Name: 破碎散装水凝胶并加工成颗粒状水凝胶，用于生物医学应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习挤压破碎法制备微凝胶并将其加工为可注射颗粒水凝胶的技术。该方法成本低、适应性强，适用于生物医学工程中的3D生物打印和组织修复应用。

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本工作由美国国家科学基金会通过宾夕法尼亚大学MRSEC项目（DMR-1720530）和研究生研究奖学金（授予V.G.M.和M.E.P.）以及美国国立卫生研究院（R01AR077362，授予J.A.B.）资助。

作者没有相互竞争的经济利益。

本文描述了利用挤出破碎法制备微凝胶颗粒，并通过离心或真空驱动过滤进行堆积以形成颗粒状水凝胶的方法。与其他微凝胶制备方法（如微流控技术、批量乳化法、电喷雾法、光刻技术）相比，挤出破碎法具有制备速度快、成本低、易于放大，并且适用于多种水凝胶体系的优点。此外，该方案重复性高，批次间差异极小，这一点已在先前的研究中得到表征39。
本方案采用降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA），通过光介导的硫醇-烯反应制备块状水凝胶。NorHA 的合成详细步骤在其他文献中有描述38。然而，若能在注射器筒内形成块状水凝胶，则本文所述方法可适用于多种水凝胶化学体系来制备碎片化微凝胶。了解块状水凝胶的力学性能（例如压缩模量）也很重要。本方案中使用的块状水凝胶其整体压缩模量约为 30 kPa39。压缩模量更高的块状水凝胶在碎片化步骤中需要更大的挤出力，可能导致堵塞加剧或注射器过压；因此建议使用压缩模量低于 80 kPa 的水凝胶。此外，压缩模量低于 10 kPa 的块状水凝...

颗粒状水凝胶是通过水凝胶颗粒（即微凝胶）的堆积制备而成，是一类具有多种优异性能的生物材料，在生物医学应用中展现出广阔前景1,2,3。由于其颗粒结构，颗粒状水凝胶具有剪切稀化和自愈合特性，因此可被用作挤出式打印（生物）墨水、嵌入式打印的颗粒支撑材料以及可注射治疗剂4,5,6,7,8,9。此外，微凝胶之间的孔隙形成了微尺度孔隙结构，有利于细胞迁移和分子扩散8,10,11。同时，可将多种微凝胶群体组合成单一配方，以增强材料的可调控性和功能多样性8,10,12,13。这些重要特性推动了近年来颗粒状水凝胶研发的迅速发展。
目前有多种方法可用于制备微凝胶以构建颗粒状水凝胶，每种方法均有其优缺点。例如，微凝胶通常通过水包油乳液体系制备，包括使用液滴微流控技术4,11,13,14,15,16,17、批量乳化法7,18,19,20,21,22或电喷法6,23,24,25。这些方法可生成球形微凝胶，其直径具有均一性（微流控法）或呈多分散性（批量乳化法、电喷法）。然而，这些水包油乳液制备方法存在一些局限性，包括可能产量较低、需要低黏度的水凝胶前体溶液，以及设备搭建成本高、资源消耗大。此外，这些方案可能需使用苛刻的油相和表面活性剂，必须通过额外的洗涤步骤将其从微凝胶中去除，从而增加工艺复杂性，并且在许多实验室中难以实现无菌条件下的转化，限制了其在生物医学应用中的推广。(光刻)技术可在无需水包油乳液的情况下使用，通过模具或光掩模控制水凝胶前体溶液的固化过程来制备微凝胶1,26,27。与微流控技术类似，这些方法的生产通量也可能受限，当需要大量制备时，这成为一个主要挑战。
作为这些方法的替代，已采用对整体水凝胶进行机械破碎来制备尺寸不规则的微凝胶19,28,29,30,31,32。例如，可先预先形成整体水凝胶，再使其通过筛网或滤网以产生破碎的微凝胶，该过程甚至已在含有细胞的微凝胶丝中实现33,34。整体水凝胶也可通过机械破坏的方式加工成微凝胶，所用技术包括使用研钵和研杵研磨，或使用商用搅拌机处理35,36,37。此外，也有研究在水凝胶形成过程中施加机械搅动以制备破碎微凝胶（即流体凝胶）31。
本文所述方法在这些机械破碎技术的基础上进行了拓展，提出了一种利用挤出破碎法制备微凝胶的简单方法，并以光交联透明质酸（HA）水凝胶为例进行说明。挤出破碎法仅需使用注射器和针头，即可低成本、高通量且易于放大地制备破碎微凝胶，适用于多种类型的水凝胶19,32。此外，本文还介绍了将这些破碎微凝胶组装成颗粒状水凝胶的方法，可通过离心（低密度填充）或真空驱动过滤（高密度填充）实现。最后，探讨了此类破碎颗粒状水凝胶作为挤出式打印墨水的应用。本实验方案的目标是介绍一系列简便的方法，这些方法可适用于多种水凝胶体系，几乎任何对颗粒状水凝胶感兴趣的研究实验室均可实施。

<table><tbody><tr><td>15 mL 塑料锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>30 G NT 高级系列分配吸头</td><td>Jensen Global</td><td>JG30-0.5HPX</td><td>此处列出的目录编号适用于 30 G、0.5&quot; 针头。提供多种规格。</td></tr><tr><td>BD 带鲁尔锁扣头的一次性注射器（3 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td>此处列出的目录编号适用于 3 mL 注射器。提供多种规格（14-823-XXX）。</td></tr><tr><td>黑色文件夹</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于注射器和分配设备的一次性探针针头（18 G，0.5&quot;）</td><td>Grainger</td><td>5FVH5</td><td>此处列出的目录编号适用于 18 G、0.5&quot; 针头。提供多种规格。</td></tr><tr><td>用于注射器和分配设备的一次性探针针头（23 G，0.5&quot;）</td><td>Grainger</td><td>5FVJ3</td><td></td></tr><tr><td>用于注射器和分配设备的一次性探针针头（27 G，1.5&quot;）</td><td>Grainger</td><td>5FVL0</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190-250</td><td>此处列出的目录编号适用于每箱 10 瓶，每瓶 500 mL 的包装。</td></tr><tr><td>Durapore 膜滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光或共聚焦显微镜</td><td>多家供应商</td><td></td><td>用于观察微凝胶和颗粒状水凝胶</td></tr><tr><td>Eppendorf 带卡扣盖的微量离心安全锁管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>挤出式打印机</td><td>定制设备</td><td></td><td>可使用其他挤出式打印机，例如市售的 BIOX。</td></tr><tr><td>滤器接头</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-888-107</td><td>此处列出的目录编号适用于多种尺寸的套装。提供多种规格（05-888-XXX）。</td></tr><tr><td>抽滤瓶</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素-葡聚糖（2 MDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52471</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&quot;分析颗粒&quot; 信息链接：https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html</td></tr><tr><td>笔记本电脑</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁扣头帽</td><td>Integrated Dispensing Solutions</td><td>9991329</td><td></td></tr><tr><td>用于舀取的金属刮刀</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>多家供应商</td><td></td><td>转速可达 18,000 × g</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>可使用其他程序，例如 Google Sheets。</td></tr><tr><td>OmniCure S2000 点式紫外光固化系统</td><td>Excelitas Technologies</td><td>S2000</td><td>如需要，可使用不同的光照系统来制备块状水凝胶。</td></tr><tr><td>带固定穿孔板的瓷质布氏漏斗</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB966C</td><td>此处列出的目录编号适用于直径为 56 mm 的穿孔板。提供多种规格。</td></tr><tr><td>辐射计</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repetier Host</td><td>Hot-World GmbH &amp; Co. KG</td><td></td><td>3D 打印软件</td></tr><tr><td>螺杆式挤出打印机</td><td>多家供应商</td><td></td><td>本研究使用了经过定制改装的 3D FDM 打印机（Velleman K8200）。存在多种替代方案。</td></tr><tr><td>Solidworks/CAD 软件</td><td>Dassault Syst&amp;egrave;mes SolidWorks Corporation</td><td></td><td>可使用其他程序，例如 Blender 或 TinkerCAD。</td></tr><tr><td>连接抽滤瓶与真空管线的管路</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外光防护眼镜（即安全护目镜）</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

将块状水凝胶破碎并加工成颗粒状水凝胶用于生物医学应用

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

颗粒状水凝胶是由水凝胶微粒（即&#34;微凝胶&#34;）堆积而成的聚集体。在生物材料领域，颗粒状水凝胶具有多种优势特性，包括可注射性、微尺度孔隙结构，以及通过混合不同微凝胶群体实现性能调控的能力。目前制备微凝胶的方法通常依赖于水包油乳液技术（如微流控、批量乳化、电喷雾）或光刻技术，这些方法可能对资源和成本要求较高，且与许多水凝胶材料不兼容。本文详细描述了一种简单而高效的方法，通过挤出破碎法制备微凝胶，并进一步将其加工成适用于生物医学应用（例如3D打印油墨）的颗粒状水凝胶。首先，将块状水凝胶（以光交联透明质酸（HA）为例）依次通过一系列直径逐渐减小的针头进行挤出，从而形成破碎的微凝胶。该微凝胶制备技术具有快速、低成本和高度可扩展的优点。文中还介绍了通过离心和真空驱动过滤将微凝胶堆积形成颗粒状水凝胶的方法，并可选择性地进行后续交联以增强水凝胶的稳定性。最后，展示了由破碎微凝胶制备的颗粒状水凝胶作为挤出式打印油墨的应用。尽管本文示例采用光交联HA进行3D打印，但该方法可轻松适配于多种类型的水凝胶及广泛的生物医学应用。

这些方案的代表性结果如图3和图6所示。挤出破碎法产生的微凝胶呈锯齿状多边形，直径范围为10–300 µm（图3）。此外，圆形度范围为0.2（非圆形）至近1（完美圆形），长径比范围为1–3（图3）。这些参数描述了破碎过程所形成的不规则且边缘锯齿状的微凝胶形态。
通过离心或真空驱动过滤紧密堆积后，所形成的颗粒状水凝胶具有剪切稀化和自愈合特性，如先前的研究39所述。此外，这种破碎的颗粒状水凝胶作为可注射水凝胶，表现出高形状保真度和机械完整性，如图6中挤出打印出的高度为2 cm的空心圆柱体所示。采用这些简单且经济高效的方法制备的破碎颗粒状水凝胶，适用于多种生物医学应用，包括可注射治疗剂和3D打印油墨。
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本研究介绍了一种简单、可调且低成本的微凝胶制备方法，该方法基于挤出破碎技术，可将微凝胶加工成可注射的颗粒状水凝胶，并进一步将这些颗粒状水凝胶用作生物医学应用中的挤出式打印墨水。

颗粒状水凝胶是由水凝胶微粒（即“微凝胶”）紧密堆积形成的聚集体。在生物材料领域，颗粒状水凝胶具有……

颗粒状水凝胶是一类具有多种优势特性的新型生物材料。我们希望通过分享这些方法，能够促进颗粒状水凝胶在生物医学应用中的普及与创新。该技术操作简单、成本低廉，可轻松适配多种化学体系，几乎可在任何实验室中实施。用3毫升注射器吸取水凝胶前体溶液。取下空的3毫升注射器后端的活塞，并在注射器筒前端装上尖端帽。使用1,000微升移液器将水凝胶前体溶液转移至带有尖端帽的注射器筒中。一手握住装有水凝胶前体溶液的注射器筒，针头帽朝下，注射器筒的开口端朝上。将注射器活塞推回至注射器筒后端开口处。轻轻将活塞推入筒内，直至其刚好密封注射器筒后端的开口，同时小心地将活塞与注射器筒保持在一起，确保注射器筒后端被活塞完全密封。将注射器倒置，使活塞朝下，针帽朝上。取下针帽，轻轻推动活塞进入注射器筒内，直至完全排出注射器内的空气。重新将针帽安装回注射器上。确保将水凝胶前体溶液装入带有针帽的3毫升注射器中。在打开紫外灯之前，务必采取适当的个人防护装备和安全措施。将装有水凝胶前体溶液的3毫升注射器置于紫外点固化灯下，照射所需时间，以实现完全的光交联。关闭紫外灯并取出注射器。确保水凝胶已在注射器内完成光交联。从一个空的3毫升注射器后端取下活塞。将针帽固定到鲁尔锁接头上。取下装有光交联块状水凝胶的注射器上的针帽。将水凝胶注射器顶端与空注射器筒管开口对齐。将块状水凝胶通过注射器开口推入空注射器的筒体内。手持装有挤出水凝胶的注射器，使针头端朝下，筒体开口朝上。使用1,000微升移液器，向注射器筒体内加入1.5微升磷酸盐缓冲液（PBS）。将注射器活塞与筒管开口对齐，轻轻推入活塞，直至形成密封。将注射器倒置，使活塞朝下，针帽朝上，注意用手固定活塞和筒管，防止水凝胶或 PBS 泄漏。反复倒置多次，使碎片化的水凝胶与加入的 PBS 充分混合。将注射器竖直握持，使针头帽朝上，活塞朝下。取下针头帽。非常缓慢地向上推动活塞，以排出注射器内部的任何空气。通过一系列针头挤出碎片化的水凝胶溶液，以制备碎片化微凝胶。将一个钝头18号针头固定在装有碎片化水凝胶和PBS的注射器顶端。从一个新的3毫升注射器中取出活塞，并将针头帽固定在空的注射器筒上。将破碎的水凝胶溶液通过18号针头挤入空注射器筒的尾部。将空注射器和针头丢弃至合适的锐器废弃物容器中。依次使用23号、27号和30号针头重复挤出水凝胶溶液的操作。在最后一次挤出步骤中，将破碎的微凝胶溶液挤入微量离心管中。洗涤并分离破碎的微凝胶悬浮液。使用微量离心机，在 5,000 ×g 条件下离心 5 分钟，使破碎的微凝胶溶液沉淀。使用移液器吸去上清液。向每个含有微凝胶碎片的微量离心管中加入1毫升PBS，涡旋振荡5至10秒。取20微升微凝胶碎片悬液与180微升PBS混合，制备稀释的微凝胶碎片悬液。涡旋振荡以充分混匀。取50 µL稀释后的碎片化微凝胶悬浮液转移至玻璃显微镜载玻片上。使用落射荧光显微镜在4倍或10倍放大倍数下获取荧光标记微凝胶的图像。使用真空驱动过滤法使微凝胶碎片化。组装并测试真空驱动过滤装置。将布氏漏斗固定在过滤瓶内。使用导管将抽滤瓶连接至真空管路。在布氏漏斗杯中放置一张膜过滤器。通过打开旋塞阀启动真空管路。通过将约0.5毫升的PBS移液至膜过滤器上，测试连接是否正常，观察PBS是否全部通过滤膜并收集在滤瓶底部。开启真空管路并确保完全密封后，涡旋振荡破碎的微凝胶溶液。使用1,000微升移液器将破碎的微凝胶溶液转移至膜过滤器上。等待约 30 秒，使真空将 PBS 从微凝胶溶液中抽出。关闭真空管路。取一支新的 3 毫升注射器，取出活塞。使用金属刮刀从滤膜上刮取碎片状颗粒水凝胶，并将其转移至空注射器筒后部。将活塞重新插入注射器中。将碎片状颗粒水凝胶装入注射器，即可使用。取下针头帽，更换为选定的针头。将注射器装入选定的打印平台中。将规划阶段准备好的G代码文件载入3D打印软件中。转至打印预览面板并点击打印。打印沉积完成后，立即用紫外光照射碎片化的颗粒水凝胶结构，以实现光交联和稳定化。挤出破碎法可产生具有锯齿状多边形形态的微凝胶，其直径范围为10至300微米。圆形度范围从0.2到接近1，而长宽比范围从1到3。这些参数描述了由破碎过程形成的不规则且呈锯齿状的微凝胶形态。当通过离心或真空驱动过滤方式紧密堆积时，所形成的颗粒状水凝胶具有剪切稀化和自愈合特性。这种碎片化的颗粒水凝胶具有高形状保真度和机械完整性，适用于可注射水凝胶。除了将碎片化颗粒水凝胶用于3D打印外，这些系统还可作为体外细胞培养平台，以及用于组织修复和药物递送的可注射系统。这些简单且低成本的方法使更多研究人员能够受益于颗粒水凝胶生物材料的优势，从而促进颗粒水凝胶制备技术的普及，并推动生物材料领域的创新。

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破碎散装水凝胶并加工成颗粒状水凝胶，用于生物医学应用

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明胶甲基丙烯酰基颗粒水凝胶支架：高通量微凝胶制备、冻干、化学组装与三维生物打印

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将无细胞蛋白质合成反应嵌入宏观水凝胶的方法

本文介绍了一种用于定量评估细胞在颗粒状水凝胶内部及其界面处三维迁移的实验方案。...

量化细胞在颗粒状水凝胶生物材料内部及向其内部的三维迁移

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