻存管中。使用冻存盒以 -1 °C/min 的速度缓慢冷冻冻存管。将冻存盒置于 -80 °C 超低温冰箱中过夜，随后转移至液氮中进行长期保存。 
	&#8203;注意：正确冷冻保存的前脂肪细胞可维持至少 3 年的活性，解冻并接种后其表现通常与新鲜分离的细胞相当。</li>
</ol>
5. 脂肪向分化
注意：可使用 2% 明胶包被的培养板以增强细胞黏附。
<ol>
	<li>制备2% (w/v)明胶溶液（参见 材料表) 溶于蒸馏水中。121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 30 分钟。用 5–10 µL/cm² 的明胶溶液包被培养表面2 （即 100-200 µg/cm2轻轻混匀，使表面均匀覆盖。</li>
	<li>检查培养板，确保明胶溶液均匀铺展，因为某些区域可能在初始阶段仍未被覆盖。将包被明胶的培养板在室温下静置至少1小时。完全移除孔中的明胶溶液。 
	注意：这将在孔板/培养皿底部留下一层薄薄的明胶涂层。明胶溶液可重复使用多次（至少10次），且不会影响细胞的贴附和生长。在接种细胞前，将明胶包被的培养皿置于组织培养超净台中静置至少30分钟。</li>
	<li>通过在生长培养基中添加脂肪酸，诱导鸡前脂肪细胞进行脂肪生成分化。配制脂肪生成分化培养基（ADM）时，在DMEM/F12中添加10%鸡血清、1x亚油酸-油酸-白蛋白（9.4 µg/mL）和1x青霉素-链霉素溶液（P/S）（参见 材料表使用前将ADM新鲜配制并预热。 
	&#8203;注意：通常通过在培养基中添加脂肪酸而非使用其他物种脂肪细胞常用的激素混合物来诱导鸡前脂肪细胞发生脂肪生成分化12.</li>
	<li>当细胞达到约90%融合度时，用成脂分化培养基替换生长培养基以诱导分化。将细胞维持在此培养基中，每2天更换一次。在显微镜下（20倍）观察脂滴的形成情况以评估分化效果，诱导分化后48小时内脂滴即可明显可见。</li>
</ol>
6. 评估脂肪生成
<ol>
	<li>按照以下步骤进行油红O染色。
	<ol>
		<li>将细胞接种于六孔板中，并在细胞融合度约为90%时诱导其向脂肪细胞分化。</li>
		<li>在50 mL离心管中，将6份油红O储备液与4份蒸馏水混合，配制油红O工作液。通过移液器轻轻吹打混匀，室温静置10分钟，然后将溶液缓慢倒入装有1号滤纸（见材料表）的漏斗中过滤至另一50 mL离心管中。 
		注意：油红O储备液的配制方法为，在已灭菌的瓶中将0.7 g油红O（见材料表）溶解于200 mL 100%异丙醇中，充分混匀后静置20分钟。4 °C避光保存，可稳定保存1年。工作液可在3小时内使用，但建议在2小时内使用完毕。</li>
		<li>吸去培养基，用2 mL预温的1×PBS轻轻洗涤孔内细胞两次，再用移液器彻底吸除PBS。每孔加入2 mL 10%缓冲福尔马林固定细胞，并用封口膜包裹培养板。室温固定至少1小时，最长可放置2天后再进行染色。 
		注意：配制1 L 10%缓冲福尔马林溶液的方法为，将100 mL 37%甲醛、4.09 g NaH2PO4、6.5 g Na2HPO4（见材料表）和900 mL蒸馏水混合。切勿将福尔马林直接滴加到细胞表面，应沿孔壁底部缓慢加入。</li>
		<li>去除福尔马林，用2 mL蒸馏水轻轻洗涤各孔一次，随后更换为2 mL 60%异丙醇。5分钟后吸除异丙醇，并让孔板在室温下完全干燥约10分钟。所有染色步骤均在室温下进行。</li>
		<li>每孔加入1 mL油红O工作液，室温孵育10–20分钟。吸除染液后，将孔板在自来水中浸洗5次，直至无多余染料残留。最后一次漂洗后，在显微镜下观察染色结果并拍照前，向每孔加入1 mL水。</li>
		<li>为定量每孔脂质积累量，吸除水后，向六孔板的每个孔中加入1–2 mL 100%异丙醇（用量应足以完全覆盖细胞），以提取细胞内的油红O染料。室温下置于平板摇床上轻柔振荡孵育10分钟。</li>
		<li>将200 µL提取液转移至96孔酶标板中。使用酶标仪在495 nm波长处测定吸光度，以定量染料的相对含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行细胞内脂滴与细胞核的染色检测。
	<ol>
		<li>将细胞接种于黑色底面的96孔板中，并按照步骤5.3所述方法诱导其向脂肪细胞分化。</li>
		<li>为进行染色，每孔加入200 µL含有荧光脂质染料和荧光DNA染料的染色液（溶于1×PBS中）（见材料表）。根据所需染色液体积总量，按每毫升预温的1×PBS中加入2滴DNA染料和25 µL脂质染料的比例，在铝箔包裹的离心管中配制染液以避光。室温避光孵育20分钟。</li>
		<li>使用荧光酶标仪（见材料表）读取荧光信号。通过红色滤光片检测脂质染料（激发波长：485 nm，发射波长：572 nm），通过蓝色/青色滤光片检测DNA染料（激发波长：359 nm，发射波长：450 nm）。 
		注意：也可在荧光显微镜下观察染色结果并采集图像。</li>
		<li>将脂质染料的荧光强度归一化至DNA染料的荧光强度，以相对于细胞数量定量脂质积累水平13。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管已有多种详细描述的方案报道了前脂肪细胞的分离方法14,15,16,17，但胚胎来源的前脂肪细胞分离方法已得到优化，可用于肉鸡雏鸡早期脂肪生长与发育的功能分析。本方案可获得高活力且具有强分化潜能的胚胎脂肪细胞前体细胞。此外，本前脂肪细胞分离流程不仅适用于胚胎，也可用于出壳后雏鸡。然而，该方法已针对E16期胚胎进行优化，而出壳后雏鸡的细胞得率显著较低（表1），这可能是由于雏鸡快速生长过程中结缔组织相对含量增加所致。
细胞分离是否成功，最终需通过观察贴壁细胞的形态和数量来评估（图3A）。当组织片段消化时间过长时，尤其是组织解离时间超过1.5小时时，可能会观察到细胞数量减少或细胞受损（图3E</st...

肥胖是对成人和儿童的全球性健康威胁。超重或肥胖的儿童在成年后肥胖的可能性约为正常儿童的五倍，这使其患心血管疾病、糖尿病及多种共病的风险显著增加。约有13.4%的2至5岁美国儿童患有肥胖症1，表明体内脂肪过度积聚的倾向可能在生命早期就已形成。出于完全不同的原因，过多脂肪组织的积聚也是肉鸡（肉用型鸡）养殖中的一个关注问题。现代肉鸡的生产效率极高，但仍会积累超过生理需要的脂质2,3。这种趋势从雏鸡出壳后不久即开始，导致饲料——生产过程中最昂贵的部分——被无效地用于脂肪沉积而非肌肉生长。因此，尽管原因截然不同，但对于儿童和肉鸡而言，均有必要深入了解影响脂肪组织发育的因素，并探索在生命早期限制脂肪组织扩张的方法。
脂肪细胞由前脂肪细胞分化而来，前脂肪细胞是脂肪组织来源的干细胞，可分化为成熟的、储存脂质的脂肪细胞。因此，前脂肪细胞 体外 是肥胖研究中重要的实验模型。这些细胞分离自脂肪组织的基质血管组分，有助于深入理解调控脂肪细胞分化和代谢的分子通路。4,5鸡胚是发育研究中理想的实验模型，因为通过按需培养鸡蛋可更方便地进行实验操作，无需牺牲母体即可获取处于不同发育阶段的胚胎。此外，与其他较大的动物模型相比，获取鸡胚所需的外科手术操作更简单，耗时也更短。因此，鸡胚为研究脂肪组织发育最早阶段的前脂肪细胞提供了良好机会。鸡胚皮下脂肪组织约在胚胎发育第12天（E12）开始可见，表现为大腿周围界限清晰的脂肪沉积区域。该区域富含高增殖活性的前脂肪细胞，在发育信号的调控下可积极分化为成熟脂肪细胞。6,7脂肪生成分化过程在鸡和人类之间具有可比性。因此，从鸡胚胎中分离的前脂肪细胞可作为同时适用于人类和家禽研究的双重用途模型。然而，随着细胞老化并发育为成熟脂肪细胞，前脂肪细胞的产量会下降。5.
本方案优化了在肉鸡胚胎发育阶段（E16-E18）分离前脂肪细胞的方法，该阶段是脂肪组织中脂肪生成分化和脂肪细胞肥大的高峰期8。该技术可用于评估胚胎在蛋内（in ovo）暴露于各种因素（如母鸡饮食）对脂肪细胞发育及体外（ex vivo）脂肪生成潜能的影响。同时，也可用于检测多种干预措施（例如低氧、营养添加、药理学激动剂和拮抗剂）对脂肪生成过程或脂肪细胞前体细胞的各种“组学”（如转录组、代谢组、甲基化组）的影响。由于所获得的细胞代表了脂肪组织形成的最早阶段，因此本方案获取的细胞是研究家禽及人类脂肪发育相关问题的重要模型。

<table><tbody><tr><td>1 mL 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>Z683825</td><td>单通道移液器，100 - 1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>1 mL 移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% 异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 锥形瓶</td><td>Pyrex</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>96 孔检测板</td><td>Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板，黑色底</td><td>Costar</td><td>3603</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>AdipoRed</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>台面擦拭纸（Kimtechwiper）</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Up &amp;amp; Up</td><td>NDC 1167300334</td><td>20% 工作液</td></tr><tr><td>细胞计数器</td><td>Corning</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管，15 mL</td><td>VWR</td><td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管，50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子，100 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>弯头手术剪，115 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Millipore</td><td>SYNSV0000</td><td>按需取用</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% 工作液</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>荧光酶标仪</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Reynolds</td><td></td><td>Reynolds Wrap 加厚型铝箔，125 平方英尺</td></tr><tr><td>冻存盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Millipore</td><td>4055</td><td>2% 工作液</td></tr><tr><td>血细胞计数板（计数室）</td><td>Corning</td><td>480200</td><td>深度 0.1 mm</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td>器械灭菌器</td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>亚油酸-油酸-白蛋白</td><td>Sigma</td><td>L9655</td><td>1x 工作液</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661070</td><td>12 通道移液器，30 - 300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>油红 O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>IKA</td><td>KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（P/S）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x 工作液</td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，60 mm</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>板式摇床</td><td>VWR</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Roche</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>小烧杯，100 mL</td><td>Pyrex</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>分光光度酶标仪</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>McKesson</td><td>762703</td><td></td></tr><tr><td>直头镊子，120 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>直头剪刀，140 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>组织培养用培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>组织筛，250 &amp;micro;m</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>0.1% 工作液</td></tr><tr><td>镊子，110 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 1 号滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>

从肉鸡胚胎中分离前脂肪细胞

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

原代前脂肪细胞是研究调控脂肪细胞分化和代谢的分子通路的重要实验体系。利用鸡胚可以分离到脂肪组织发育最早阶段的前脂肪细胞。该原代细胞可用于鉴定影响前脂肪细胞增殖及脂肪生成分化的因子，因而成为研究儿童肥胖以及家禽体内多余脂肪沉积调控的宝贵模型。在肉鸡中，出生后脂肪组织的快速生长将饲料资源无效地分配至脂肪而非肌肉生长，造成饲料浪费。因此，深入理解脂肪组织发育的最初阶段，可能为调控这一趋势提供线索，并有助于在生命早期限制脂肪组织的扩张。本研究旨在建立一种高效的方法，用于从商业肉用鸡（肉鸡型）胚胎发育中的脂肪组织分离前脂肪细胞，并进行原代培养及脂肪生成分化。该方法已优化至可获得高活力（约98%）且具有更强分化为成熟脂肪细胞能力的细胞。这种简便的胚胎前脂肪细胞分离、培养与分化方法，为生命早期脂肪生长与发育的功能性研究提供了有力支持。

原代前脂肪细胞在形态上类似于成纤维细胞，呈不规则的星状，具有一个中央细胞核（图2A-C）。这些细胞可迅速贴附于组织培养塑料表面，并在贴壁后很快开始增殖。当培养基中含有脂肪酸时，它们会快速分化并积累脂滴（图3D）。本研究所述分离实验中报告的细胞活力（基于染料排斥法测定为98%）具有代表性。尽管这些细胞具有较强的耐受性，但在分离过程中操作过于剧烈会导致细胞损伤（图3E），从而产生贴壁能力差且无法增殖的细胞。尽管已采取措施防止微生物污染，但仍可能发生非无菌材料的转移（图3F）。由于其增殖速度快，鸡胚前脂肪细胞对培养基中葡萄糖的消耗速率较高。为维持其能量供应，应每48小时更换一次培养基。
此处展示的代表性结果说明了鸡胚前脂肪细胞的成脂潜能。在成脂条件下，这些细胞可迅速积累并形成脂滴，且随...

本实验方案描述了一种从肉鸡胚胎脂肪组织中分离前脂肪细胞的简单方法。该方法能够高效地分离前脂肪细胞，并实现其原代培养和成脂分化。通过油红O染色以及脂质/DNA染色，检测了经分化培养基诱导后分离细胞的成脂能力。

原代前脂肪细胞是研究调控脂肪细胞分化和代谢的分子通路的重要实验体系。

原代前脂肪细胞是研究调控脂肪细胞代谢分子通路的重要实验体系。利用鸡胚可从前脂肪细胞发育的最早阶段分离获得此类细胞。本方法经过优化，可获得高活力且分化为成熟脂肪细胞能力增强的细胞，适用于雏鸡早期生命阶段脂肪生长与胚胎发育的功能分析。鸡与人类之间的脂肪生成分化过程具有高度可比性。因此，分离的前脂肪细胞可作为与人类和家禽相关研究的双重用途模型。首先用70%乙醇擦拭胚胎体。随后，为防止消化后后续过滤步骤中产生干扰，用无菌纱布轻轻擦拭皮肤表面以去除羽毛。然后剪开腿部与腹部之间的皮肤，暴露出一对股部脂肪组织。用一只手持弯头镊子夹住腿部周围的皮肤，轻轻剥离股部皮下脂肪。用另一只手操作。随后，使用弯头镊子轻轻将储库从腿部剥离。将组织转移至含有5毫升收集培养基的15毫升离心管中，并对另一侧脂肪垫重复上述解剖操作。现在，将收集的脂肪垫转移至含有消毒液的60毫米培养皿中，通过轻轻旋转培养皿数次进行短暂冲洗。随后，将脂肪垫转移至含有PBS的60毫米培养皿中，以去除消毒液。轻轻摇晃培养皿，并再次用PBS洗涤。为消化脂肪组织，将其转移至含有预热酶解液的15毫米离心管中。然后将一把长直剪刀浸入管内，最终将脂肪组织在溶液中剪切成尽可能小的碎片。将剪碎的组织和酶解液转移至25毫升灭菌锥形瓶中。用封口膜包裹烧瓶，并将烧瓶置于37摄氏度的摇床培养箱中进行消化。消化完成后，轻轻吹打混匀。然后通过250微米细胞筛过滤，将液体转移至15毫升离心管中，以去除未消化的组织碎片和残渣。现在，用四毫升培养基冲洗培养瓶，去除贴壁的细胞，并将细胞悬液过滤至同一个15毫升离心管中。接着，用移液管再次将培养基吹过滤网，以冲洗掉滤器中残留的任何细胞。在室温下以300 × g离心5分钟，使细胞形成沉淀，然后小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。轻轻将沉淀重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中，用移液器充分混匀，并在室温下孵育5分钟。然后向含有细胞的离心管中加入5 mL培养基，轻轻吹打混匀。接着将细胞悬液转移至40 µm细胞滤筛中，过滤至新的50 mL离心管中。然后用额外的五毫升培养基冲洗滤网，并在室温下以300 × g离心七分钟收集细胞沉淀。小心吸除上清液。用移液枪将剩余的细胞沉淀重悬于一毫升培养基中。为测定细胞密度和活性，用移液枪吸取10微升每种样品与台盼蓝混合。取10微升混合液加入血细胞计数板，进行细胞计数。在24、48和72小时后对前脂肪细胞的分析显示，细胞形态和数量均正常。前脂肪细胞的脂肪生成诱导显示出快速分化及脂滴积聚。在分离过程中对前脂肪细胞进行剧烈操作会导致细胞损伤和细胞数量减少。尽管采取了预防措施，仍可能观察到微生物污染。油红O染色显示，在成脂诱导条件下，前脂肪细胞迅速开始形成脂滴，且随着时间推移，脂质积累逐渐增加，分别在24、48和72小时的观察中可见。使用脂质和DNA染色剂对相对于细胞数量的脂质积累进行了定量。随着时间的推移，脂质积累和细胞增殖均有所增加。当组织组分消化时间过长时，可观察到细胞数量较少或细胞受损的情况。因此，建议消化时间不超过一个半小时。分离得到的前脂肪细胞可用于基因表达研究。可获得足量的RNA，用于cDNA合成及后续的qPCR或RNA-seq分析。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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利用快速定量的鸡胚尿囊膜活体模型发现转移调控因子

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使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

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在发育过程中观察和接触鸡胚具有一定的挑战性。我们开发了一种简单、经济的体外培养（ex ovo）方法，可广泛应用于课堂教学或科研环境。该方法能够使研究者在胚胎发育的较晚阶段（HH...

优化的 体外培养 培养鸡胚胎至发育的较晚阶段

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