实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

目前尚无完全治愈多发性硬化症的方法。我们的方案可有效构建实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，以帮助探索多发性硬化症的治疗方法。本方案的主要优势在于能够从多个角度对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗效果进行更全面的评估。

首先，通过将冻干的肽溶解于 pH 7.4 的无钙无镁离子的无菌预冷 PBS 中，制备髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽乳剂。向一个洁净的 2 毫升微量离心管中加入一颗无菌的 5 毫米钢珠。然后向管中加入 500 微升含 5 毫克/毫升冻干结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂以及 500 微升髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽乳剂。

现在将试管在组织研磨器上振荡10分钟。然后将试管置于冰上冷却10分钟。重复该过程四次，直至形成白色黏稠溶液。

接下来，将百日咳毒素茎部溶液用 pH 7.4 的无钙、无镁灭菌 PBS 稀释 50 倍，以获得每 100 微升含 200 纳克的终浓度。为使所有预先制备的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽乳剂沉淀至管底，使用设备上的脉冲按钮，在 4 摄氏度下离心 2 至 3 秒。用配备 22 号针头的 1 毫升注射器吸取髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽乳剂，并将乳剂转移至一个新的 1 毫升注射器筒内。

将26号针头连接到针筒上，并用封口膜固定连接处。在小鼠背部脊柱两侧皮下分别注射100 µL髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽乳剂。注射后，观察皮下及背部自然形成的结节状肿块。

然后，向同一只小鼠腹腔内注射 100 微升百日咳毒素。准备一个旷场反应箱，并设置视频分析系统以记录小鼠的运动行为。实验前清洁反应箱时，将 70% 乙醇喷洒在整个区域，并用干净的纸巾擦拭。

接下来，将一只小鼠放入反应室的角落。开始拍摄时，点击视频记录系统菜单栏中的“开始采集”按钮，并记录时间。在测试房间内保持安静，让小鼠自由活动五分钟。

然后停止录制并保存视频。将小鼠放回其笼子中。接着用70%乙醇清洁测试区域，并继续进行下一只小鼠的实验。

将安乐死的小鼠平放在解剖托盘上并固定四肢。用镊子夹住小鼠后肢的皮肤，用剪刀切开皮肤和肌肉。接着，小心使用剪刀将股骨与胫骨及髋骨分离。

用剪刀去除附着在股骨上的肌肉。然后将股骨置于室温的70%乙醇中。本研究评估了髓鞘少突胶质细胞糖蛋白来源肽段诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的能力。

注射该肽段的小鼠出现进行性体重下降。在注射六至九天后，小鼠出现EAE症状，并在14至16天达到高峰。旷场实验的轨迹图显示，EAE会改变小鼠正常的探索行为。

与正常小鼠相比，EAE小鼠在疾病早期、高峰期和缓解期的活动距离显著缩短。EAE小鼠在疾病高峰期和缓解期的活动持续时间也显著减少。此外，在这三个阶段中，EAE小鼠在中心区域的移动距离和停留时间均显著减少。

对患实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠股骨进行的显微计算机断层扫描显示，其小梁骨结构与正常小鼠不同。EAE小鼠股骨的骨矿物密度和骨体积/组织体积比均显著低于正常小鼠。此外，EAE小鼠股骨的小梁连接密度、小梁数量和小梁厚度也低于正常小鼠。

与正常小鼠相比，EAE 小鼠的骨小梁间距增大，皮质骨厚度减少。我们还可以在疾病高峰期分离 EAE 小鼠的脑和脊髓组织，通过流式细胞术分析免疫细胞和细胞因子的产生情况。