实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多样评价指标

本协议描述了使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并使用临床评分系统监测疾病过程。采用小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放现场试验分析实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状，全面评估疾病过程。

目前尚无完全治愈多发性硬化症的方法。我们的协议允许有效构建实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，以帮助探索多发性硬化症疾病的治疗方法。我们方案的主要优点是从多个角度更全面地评估实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗。

首先通过在pH 7.4下溶解冻干肽和无菌预冷的不含钙和镁离子的PBS来制备髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽乳液。将一个灭菌的五毫米钢球加入干净的两毫升微量离心管中。然后将500微升含有每毫升冻干结核微杆菌5毫克和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽肽乳液的500微升完全弗洛伊德佐剂加入管中。

现在将管在组织裂解器上振荡 10 分钟。然后将试管在冰上冷却 10 分钟。重复该过程四次，直到形成白色粘性溶液。

接下来，将百日咳毒素茎溶液在pH 7.4的无菌PBS中稀释50倍，不含钙和镁离子，以达到每100微升200纳克的最终浓度。为了在管底部沉淀所有最初制备的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽乳液，通过按下设备上的脉冲按钮，将管在四摄氏度下离心两到三秒钟。用装有22号针头的1毫升注射器吸出髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽乳液，并将乳液转移到新的1毫升注射器桶中。

将 26 号针连接到枪管上，并用密封膜固定连接。在小鼠背脊的每一侧皮下注射100微升髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽乳剂。注射后，观察皮肤和背部下球状肿块的自动形成。

然后腹腔内，将100微升百日咳毒素注射到同一只小鼠中。准备一个开放场反应室，并设置一个视频分析系统来记录鼠标运动。为了在实验前清洁反应室，在整个区域喷洒70%乙醇并用干净的纸巾擦拭。

接下来，将鼠标放在反应室的角落里。要开始拍摄，请单击视频录制系统菜单栏中的开始捕获按钮并记录时间。在考场内保持安静，让鼠标自由移动五分钟。

然后停止录制并保存视频。将鼠标放回笼子里。然后用70%乙醇清洁测试区域并继续下一个鼠标。

将安乐死小鼠平放在解剖托盘上并固定四肢。用镊子握住小鼠的后肢皮肤，用剪刀打开皮肤和肌肉。接下来，小心地使用剪刀将股骨与胫骨和髋骨分开。

用剪刀去除粘附在股骨上的肌肉。然后将股骨在室温下放入70%乙醇中。在这项研究中，评估了髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白衍生肽诱导EAE的能力。

注射肽的小鼠经历了逐渐的体重减轻。注射六到九天后，他们出现了EAE症状，在14到16天后达到顶峰。来自露天测试的跟踪图表明，EAE改变了小鼠的正常探索行为。

与正常小鼠相比，EAE小鼠在早发期，高峰期和缓解期的行进距离明显更短。EAE小鼠在疾病的高峰期和缓解期的活动持续时间也显着减少。此外，在所有三个阶段，EAE小鼠的行进距离和在中心花费的时间显着减少。

EAE小鼠股骨的显微计算机断层扫描显示与正常小鼠不同的小梁结构。EAE小鼠股骨的骨密度和骨体积与组织体积比明显低于正常小鼠。此外，EAE小鼠股骨的小梁连接密度、小梁数和小梁厚度均低于正常小鼠。

与正常小鼠相比，EAE小鼠的小梁间距增强，皮质骨厚度减小。我们还可以在疾病高峰期分离EAE小鼠的大脑和脊柱密码，并通过流感细胞术分析免疫细胞和细胞因子的产生。