Name: 等离子体纳米颗粒的光学捕获用于 原位 表面增强拉曼光谱表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学习利用光学捕获技术操控等离子体纳米颗粒进行表面增强拉曼光谱表征，无需聚集剂即可实现50倍信号增强。该方法适用于生理条件下的灵敏生物分子检测，为疾病生物标志物分析提供新平台。

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我们感谢深圳市科技创新委员会（编号：JCYJ20180306174930894）、中山市科学技术局（2020AG003）以及香港研究资助局（项目编号：26303018）提供的经费支持。我们还感谢车志明教授及其经费支持，该支持来自中华人民共和国香港特别行政区政府创新科技署发起的“健康@创科@香港”计划下的“合成化学与化学生物学实验室&#34;&#34;。

1. 光学装置
<ol>
	<li>将532 nm激光束（拉曼激发光源）导入光镊显微镜的柔性端口（参见材料表）。</li>
	<li>使用750 nm长通二向色镜，将532 nm激光束对准光镊显微镜的立体双层光路，与原有的捕获激光束合并，共同聚焦于样品腔。</li>
	<li>利用750 nm长通二向色镜收集样品腔的背向散射光，并将其重定向至配备液氮冷却电荷耦合器件（CCD）相机的光谱仪（参见材料表）。在光谱采集前，将532 nm陷波滤光片置于光谱仪入射狭缝前方。 
	&#8203;注意：激光开启时必须佩戴护目镜，且激光束必须限制在安全区域内。</li>
</ol>
2. AgNPs 的制备
<ol>
	<li>将50 mL的1 mM AgNO3水溶液置于圆底烧瓶中，加热至沸腾。</li>
	<li>将1.0 mL的0.1 M 柠檬酸三钠溶液逐滴加入煮沸的AgNO3水溶液中。</li>
	<li>在持续搅拌下保持混合液沸腾16分钟。</li>
	<li>将混合液冷却至室温，观察到淡黄色。</li>
	<li>在室温下以2000 × g 离心银纳米粒子（AgNP）胶体5分钟，然后用移液器移除上清液。</li>
	<li>用1 mL去离子水（电阻率为18.2 MΩ·cm）重新悬浮AgNP胶体。</li>
	<li>重复步骤2.5和2.6三次，以去除残留的还原剂。</li>
	<li>采用扫描电子显微镜（SEM）和动态光散射（DLS）33表征AgNPs的粒径分布，以确认其均一性（图2）。通过紫外吸收测定估算AgNP浓度为0.1 nM34。 
	注意事项：由于浓度较低，AgNP储备液可在2-3周内保持不发生聚集，无需添加稳定剂。若在AgNP储备液中观察到沉淀，则需按照上述方案重新制备新的AgNP溶液。</li>
</ol>
3. DSNB 分析物分子与 AgNP 的相互作用
<ol>
	<li>向1 mL AgNP溶胶中加入200 µL的2 mM DSNB（见材料表），在室温下孵育3小时，通过AgNP与DSNB之间形成Ag-S键，在AgNP表面包覆一层DSNB35。该相互作用的示意图见图3。</li>
	<li>在室温下以2,000 × g离心AgNP溶液5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL去离子水重新悬浮AgNP-DSNB复合物。</li>
	<li>重复步骤3.2和3.3三次，以去除过量的DSNB。</li>
	<li>记录AgNP溶胶和AgNP-DSNB溶液的紫外-可见吸收光谱。 
	&#8203;注意：该光谱显示吸收峰从约420 nm红移至450 nm，表明DSNB已成功包覆在AgNP表面（图3）。</li>
</ol>
4. SERS 测量用样品室的制备及 AgNP 组装体的生成
<ol>
	<li>用清水和乙醇清洗载玻片和盖玻片。</li>
	<li>将框架胶带（厚度 0.25 mm，参见材料表）粘附到载玻片上，形成一个腔室（尺寸为 1.0 cm 长 × 1.0 cm 宽 × 0.25 mm 高）。</li>
	<li>向框架内加入数滴 AgNP-DSNB 溶液（约 25 µL）。</li>
	<li>将盖玻片盖在框架胶带上并密封（图 4）。</li>
	<li>向液氮冷却 CCD 相机的容器中加入液氮，直至温度降至 -120 °C。</li>
	<li>使用磁性激光安全挡板遮挡拉曼探针光路（参见材料表），然后打开 532 nm 拉曼激发光源激光器。</li>
	<li>将含有 AgNP-DSNB 溶液的样品腔室固定在腔室支架上。向水浸物镜（放大倍数 60x，数值孔径 A 为 1.2）中加水，如图 1所示。随后立即将腔室支架放置在物镜上方的显微载物台上。</li>
	<li>在盖玻片上方滴加浸油，并调整油浸式聚光镜的位置，以便在显微镜相机上观察到颗粒。</li>
	<li>通过旋转显微镜的调焦旋钮，调节物镜的 Z 轴位置，使 532 nm 拉曼探针光束聚焦在腔室的底部玻璃表面，在显微镜相机上呈现一个白点（图 5）。
	<ol>
		<li>调节显微载物台的 X 和 Y 位置，移动腔室，使腔室中心区域对准白点。打开光镊控制软件（参见材料表），使用配套的操纵杆控制，将 1064 nm 捕获激光（在光镊系统中以红圈指示）移动至与白点重合（图 5）。</li>
		<li>接着，调节显微镜旋钮，向上移动物镜的 Z 轴位置。 
		注：显微镜相机图像中白点消失，表明 532 nm 拉曼探针光束已聚焦于腔室内部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启 1064 nm 捕获激光，吸引样品腔室中的 AgNP，形成等离激元 AgNP 组装体。 
	注：AgNP 的聚集会在样品腔室中形成一个暗斑（图 6B）。
	<ol>
		<li>必要时降低捕获激光功率，以避免过热或气泡产生。 
		注：若未观察到明显的 AgNP 组装体形成，可增加捕获激光功率和照射时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节样品显微载物台的位置，使等离激元 AgNP 组装体的暗斑位于 532 nm 拉曼探针光束的焦点下方，以进行光谱测量。</li>
	<li>在 532 nm 拉曼激光出口前放置中性密度（ND）滤光片，将激光功率调节至 10 mW。在光谱软件的设置面板中输入采集时间（本研究为 10 s，图 6）（参见材料表），然后点击“采集”按钮开始光谱采集。 
	注：此步骤可获得分析物分子的表面增强拉曼散射（SERS）光谱（代表性结果中为 DSNB，见图 6）。</li>
</ol>

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<li>Wang, S., Fu, L., Zhang, Y., Wang, J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+and+optimization+of+photothermal+bubble+generation+around+overheated+nanoparticles+excited+by+pulsed+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation and optimization of photothermal bubble generation around overheated nanoparticles excited by pulsed lasers.</a> Journal of Physical Chemistry C. 122 (42), 24421-24435 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究报道了一种结合光镊捕获与表面增强拉曼散射（SERS）检测的分析平台，用于原位分子表征。in situ 分子表征通过立体双层光路将532 nm拉曼探测光束与1064 nm捕获激光束合并，实现共焦聚焦与后向散射几何构型下的光谱信号收集。捕获激光束诱导银纳米粒子（AgNPs）组装形成等离激元热点，随后由拉曼探测激光束激发，从而产生溶液中分析物分子的SERS信号。作为概念验证，实验检测了包被在AgNPs表面的DSNB分子。在捕获激光控制的AgNPs组装区域内，DSNB信号相比周围分散的AgNPs增强了约50倍。在该平台上进行的溶液相SERS测量中，分析物分子的类似高信号放大结果可重复获得。
影响表面增强拉曼散射（SERS）信号放大的关键步骤是形成由光阱诱导的银纳米粒子（AgNP）组装体。通过精细调节捕获激光功率、照射时间以及AgNP浓度等实验参数，可优化分析物分子的SERS信号。如图8所示，使用较高的捕获激光功率可提高AgNP组装体形成的效率。当捕获激光功率从450 mW增加至700 mW时，可获得可重复的AgNP组装体。然而，当捕获激光功率高于950 mW时，可能引起过热和气泡产生38。因此，建议采用适中的捕获激光功率以形成动态的AgNP组装体。类似地，延长照射时间有助于促进AgNP组装体的形成。图8B显示，当照射时间从5秒增至20秒时，形成了清晰的球形AgNP组装体。但照射60秒后，AgNP组装体发生形变。此外，提高AgNP浓度（从0.01 nM增至0.05 nM）可加速AgNP组装体的形成，而在0.25 nM浓度下则迅速出现过热现象，如图8C所示。若未观察到明显的AgNP组装体形成，建议提高捕获激光功率和照射时间。一旦形成稳定的AgNP组装体，必须降低捕获激光功率，以避免潜在的热损伤。
光学捕获诱导的银纳米粒子（AgNP）组装体的表面增强拉曼散射（SERS）活性归因于捕获激光辐照区域内局部AgNP浓度的增加，该区域即图6B中的暗斑。在流动的AgNP溶液中，光学捕获能够持续吸引AgNP在受限空间内聚集，并在粒子间的连接处形成等离激元热点，从而产生增强的电场，进一步增强SERS效应。这一点通过在较高AgNP浓度（1.00 nM）下获得的更强SERS信号得到了进一步验证，相比之下，在无捕获激光作用下，较低AgNP浓度（0.05 nM）时获得的SERS信号较弱，如图6E所示。
此外，通过光镊技术在溶液中对抗布朗运动，实现对等离激元银纳米粒子（AgNP）组装体的位置控制，显著提高了表面增强拉曼散射（SERS）测量的效率与稳定性。当与微流控系统联用时，可实现高通量检测。与传统的通过盐诱导纳米粒子聚集以生成SERS活性基底的方法相比，本平台能够在设计的位置和时刻动态形成等离激元AgNP组装体，具有更高的灵活性。26,28此外，该方法在纳摩尔浓度的AgNP条件下仍能高效工作，并可实现对SERS活性热点的时空调控 原位 溶液中的光谱测量。当捕获激光关闭后，这种动态的AgNP组装体会在几分钟内逐渐解体。在没有捕获激光的情况下，AgNP组装体在20分钟内几乎完全消失，如图所示 补充图1这可以最大限度地减少对检测系统的影响，在各种生物应用中展现出巨大潜力，尤其是在生理条件下对生物分子（DNA、RNA 和蛋白质）的检测 体内 条件。然而，这种动态的AgNP组装所提供的增强因子小于盐诱导的AgNP聚集体。2因此，需要进一步的修改和完善。
综上所述，光镊技术与表面增强拉曼散射（SERS）检测的结合提供了一种便捷的方法，可实现对等离激元纳米粒子的操控，并在溶液中高效、稳定且具有生物相容性地获得可重复的SERS信号增强，从而检测分析物分子。

表面增强拉曼光谱（SERS）是一种高灵敏度的分析技术，可用于在极低浓度甚至单分子水平下直接检测目标分子的化学结构1,2,3,4。激光照射可诱导金属纳米结构产生局域表面等离激元共振，此类纳米结构被用作SERS基底以放大目标分子的拉曼信号。由盐诱导形成的纳米粒子聚集体是广泛使用的SERS基底，其在胶体悬浮液中可自发进行布朗运动5,6。进一步干燥虽可实现稳定的SERS测量，但可能导致杂质富集，从而引入背景噪声并对生物样品造成不可逆损伤7。因此，有必要开发无盐的纳米粒子聚集方法，在溶液中控制其运动，同时在保持检测效率的前提下提高生物相容性。
光镊技术已被用于操控多种金属基底并促进表面增强拉曼光谱检测8,9,10,11,12,13,14通过紧密聚焦激光束产生光阱，形成一个光学力场，将微小物体吸引至焦点周围光强最高的区域15,16近年来，光镊已被用于开发可重复且高灵敏度的等离激元传感平台，应用于多种场景，展现出其在溶液中定位和控制表面增强拉曼散射活性金属纳米结构位置方面的独特优势。17,18,19,20,21,22,23,24本实验方案介绍了一种结合光镊与拉曼光谱显微技术的方法，用于在溶液中动态组装银纳米颗粒（AgNPs）并抑制其布朗运动，从而实现稳定的表面增强拉曼散射（SERS）高效检测。在AgNPs组装区域，包被于AgNPs表面的分析物分子3,3'-二硫代双[6-硝基苯甲酸]双琥珀酰亚胺酯（DSNB）的信号可增强约50倍。该方法适用于对化学封端剂不兼容的敏感生物分子的分析。25,26,27此外，它能够提供空间和时间上的控制，以生成具有表面增强拉曼散射活性的银纳米粒子组装体。这使得 原位 在水环境中进行检测，从而可能降低银纳米颗粒（AgNPs）的使用量，并减少对体系的干扰 体内 分析28,29,30此外，光镊诱导的AgNP组装具有稳定性、可重复性和可逆性31,32因此，它是一种极具前景的平台，可用于在溶液中及生理条件下检测分析物分子，而这些条件不适用于盐诱导聚集法。
在本研究中，将1064 nm捕获激光器、力检测模块和明场照明光源集成到光镊显微系统中，用于颗粒的光学操控与可视化。同时将532 nm拉曼探测激光器引入显微镜，并与样品室中的捕获激光共线对准。在光谱采集过程中，收集后向散射光并将其导入光谱仪（图1）。

<table><tbody><tr><td>1064 nm 捕获激光器</td><td>IPG Photonics, 美国</td><td>1064 nm 连续波 Yb 光纤激光器，10 W</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二硫代双[6-硝基苯甲酸]双(琥珀酰亚胺酯)&amp;nbsp;</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>FD15467</td><td></td></tr><tr><td>532 nm 拉曼激发光源</td><td>CNI, 中国</td><td>MLL-III-532</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake 软件</td><td>LUMICKS, 荷兰</td><td>版本 1.6.12</td><td>光镊控制软件</td></tr><tr><td>封框胶带</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc</td><td>AB-0576</td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Cargille Laboratories, Inc</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>液氮冷却电荷耦合器件 (CCD) 相机</td><td>Teledyn Princeton Instrument, 美国</td><td>400B eXcelon</td><td></td></tr><tr><td>长通二向色镜</td><td>AHF, 德国</td><td>F48-801</td><td></td></tr><tr><td>磁性激光安全屏蔽屏</td><td>ThorLabs</td><td>TPSM2</td><td></td></tr><tr><td>光镊显微镜</td><td>LUMICKS, 荷兰</td><td>m-trap</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Sigma-Aldrich 中国有限公司</td><td>S8157</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>Teledyn Princeton Instrument, 美国</td><td>IsoPlane SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠</td><td>Sigma-Aldrich 中国有限公司</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>WinSpec 软件</td><td>Teledyn Princeton Instrument, 美国</td><td>版本 2.6.24.0</td><td>光谱分析软件</td></tr></tbody></table>

等离子体纳米粒子的光镊捕获 原位 表面增强拉曼光谱表征

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

表面增强拉曼光谱（SERS）由于金属纳米结构产生的增强电场，能够在多种应用中实现对分析物分子的超灵敏检测。由盐诱导的银纳米粒子聚集是制备SERS活性基底的最常用方法，但其在重现性、稳定性和生物相容性方面存在局限。本实验方案结合光学操控与SERS检测技术，构建一个高效的分析平台以解决上述问题。在显微镜系统中，将1064 nm的捕获激光与532 nm的拉曼探测激光结合，用于组装银纳米粒子，从而形成等离激元热点，用于 原位 在水相环境中进行SERS检测。在无需聚集剂的情况下，这种动态等离子体银纳米粒子组装可使分析物分子信号增强约50倍。此外，它能够在低至0.05 nM的分析物包覆银纳米粒子溶液中实现SERS活性组装的空间和时间控制，从而最大限度地减少对体系的潜在干扰 体内 因此，这种集成光镊的表面增强拉曼散射平台在液体中，特别是在水性生理环境中，具有实现高效、可重复且稳定的分子分析的巨大潜力。

作为概念验证，选择 DSNB 作为分析物分子并将其包被在 AgNPs 表面。等离激元 AgNP 组装体和分散 AgNP 增强的 DSNB 典型 SERS 谱图如图6所示。在无捕获激光的情况下，样品腔中分散的 AgNPs 在拉曼探针激光激发下产生了一条黑谱（图6A）。在约 1380–1450 cm-1 处观察到一个微弱且宽泛的 SERS 信号，对应于 DSNB 分子对称 NO2 伸缩振动的特征峰，这与文献报道一致35,36。由于分散的 AgNPs 处于布朗运动状态，颗粒间的连接较大且不稳定，如图6C所示。因此，分散 AgNPs 对 DSNB 的 SERS 信号增强效果较低。
当捕获激光开启时，AgNPs 会聚集形成等离激元 AgNP 组装体。增加捕获激光的功率并延长照射时间可吸引更多 AgNPs，并产生一个暗斑，如图6B所示。本实验中，在指定位置和时刻，采用700 mM的捕获激光功率和20 s的照射时间，在0.05 nM DSNB修饰的AgNP溶液中构建了等离激元AgNP组装体。DSNB的表面增强拉曼光谱（SERS）信号在等离激元AgNP组装区域被检测到（图6A，红色曲线）。位于930 cm-1的强拉曼峰归属于硝基的剪式振动；1078 cm-1、1152 cm-1和1191 cm-1处的显著峰可能对应于DSNB中琥珀酰亚胺基的N-C-O伸缩振动与芳香环振动模式的重叠35,37。1385 cm-1和1444 cm-1处的特征峰源于DSNB的对称硝基伸缩振动，由于与AgNP表面发生相互作用，这些峰显著增强并略有偏移35,37。根据已有文献报道的DSNB的SERS指纹特征35,36,37，1579 cm-1处的峰被指认为DSNB的芳香环振动模式。在等离激元AgNP组装体中，DSNB的整体拉曼信号强度高于分散态AgNP中的信号强度。以1444 cm-1特征峰的强度为参考，等离激元AgNP组装体相较于分散态AgNP可将DSNB的SERS信号增强约50倍。如图7所示，在实验中对AgNP组装体连续重复采集了20次DSNB的SERS光谱，结果显示出完全一致的振动特征。对这20次SERS光谱中DSNB在1152 cm−1、1444 cm−1和1579 cm−1处特征峰的强度进行统计分析，绘制为直方图，其相对标准偏差（RSD）分别为6.88%、6.59%和5.48%，进一步验证了该方法的重现性与稳定性。因此，该方法在溶液中操控等离激元纳米粒子及对分析物分子进行SERS检测方面具有良好的可靠性。
<img alt="激光光谱装置示意图；光学激发、发射、明场显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：光镊耦合拉曼光谱平台的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒尺寸分析；SEM 图像及尺寸分布图；颗粒直径 46.5 nm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于 SERS 测量的 AgNP 制备。（A）AgNP 的 SEM 图像。（B）通过 DLS 测得的 AgNP 尺寸分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="银纳米颗粒 (AgNP) 修饰，吸收光谱比较；示意图，光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：AgNP 与 DSNB 的相互作用。 （A）DSNB 在 AgNP 表面包覆的示意图。 （B）AgNP 和 AgNP-DSNB 的紫外-可见吸收光谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜载玻片制备示意图；盖玻片、框架胶带、液体样品施加过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：样品腔室制备示意图。 （A）样品腔室制备过程。（B）制备完成的样品腔室。比例尺 = 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="光路装置中的激光位置（532 nm 和 1064 nm）。光谱学中的光束准直示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：532 nm 拉曼激光与 1064 nm 捕获激光的位置重叠。 (A) 由白点指示的 532 nm 拉曼激光位置。(B) 由红圈指示的 1064 nm 捕获激光位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="拉曼光谱实验；等离激元AgNP组装分析；示意图显示光镊装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：等离激元AgNP组装增强的分析物分子的典型SERS光谱。（A）在等离激元AgNP组装（红色）和分散AgNP（黑色）上的DSNB的SERS光谱。（B）当捕获激光开启时，等离激元AgNP组装在显微观察下呈现暗斑。（C）当捕获激光关闭时的分散AgNP。（D）AgNP组装形成机制示意图。（E）无捕获激光时SERS强度的浓度依赖性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="拉曼光谱图；强度与拉曼位移；光谱数据变异性图表；光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 7"> 
图 7：DSNB 的表面增强拉曼散射（SERS）信号的重现性。（A）在实验中于等离子体 AgNP 组装体上重复记录的 20 条 DSNB 的 SERS 光谱。（B）DSNB 在 1152 cm-1（RSD = 6.88%）、1444 cm-1（RSD = 6.59%）和 1579 cm-1（RSD = 5.48%）处特征峰强度的直方图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光镊捕获示意图；激光功率、辐照时间、AgNP浓度的影响；显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：不同实验参数下生成的AgNP组装结构。（A）不同捕获激光功率；辐照时间20 s，AgNP浓度0.05 nM。（B）不同辐照时间；捕获激光功率700 mW，AgNP浓度0.05 nM。（C）不同AgNP浓度；辐照时间20 s，捕获激光功率700 mW。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：当捕获激光关闭后，AgNP组装过程的时间序列显微镜相机图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/Figure%20S1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种将光镊技术与表面增强拉曼光谱（SERS）相结合的便捷方法，用于操控等离激元纳米粒子以实现对分子的高灵敏度检测。在无需聚集剂的情况下，利用捕获激光将等离激元纳米粒子组装起来，从而增强目标分析物的SERS信号 原位 光谱测量

表面增强拉曼光谱（SERS）由于增强了电场，在多种应用中实现了对分析物分子的超灵敏检测。

该方案可在无需聚集剂的条件下，实现对表面增强拉曼散射（SERS）活性纳米粒子组装过程的空间和时间控制，从而实现对目标分析物的高灵敏度检测。本方法的主要优势在于，无需使用聚集剂即可形成具有SERS活性的纳米粒子组装体，因此适用于在生理条件下分析敏感的生物分子。该技术为在微流控系统中检测溶液及生理条件下的分析物分子（如疾病生物标志物）提供了一个极具前景的平台。首次使用该方法时，研究人员可能需要优化捕获激光功率、照射时间以及银纳米颗粒浓度，以获得最佳效果。首先，将532纳米激光束导入光镊显微镜的柔性端口。利用750纳米长通二向色镜，将532纳米激光束与光镊显微镜的立体双层光路对齐，使其与原有的捕获激光束合并，并聚焦于样品腔室。使用750纳米长通二向色镜收集样品室的背向散射光，并将其导入配备液氮冷却电荷耦合器件相机的光谱仪中。在光谱采集前，将532纳米陷波滤光片置于光谱仪入射狭缝前方。用去离子水和乙醇清洗载玻片和盖玻片。将框架胶带粘附到玻片上以形成反应腔室。向框架内加入数滴银纳米颗粒 DSNB 溶液。将盖玻片置于框架胶带上并密封。向液氮冷却的电荷耦合器件相机的容器中加入液氮，直至温度降至零下120摄氏度。使用磁性激光安全挡板阻断拉曼探针光路，然后开启532纳米拉曼激发光源激光器。将装有银纳米颗粒DSNB溶液的样品室固定在样品室支架上。向水浸物镜中加入水，然后立即将腔室支架放置在物镜上方的显微镜载物台上。在盖玻片上方滴加浸油，并定位油浸式聚光镜，以便在显微镜相机上观察到颗粒。通过旋转显微镜的调节旋钮，调整物镜的Z轴位置，直至532纳米拉曼探针光束聚焦于腔室的底部玻璃表面，在显微镜相机上呈现一个白点。调节微调平台的 X 和 Y 位置，移动样品室，使样品室的中心区域位于白点处。打开光镊控制软件，使用配套的操纵杆控制将 1,064 纳米捕获激光移动至与白点重合。接着，调节显微镜旋钮，向上移动物镜的 Z 位置。打开1,064纳米的捕获激光，以吸引样品室中的银纳米颗粒并形成等离激元银纳米颗粒组装体。根据需要调低捕获激光光束强度，以避免过热或气泡产生。调节样品微位移台的位置，使等离激元银纳米颗粒组装体的暗斑位于532纳米拉曼探测光束的焦点下方，以进行光谱测量。将中性密度滤光片置于532纳米拉曼激光出口前方，将激光功率调节至10兆瓦。在光谱软件的设置面板中输入采集时间，然后点击“采集”按钮以开始光谱采集。在无捕获激光的情况下，样品室中分散的银纳米颗粒产生了一条黑色光谱。增加捕获激光的功率并延长照射时间，可吸引更多银纳米颗粒并形成暗斑。由于分散的银纳米颗粒处于布朗运动状态，颗粒间的连接较大且不稳定。在等离激元银纳米颗粒组装体中，DSNB的整体强度高于分散银纳米颗粒的强度。根据位于1,444 cm⁻¹处的特征峰强度，与分散的银纳米颗粒相比，等离子体银纳米颗粒组装体可使DSNB的表面增强拉曼光谱信号增强约50倍。在这20组表面增强拉曼光谱中，DSNB在1,152、1,444和1,579 cm⁻¹处的特征峰强度以直方图形式展示，其相对标准偏差分别为6.88%、6.59%和5.48%。该实验过程中最关键的是准确定位532 nm拉曼探测激光的位置，并使其与1,064 nm捕获激光重叠。该技术为研究人员在生理条件下实现对分析物分子的时空可控检测提供了途径，有望用于未来的活体分析。

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