Name: 使用数字液滴聚合酶链反应测量单细胞线粒体DNA拷贝数和异质性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习使用数字液滴聚合酶链反应技术测量单细胞线粒体DNA拷贝数及异质性水平。该方法适用于线粒体功能与突变研究，为细胞生物学和神经科学研究提供精确的单细胞分析工具。

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感谢L. Bozhilova博士在液滴生成PCR数据统计分析方面的建议。感谢H. Zhang博士提供用于生成数据的卵母细胞。 图&#160;3C 和 图&#160;4B本工作由SPB在剑桥大学医学研究委员会线粒体生物学单元（MC_UU_00015/9）完成，并由以下机构资助&#160;由PFC持有的惠康信托主要研究奖学金（212219/Z/18/Z）。

所有实验均遵循ARRIVE指南，并经剑桥大学动物福利伦理审查委员会（AWERB）批准。
注意：在进行液滴生成前的所有样品制备步骤必须在洁净的PCR前工作区进行，条件允许时应尽量在紫外灭菌的生物安全柜中操作。本方案中所描述的实验使用特定的液滴生成PCR设备（见材料表），尽管该通用方法可能适用于其他系统，但仍建议参考设备制造商提供的指南，确认引物/探针浓度、PCR扩增循环条件等参数，因为这些参数可能与本文所述存在差异。本研究所用的细胞系或原代细胞如下：人HeLa细胞（商业获取）、人HEK 293T细胞（商业获取）、原代人皮肤成纤维细胞（来自纽卡斯尔生物样本库）、人细胞杂交体（野生型及ΔH2.1缺失型15，由迈阿密大学C. Moraes提供）、小鼠胚胎成纤维细胞（永生化，来自C57Bl/6小鼠，由纽卡斯尔大学J. Stewart提供）、小鼠原始生殖细胞（来自C57Bl/6小鼠胚胎）以及小鼠MII期卵母细胞（来自成年雌性C57Bl/6小鼠）。所有培养的细胞均在含10%胎牛血清的高糖（4.5 g/L）DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。本研究所用的小鼠原代细胞来源于根据英国《动物（科学程序）法案1986》在英国内政部项目许可证P6C97520A下饲养的实验动物。
1. 设计并合成靶向目的DNA序列的引物和探针组合
注意：也可使用 dsDNA 结合染料代替扩增子特异性探针进行液滴生成 PCR。
<ol>
	<li>根据系统制造商提供的指南设计引物和探针序列。适用于人16,17和小鼠18单细胞mtDNA拷贝数/缺失异质性的已验证引物和探针序列见表1。选择替代靶序列时，请考虑以下几点。
	<ol>
		<li>在一个PCR检测中可多重扩增两对引物/探针组合，但需确保两个检测分别使用FAM标记探针和HEX标记探针，以便液滴读取仪能够区分靶扩增子。本方案采用双通道探针检测。通过精心的实验设计，可将多重检测扩展至四个靶标，而其他平台还可实现更高维度的多重检测。</li>
		<li>当多重扩增针对不同mtDNA序列的引物/探针组合时，需确保两对引物产生的扩增子不相互重叠。</li>
		<li>在检测携带mtDNA缺失样本的异质性时，应确保一个靶扩增子位于预期缺失区域内，另一个靶扩增子位于预期缺失区域外。 
		注意：替代检测的最佳PCR循环条件可能与第5.1步中所述条件不同；有关检测优化的更多细节，请参见“讨论”部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单细胞DNA的分离
注意：该方法也可用于最多100个细胞的小量批量样本。
<ol>
	<li>使用适当的方法（如荧光激活细胞分选技术（FACS）19 或激光捕获显微切割技术20）将单个细胞收集到合适容器（例如96孔板）中，并尽可能减少收集体积。在单细胞分离前或过程中使用细胞活力染料，可最大限度降低死细胞被分离的可能性。如需，可直接将单个细胞分选至裂解缓冲液中，并在分析前于 -80 °C 保存（最长6个月）。</li>
	<li>用少量（&lt;10 µL）合适的裂解缓冲液对细胞进行裂解（本研究中所用缓冲液详见步骤2.2.1）。 
	注意：本研究中所有数据均来自单细胞裂解液或20个细胞的混合样本（样本量在图注中明确说明）。在液滴生成PCR方案的液滴生成步骤中，样品中去垢剂的存在会显著影响油包水乳液的高效形成；因此，建议在处理实验样本前，验证所有细胞裂解缓冲液在目标加入浓度下与液滴生成的兼容性，并使用尽可能小的裂解缓冲液体积。以下裂解方案对液滴生成效率的影响最小。
	<ol>
		<li>配制含有50 mM Tris-HCl（pH 8.3）、1% TWEEN-20 和 200 µg/mL 蛋白酶K的裂解缓冲液。</li>
		<li>向每个样本中加入2.5 µL裂解缓冲液，用粘性封板膜密封板孔，然后在4 °C下以1,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>将样本置于热循环仪中，在37 °C孵育30分钟，同时将加热盖温度设为105 °C，以防止液体在板盖上冷凝。</li>
		<li>向每个样本中加入7.5 µL无核酸酶水，使最终样本体积达到10 µL，重新密封板孔，然后在4 °C下以1,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>在热循环仪中于80 °C孵育15分钟（加热盖温度设为105 °C），以灭活蛋白酶K。</li>
		<li>在4 °C下以1,000 × g离心1分钟，随后将样本置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续进行下文步骤3。 
	注意：细胞裂解液可在 -20 °C保存，待后续进行步骤3；但尽可能使用新鲜提取的DNA，以避免冻融循环导致DNA降解的风险。</li>
</ol>
3. 样品制备
注意：每个检测板上必须包含样本的技术重复以及无模板对照（NTCs），以确保结果的准确性。微滴生成PCR检测的动态范围最高可达每反应120,000个目标扩增子拷贝。对于单细胞或少量细胞群体裂解液，通常无需稀释，可直接将裂解液加入反应体系中用于检测线粒体DNA拷贝数（例如，10 µL的裂解液样本可分装，取3 µL直接加入每个检测反应中，进行三重复实验）。然而，若使用线粒体DNA拷贝数极高的细胞（如卵母细胞）或细胞数量较多（如50–100个）的未稀释裂解液，则可能超出该检测的动态范围。在此类情况下，需先进行初步的系列稀释，以确定适合该特定细胞类型或细胞数量的稀释倍数，避免检测信号饱和（详见代表性结果部分的进一步说明）。
<ol>
	<li>使用前将所有试剂在冰上解冻，涡旋混匀，并短暂离心。</li>
	<li>在冰上配制主混合液（不含样本DNA），具体成分见（表2）。 
	注意：若仅检测一个目标扩增子，则每份样本需额外加入2.55 µL无核酸酶水，以达到22 µL的终体积。主混合液的配制量应涵盖所有样本及NTC的数量，并额外预留足够体积以补偿液滴生成PCR板中可能需要的“空白”孔（见下一步）。</li>
	<li>短暂涡旋混匀已配制的主混合液，并将所需体积（22 µL减去DNA加入量）分装至液滴生成PCR 96孔板的各孔中。将样本按完整列排布；对于不完整的列，其余空孔均用主混合液填充，并作为NTC使用。</li>
	<li>向各样本孔中加入待测DNA，向NTC孔中加入无核酸酶水或洗脱缓冲液，使每孔总体积达到22 µL。</li>
	<li>用粘性板密封膜密封板孔，置于摇床上以2,000 rpm振荡1分钟，随后在4 °C下以1,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>将板置于冰上，进入第4步。 
	注意：制备好的板可在冰上避光保存较短时间（例如1–2小时），再进行液滴生成步骤。</li>
</ol>
4. 微滴的生成
注意：本节中所提及的液滴发生装置仪器台的示意图，请参见图1A。
<ol>
	<li>打开液滴生成仪电源。</li>
	<li>检查仪器载台 E 位置是否已装载液滴生成油瓶。如系统提示，请按照屏幕上的说明更换油瓶。</li>
	<li>在触摸屏上点击配置样本板。选择样本板上所有含有样本或空白对照的列。 
	注意：在此步骤中输入板名称和实验详细信息为可选操作，非继续设置实验所必需。</li>
	<li>点击确定以确认板配置；仪器载台上将亮起橙色指示灯，提示需装载耗材的位置。</li>
	<li>将液滴生成 cartridge 装载至仪器载台 B 位置，直至所有指示灯变为绿色。</li>
	<li>将空的吸头废液槽放置于仪器载台 C 位置。</li>
	<li>取下滤芯吸头盒的盖子，并将其装载至仪器载台 D 位置，直至所有指示灯变为绿色。</li>
	<li>从样本板上移除粘性板封膜，并将其装载至仪器载台 F 位置，直至指示灯变为绿色。</li>
	<li>将一个空的液滴收集 96 孔板放入预冷至 -20 °C 的冷却块中，并将其装载至仪器载台 G 位置，直至指示灯变为绿色。</li>
	<li>在仪器触摸屏上点击开始液滴生成。</li>
	<li>在仪器触摸屏上点击开始运行。仪器盖将自动关闭。初始化完成后，触摸屏将显示液滴生成完成所需的剩余时间。</li>
	<li>液滴生成完成后，目视检查样本收集板，确认每个孔中油相上方均存在液滴乳化层（图 1B）。 
	注意：若未观察到液滴乳化层，请勿继续实验，并检查实验流程前期步骤中可能出现的错误。</li>
	<li>清除仪器载台上的已使用耗材，并清空吸头废液槽。</li>
	<li>打开板封仪电源，将温度设置为 180 °C，封膜时间为 5 秒，并等待仪器达到工作温度。</li>
	<li>将样本收集板放入板封仪的板架中，并在板上覆盖一张新的铝箔封膜，确保红色标记朝上。注意避免触碰铝箔封膜的底面。 
	注意：板架应存放于室温（RT）环境中，仅在需要进行封膜操作时才放入板封仪抽屉，以防止热量传递至样本收集板。</li>
	<li>当板封仪达到工作温度后，按下仪器触摸屏上的弹出按钮；抽屉将自动打开。</li>
	<li>将板架放入板封仪抽屉中，然后按下封膜。抽屉将自动关闭，并在封膜完成后再次打开。</li>
	<li>将已封膜的板放回冷却块中，关闭板封仪，并立即进入第 5 步。 
	注意：在此阶段，液滴处于不稳定状态，因此请确保在液滴生成结束后的 1 小时内开始 PCR 步骤。</li>
</ol>
5. PCR
<ol>
	<li>将密封的液滴收集板放入配备96深孔模块的PCR仪中，并运行表3中描述的热循环程序。 
	注意：设置加热盖温度为105 °C，样品体积为40 µL。变性及退火/延伸步骤的温度升降速率必须为2 °C/s，以确保油相有足够时间达到目标温度。</li>
	<li>继续进行第6步。 
	注意：热循环程序完成后，液滴更加稳定，该板可在4 °C下保存最多4天，再进行下一步操作。</li>
</ol>
6. 液滴读取
<ol>
	<li>打开液滴读取仪和连接的计算机电源。</li>
	<li>检查液滴读取仪油瓶和液滴读取仪废液瓶中的液体量，必要时分别进行补充或清空。</li>
	<li>将含有PCR后样品的板放入液滴读取仪的板架中，盖上盖子，并用黑色锁扣固定。不要移除样品板上的铝箔盖。</li>
	<li>按压 打开/关闭 打开液滴读取仪盖子上的按钮。</li>
	<li>将装有样本板的液滴读取板架载入读取室，并牢固地定位到磁性底座上。</li>
	<li>按下液滴读取仪盖子上的开/关按钮以关闭盖子。</li>
	<li>打开分析软件界面，选择 添加培养板 标签并按下述步骤准备新的样品板：
	<ol>
		<li>点击 添加培养板 然后 配置培养板. </li>
		<li>在 板信息 tab 键入 a 板名称，选择 探针用预混液（不含dUTP） 来自 Supermix 下拉菜单并输入文件名 保存数据文件为.</li>
		<li>在 孔板选择 标签突出显示待分析的孔，然后单击 选择包含的孔. 
		注意：步骤 6.7.4 – 6.7.7 为可选步骤。</li>
		<li>在 井信息 标签页中，选择需要注释的孔。 
		注意：请参阅 图1D 例如 井信息 标签式界面</li>
		<li>选择 直接定量（DQ） 来自 实验类型 下拉菜单，填充 样本描述, 样本类型 &amp; 靶标名称 盒，并添加 孔板注释 和/或 培养皿记录 根据需要。</li>
		<li>点击 应用. 字段中的信息将应用于所选的孔。</li>
		<li>重复步骤 6.7.4–6.7.6，直至所有样品孔均已完成注释。 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>当板孔布局完成后，点击 开始运行.</li>
	<li>当运行结束后，丢弃空的样品板，并在必要时清空液滴读取仪的废液瓶。 </li>
	<li>进入第7步。</li>
</ol>
7. 结果分析
注意：液滴读取仪会测量样本中每个液滴在FAM和HEX通道的荧光强度。在成功的检测中，每个探针对应的液滴可分为两类：阴性（表示液滴中无目标物）或阳性（表示液滴中存在目标物）。在分析样本前，确保每孔均含有 &gt;10,000 个液滴，并且每个通道中均出现明显分离的低荧光（阴性）和高荧光（阳性）两个群体图2A).
<ol>
	<li>选择 数据分析 选项卡，并从 我的数据文件 菜单中打开待分析的文件。</li>
	<li>对于单色实验，请点击 1D 振幅 选项卡；对于双色实验，请点击 2D 振幅 选项卡。</li>
	<li>为每个通道设置荧光阈值，以区分阳性与阴性液滴。分析软件将尝试对每个样本和每个通道自动设置阈值，但如果自动阈值设置失败或明显不准确，则需按以下步骤手动设置阈值：
	<ol>
		<li>选择需要设置阈值的孔。</li>
		<li>在振幅图上阳性与阴性群体之间清晰的空白区域，使用 阈值线模式 工具手动设置阈值。在2D视图中设置手动阈值时，应确保十字准线位置适当，使四类液滴群体（双阴性、FAM单阳性、HEX单阳性、双阳性）被清晰分离开。 
		注意：阈值可逐孔设置，也可一次性应用于多个孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有样本完成阈值设置后，点击 数据表 选项卡，点击 导入/导出，选择 将可见数据导出为CSV，输入合适的文件名后点击 保存，以.csv格式导出结果用于进一步分析。</li>
	<li>按下式计算初始样本中的mtDNA拷贝数： 
	拷贝数 = mtDNA靶标浓度 × 22 × 1/总裂解液上样比例 
	注意：若使用两个线粒体探针，则在计算前应取两个靶标浓度的平均值。对于含有多个细胞的样本，需将拷贝数除以样本中的细胞数，以获得每个细胞的拷贝数。计算初始样本的绝对拷贝数时，必须使用“浓度”值（即每微升拷贝数）乘以初始样本体积22 µL，而不能使用.csv文件中计算出的“每20 µL拷贝数”值，因为必须计入液滴生成器所需的2 µL余量中残留的mtDNA拷贝。</li>
	<li>对于携带异质性mtDNA缺失的细胞，应使用位于缺失区域外的mtDNA靶标结果来计算拷贝数（即在缺失型和野生型mtDNA分子中均存在的靶标）。缺失异质性比例通过位于缺失区域内和区域外的两个靶标浓度计算，公式如下： 
	<img alt="缺失mtDNA分子百分比公式；遗传分析中的浓度比方程。" src="/files/ftp_upload/63870/63870eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"></li>
</ol>

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</ol>

无利益冲突需要披露。

本方案不仅适用于上述细胞类型和物种，还可广泛应用于其他多种细胞类型和物种。然而，在采用未经验证的引物/探针组合设计新检测方法时，必须对实验条件进行仔细优化，以确保方法的准确性和重复性。在处理单细胞时，至关重要的是确保样本采集尽可能准确（例如，使用严格的单细胞参数通过FACS分选细胞），以保证所得结果真实反映单个细胞的情况；同时，所有前期准备工作均需在洁净的PCR前处理区域进行，以降低污染风险。高效的细胞裂解对于确保线粒体DNA拷贝能够成功分配到独立的微滴中也极为关键；但需注意，使用较高浓度的去垢剂可能会干扰微滴的形成，因此应在裂解效率与微滴稳定性之间取得平衡。
由于检测设计和裂解步骤是实验方案中最关键的部分，因此这些步骤最有可能需要进行问题排查。如果引物/探针组合最初未能产生明显分离的阳性和阴性液滴群，可通过优化PCR程序中的退火/延伸温度来改善其性能。步骤5.1中建议的58 °C温度已针对（表1）中的引物/探针组合进行了验证；然而，最佳温度可能在55–65 °C之间变化，因此可在该温度范围内进行梯度PCR，以确定新引物/探针组合的最适温度。如果该...

哺乳动物线粒体（mt）DNA 是一种小型（约 16.5 Kb）环状 DNA 基因组，位于线粒体基质中，编码 37 个基因，包括两个 rRNA、22 个 tRNA 和 13 个蛋白质编码基因1。与每个细胞中每个基因仅有一个（单倍体）或两个（二倍体）拷贝的核基因组不同，mtDNA 在每个细胞的线粒体中以多个拷贝形式存在，拷贝数范围从几十个（例如成熟精母细胞）到数十万个（例如卵母细胞）2,3。由于这种多拷贝特性，mtDNA 基因组中的突变（可能表现为单核苷酸多态性（SNP）、缺失或重复）在特定细胞中可呈现不同水平，占细胞总 mtDNA 群体的比例可从 0% 到 100% 不等。同一细胞中同时存在野生型和突变型 mtDNA 基因组的现象称为异质性（heteroplasmy），而致病性的异质性 mtDNA 突变是线粒体疾病的主要病因之一，多种常见的神经系统综合征均与潜在的异质性 mtDNA 突变相关4。
导致异质性线粒体DNA突变引发临床疾病的两个关键参数是异质性水平和线粒体DNA拷贝数。许多异质性突变表现出阈值效应，即生化和临床表型仅在某一特定异质性水平之上才会显现，通常约为80%5，并随着异质性水平进一步升高而加重4。然而，还需考虑细胞中线粒体DNA的拷贝数量，因为这会影响在特定异质性水平下存在的野生型（即“健康”）线粒体DNA基因组的数量。在线粒体疾病患者中的研究已凸显了异质性与拷贝数之间相互作用的重要性5,6，Filograna等人最近报道，在一种线粒体疾病小鼠模型中，尽管异质性水平未变，mtDNA拷贝数的增加仍可缓解症状7。
尽管近年来在提高对线粒体DNA异质性所致疾病的发病机制和传播方式的理解方面已取得诸多进展，但大部分研究仍停留在组织水平而非细胞水平，通常通过 bulk 组织活检和血液样本获得的平均组织异质性水平和拷贝数测量值进行比较。一些成熟的技术，例如激光捕获显微切割，可实现细胞水平的测量8,9；然而，近年来高通量单细胞分析方法（即所谓的“单细胞组学”10）迅速发展，迫切需要能够准确在单细胞水平上测定这些关键线粒体DNA参数的方法。
液滴生成PCR方法利用了微流控技术的最新进展，通过在样本DNA中对特定目标扩增子进行PCR扩增，从而改进现有的未知DNA浓度定量方法via PCR扩增样本DNA中的特定目标扩增子11。与qPCR不同——在qPCR中，样本DNA在单一反应体系中扩增，通过PCR产物积累的相对速率作为读数——该方法将初始样本分割成数千个独立的液滴，从而将样本DNA分子分隔到空间上独立的反应体系中12。随后，每个独立液滴中进行PCR反应，仅在含有目标DNA的液滴中积累PCR产物。该反应的结果是一种数字式输出，表现为一组液滴，其中部分液滴含有目标DNA拷贝及扩增的PCR产物，其余则不含目标DNA。利用荧光DNA探针或双链（ds）DNA结合染料，可对含有扩增产物的液滴进行计数，并通过“阳性”与“阴性”液滴的比例计算出初始样本中DNA拷贝的绝对数量。这种绝对定量方式，相较于qPCR获得的相对定量结果，是该方法能够用于单细胞中线粒体DNA（mtDNA）拷贝数和异质性精确测量的关键因素11，近年来已有多个研究利用液滴生成PCR技术实现这一目的13,14。本文介绍了一种用于测定人和小鼠组织来源的单细胞中mtDNA拷贝数及缺失型异质性的方法。

<table><tbody><tr><td>50% 吐温-20 溶液</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>自动液滴生成油&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>1864110</td><td>用于生成油相/液滴乳液的商用油制剂（用于方案步骤 4.1）</td></tr><tr><td>C1000 PCR仪配备深孔反应模块</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>1851197</td><td>配备深孔加热模块的PCR扩增仪，用于细胞裂解（实验步骤2.1.2）和PCR扩增循环（实验步骤5）</td></tr><tr><td>收集板冷却块</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>12002819</td><td>用于液滴生成过程中保持样本低温的冷却块（在方案步骤 4.3 中使用）</td></tr><tr><td>ddPCR 96孔板&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>12001925</td><td>适用于QX200 AutoDG微滴生成仪的96孔板移液器吸头，用于样本制备（方案步骤3.4）和微滴收集（方案步骤4.3）</td></tr><tr><td>ddPCR 微滴读取仪用油&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>1863004</td><td>商用油相制剂，用于液滴读取器（在方案步骤6.1中使用）</td></tr><tr><td>ddPCR探针超级混合液（不含dUTP）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1863023</td><td>用于探针法数字滴落式PCR（ddPCR）实验的商用预混液（用于方案步骤3.3）</td></tr><tr><td>DG32 自动液滴生成器 cartridges&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1864108</td><td>用于QX200 AutoDG液滴生成仪的微流控芯片，以生成油/液滴乳液（用于方案步骤4.3）</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>合格胎牛血清</td></tr><tr><td>铝箔板盖&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>1814040</td><td>用于液滴生成后密封液滴收集板的箔板盖（用于方案步骤 4.6）</td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>表达SV40大T抗原的HEK 293人胚肾细胞系商业化亚克隆</td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>人宫颈上皮样癌细胞</td></tr><tr><td>高糖DMEM</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4.5 g/L D-葡萄糖，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠</td></tr><tr><td>人类细胞杂交系</td><td>迈阿密大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞&amp;nbsp;</td><td>纽卡斯尔大学</td><td>源自C57Bl/6小鼠的永生化细胞</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCR板密封膜</td><td>皮尔斯</td><td>SP-0027</td><td>透明粘性板密封膜，仅在液滴生成前使用（步骤4.6中必须使用铝箔密封膜）</td></tr><tr><td>移液器吸头废弃物收集箱</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1864125</td><td>用于QX200 AutoDG液滴生成仪中收集废弃吸头的一次性收集盒（在方案步骤4.3中使用）</td></tr><tr><td>AutoDG 系统用移液吸头&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1864120</td><td>专用于QX200 AutoDG液滴生成仪的滤芯吸头（用于方案步骤4.3）</td></tr><tr><td>原代人皮肤成纤维细胞</td><td>纽卡斯尔生物样本库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>引物/探针</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>引物/探针的精确序列取决于具体检测方法。本研究中使用的引物和探针序列见表1。</td></tr><tr><td>蛋白酶K 20 mg/mL 溶液</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜机</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>1814000</td><td>在液滴生成后，对数字PCR样本板应用铝箔封膜（用于方案步骤4.6）</td></tr><tr><td>QX Manager 软件</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>12012172</td><td>液滴读取仪设置 &amp;和分析软件（用于方案步骤6） &amp;& 7)</td></tr><tr><td>QX200 AutoDG 微滴生成仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1864101</td><td>自动微流控液滴生成器（用于方案步骤4）</td></tr><tr><td>QX200 微滴读取仪</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>1864003</td><td>液滴读取仪（用于方案步骤6）</td></tr><tr><td>Trizma 预置晶体 pH 8.3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

使用数字微滴聚合酶链式反应测量单细胞线粒体dna拷贝数与异质性

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

哺乳动物线粒体（mt）DNA 是一种小型环状双链线粒体内部 DNA 分子，编码电子传递链的 13 个亚基。与二倍体的细胞核基因组不同，大多数细胞含有更多的 mtDNA 拷贝，拷贝数从少于 100 到超过 200,000 不等，具体数量取决于细胞类型。mtDNA 拷贝数正越来越多地被用作多种与年龄相关的退行性状况和疾病的生物标志物，因此，准确测定 mtDNA 拷贝数正成为科研和诊断领域的重要工具。mtDNA 的突变通常以单核苷酸多态性（SNPs）或缺失的形式出现，这些突变可能存在于细胞内所有 mtDNA 拷贝中（称为同质性），也可能以突变型与野生型（WT）mtDNA 拷贝混合的形式存在（称为异质性）。异质性 mtDNA 突变是临床线粒体病理的主要原因，不仅见于罕见疾病，也越来越多地出现在帕金森病等常见晚发性疾病中。确定细胞中异质性水平是诊断罕见线粒体疾病以及研究线粒体可能参与的常见晚发性疾病的必要步骤。传统上，mtDNA 拷贝数和异质性的测定依赖于基于定量（q）PCR 的检测方法或深度测序。然而，近年来数字滴定 PCR（ddPCR）技术的引入为同时测定这两个参数提供了另一种方法。该技术相较于现有方法具有多项优势，包括能够测定绝对 mtDNA 拷贝数，并具备足够的灵敏度，即使在拷贝数较低的情况下也能对单个细胞进行准确测量。本文提供了一项详细方案，描述使用 ddPCR（下文简称液滴生成 PCR）在单细胞中测定 mtDNA 拷贝数的方法，并可选择性地同时测定存在 mtDNA 缺失的细胞中的异质性水平。本文还讨论了将该方法扩展应用于测定携带 mtDNA SNPs 细胞中异质性的可能性。

液滴生成后，每个孔中油相上层可见一层清晰的不透明液滴悬浮层（图1B）。在进行单细胞实验时，若裂解液中含有去污剂，可能会对液滴的形成产生不利影响。尽管最终样本中仍残留少量TWEEN-20，但采用2.1.2节所述的裂解方案，通常仍可获得超过推荐水平（10,000个）的液滴产量（图1C）。然而，使用其他裂解缓冲液（如RLT Plus缓冲液）时，所形成的液滴数量显著减少（图1C），这可能对拷贝数测量的准确性产生不利影响。
PCR扩增和液滴读取后，每个样本孔所用的各个通道中均会观察到明显分离的阳性和阴性液滴群（图2A），而NTC孔中仅含有阴性液滴。在分析结果时可能遇到的潜在问题包括：
阳性群与阴性群之间缺乏清晰的分离，且在两群之间出现液滴，称为“雨滴”现象（图...

本文介绍了一种用于测定单个细胞中线粒体（mt）DNA绝对拷贝数及mtDNA缺失异质性水平的实验方案。

使用数字微滴聚合酶链式反应测量单细胞线粒体DNA拷贝数与异质性

哺乳动物线粒体（mt）DNA 是一种小型环状双链线粒体内部DNA分子，编码电子传递链复合物中的13个亚基……

本方案可用于准确定量单个细胞中线粒体DNA的拷贝数以及特定类型线粒体DNA突变的水平。以往的方法仅能在包含大量细胞的组织样本中准确进行此类测量。该技术的主要优势在于，我们能够在单个细胞中实现相同的测量。该方法对研究线粒体的科研人员尤为有用，并将在该领域具有广泛的应用前景。有效分离和裂解单个细胞是该技术的关键。具备单细胞分选的前期经验将大有帮助。首先，按照文中所述，在冰上配制不含样本 DNA 的 PCR 主混合液。短暂涡旋振荡后，将配制好的主混合液按所需体积分配至液滴生成用 96 孔 PCR 板的每个孔中，并按完整列排列样本。接着，向不完整列中的任何空孔加入主混合液，作为无模板对照使用。然后向每个孔中加入输入DNA，使每孔总体积达到22微升。用粘性板密封膜密封板孔，置于摇床中以2000转/分钟振荡1分钟。随后在4摄氏度条件下以1000 × g离心1分钟，然后置于冰上。进行液滴生成时，首先确保液滴生成仪已开机，并检查仪器载台的 E 位置是否已装载液滴生成油瓶。然后点击触摸屏上的“配置样本板”。在选中样本板上包含样本或空白对照的所有列后，点击“确定”以确认板的配置。接下来，将液滴生成器 cartridges 加载到仪器平台的 B 位置，直至所有指示灯变为绿色，并将一个空的吸头废液槽放入 C 位置。然后将已移除盖子的滤芯吸头盒加载到仪器载台的 D 位置，直至所有指示灯变为绿色。接着，在将样本板加载到仪器平台的 F 位置之前，先移除其上的粘性密封膜，直至指示灯变为绿色。同时，将一个空的液滴收集 96 孔板放入已预冷至 -20 °C 的冷却块中，并置于 G 位置，直至指示灯变为绿色。在仪器触摸屏上点击“开始液滴生成”，液滴生成仪的盖子将自动关闭。液滴生成完成后，目视检查样品收集板，确认每个孔中油相上方均存在液滴乳化层。接下来，打开封板机电源，将温度设置为180摄氏度，封膜时间为5秒。让仪器升温至工作温度。然后将样本采集板放置在板封仪的板架上，并将新的箔膜密封垫放在板的上方，确保红色线条朝上。当板封仪达到工作温度后，按下仪器触摸屏上的弹出按钮。将板架放入板封仪的抽屉后，按“封板”按钮以关闭抽屉。封板完成后，抽屉将自动打开。取出已封好的板并置于冷区上。然后关闭封板机。进行PCR时，将已密封的液滴收集板放入配备96孔深孔模块的PCR仪中。PCR完成后，打开液滴读取仪及其连接的计算机。将含有PCR后样品的孔板放入液滴读取仪的板架中。在保持样品板上覆有箔膜盖的情况下，将盖子置于板架顶部，并用黑色锁定夹固定。接着，按下开启/关闭按钮以打开液滴读取仪的盖子。然后将装有样本板的液滴读取板架放入读取室，并牢固地放置在磁性底座上。再次按下开/关按钮以关闭盖子。打开分析软件界面。选择“添加板”选项卡，点击“添加板”，然后点击“配置板”。在“板信息”选项卡中，输入板名称，从“Supermix”下拉菜单中选择“Supermix for Probes, No DUTP”，并在“保存数据文件为”下方输入文件名。在“孔选择”选项卡中，选中需要分析的孔，然后点击“包含选定孔”。接着在“孔信息”选项卡中，选择需要注释的孔。从“实验类型”下拉菜单中选择“直接定量”。然后填写样本描述、样本类型和靶标名称，根据需要添加孔注释和/或板注释。然后点击“应用”。完成板配置后，单击“开始运行”。进行结果分析时，选择“数据分析”选项卡，然后从“我的数据文件”菜单中打开要分析的文件。接着，单色实验单击“1D 振幅”选项卡，双色实验单击“2D 振幅”选项卡。接下来，选择需要设定阈值的孔。使用阈值线模式工具，在幅度图上阳性与阴性群体之间的空白区域手动设定阈值，确保十字准线的位置能够清晰区分四个液滴群体。对所有样本设定阈值后，点击数据表选项卡，选择导入/导出，然后选择导出可见数据为CSV，将结果导出为csv文件以供进一步分析。输入合适的文件名，然后点击保存。本方案中使用的 PCR 和液滴读取程序在 fam 和 hex 通道中均显示出明显分离的阳性与阴性液滴群体。此外，还可区分线粒体 DNA 群体中同时对两种探针呈阳性的信号与单细胞裂解液中的信号。该方法还显示，对于线粒体DNA存在缺失的样本，会同时出现双阳性液滴和仅对DNA非缺失区域呈阳性的液滴组成的混合群体。该方法已成功用于多种哺乳动物细胞中每个细胞线粒体DNA拷贝数的计数，包括小鼠卵母细胞和原代小鼠胚胎细胞。此外，在具有高缺失异质性的细胞中，单探针阳性群体的数量明显大于双阳性群体。然而，在低缺失异质性的细胞中，两种群体的大小相似。因此，准确的结果始终能够确保液滴生成已成功完成，并且已使用一维或二维振幅视图适当地设置了阈值。未使用的裂解液可用于其他单细胞检测，例如焦磷酸测序，该技术可检测单核苷酸多态性异质性。该技术的开发使我们能够对单个细胞中的线粒体DNA拷贝数和缺失异质性进行精确测量，而这是以前无法实现的。

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微滴数字聚合酶链式反应：一种生成纳米微滴PCR反应以检测稀有肿瘤突变的方法

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双重数字PCR同时定量双基因标志物

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通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型

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高通量成像法对线粒体DNA合成及分布的定量分析

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利用数字滴液PCR（ddPCR）测定土壤中的微生物生物量

学习使用数字液滴聚合酶链反应技术测量单细胞线粒体DNA拷贝数及异质性水平。该方法适用于线粒体功能与突变研究，为细胞生物学和神经科学研究提供精确的单细胞分析工具。

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