用于无细胞重建的重组隔肽复合物的纯化和质量控制
2022年6月23日
细胞骨架蛋白的体外重建是了解这些蛋白质基本功能特性的重要工具。本文描述了一种纯化和评估重组隔膜复合物质量的方案，重组隔膜复合物在细胞分裂和迁移中起核心作用。
该协议使得纯化高质量的隔膜复合物成为可能，这对于研究隔膜素在细胞中的许多作用至关重要。这种方法的主要优点是合成一个简单的程序，使用Addgene质粒纯化高质量的隔膜素。隔肽由于其许多相互作用而难以在细胞中研究。
硫重构通过在一个简单的系统中研究它们来帮助我们解开这种复杂性。我们建议在一天内进行纯化以防止降解。根据我们的经验，这将增加蛋白质的寿命和质量。
首先，在摇床培养箱中以37摄氏度培养转化的细菌培养物，直到600纳米波长的光密度达到2至3对于未标记的隔膜，或0.6至0.8对于msfGFP或mEGFP标记的隔膜。孵育后，通过将IPTG添加到终浓度为0.5毫摩尔来诱导蛋白质表达，并将表达未标记的隔肽异低聚物的细胞在37摄氏度下孵育3小时，或表达msfGFP标记的异质低聚物的细胞在17摄氏度下孵育过夜。然后在 4， 000 倍 G 下沉淀细胞 20 分钟，温度为 4 摄氏度。
弃去上清液并将沉淀溶解在100毫升裂解缓冲液中以裂解细胞。接下来，使用振幅为 30% 的尖端超声仪对细胞进行超声处理。通过在4摄氏度下以20， 000倍G离心30分钟澄清细胞裂解物并保存上清液。
或者，按照手稿中的说明取样进行变性电泳。对于His标记隔膜的亲和色谱，将预填充的镍琼脂糖高效色谱柱与所有必需的缓冲液平衡。将澄清的上清液下样到色谱柱中，启动色谱系统。
然后用50%HisTrap洗脱缓冲液以每分钟1毫升的流速洗脱隔肽复合物。为了产生250毫摩尔的咪唑浓度，收集0.5毫升级分。现在使用快速蛋白质液相色谱系统监测洗脱液在280纳米处的光吸光度，并选择含有隔肽复合物的馏分。
对于Strep-II标记蛋白的亲和色谱，用隔膜缓冲液平衡预填充的链球菌素琼脂糖高效色谱柱。以每分钟1毫升的速率加载从镍柱中回收的含有隔肽的馏分，然后启动色谱系统。然后洗涤结合的蛋白质，并用100%StrepTrap洗脱缓冲液以每分钟1毫升的流速洗脱隔肽复合物。
为了产生2.5毫摩尔的去硫菌素浓度，收集0.5毫升级分。选择含有隔肽复合物的馏分，如用快速蛋白质液相色谱系统在线监测洗脱液在280纳米处的光学吸光度所示。通过透析去除去硫菌素后，将蛋白质复合物等分到所需的等分试样大小，快速冷冻等分试样，并将其储存在零下80摄氏度。
对于干涉散射显微镜，清洗1.5号载玻片，方法是在超声波清洗机中分别在水，异丙醇和去离子水中超声处理5分钟。用温和的氮气流干燥两个载玻片。然后将一滴7微升的0.01%聚-L-赖氨酸溶液滴放在其中一张载玻片的中心，并将另一张载玻片的中心放在聚-L-赖氨酸液滴的顶部，将两张载玻片正交定向以便于分离。
孵育30秒后，将载玻片浸入装有去离子水的烧杯中一次，然后直接施加水流两次。用氮气流干燥它们，这些载玻片可以在干燥条件下在室温下储存约六周。在实验之前，切一块二乘二、三乘二或三乘三垫圈，并将它们粘在载玻片的聚-L-赖氨酸处理部分，通过将载玻片放在轻型刮水器纸上，避免载玻片和垫圈接触任何脏表面。
现在用移液器吸头按压垫圈，将它们与垫圈上的保护塑料粘在一起。接下来，将隔肽缓冲液加热至室温。解冻手中的蛋白质，然后将它们放在冰上。
然后将带垫圈的载玻片放在含有19微升隔膜缓冲液的商用质量光度法系统上，并使用自动对焦选项聚焦显微镜。使用自动对焦选项使用新设置重新对焦。要创建项目文件夹，请单击"文件"，然后单击"新建项目"，要加载用于存储数据的项目文件夹，请单击"文件"，然后单击"加载项目"。
然后将一微升样品移液到19微升隔膜缓冲液滴中。混合，混合时，避免触摸任何东西以防止载玻片移动。然后通过单击录制6， 000帧视频 记录.
使用制造商的软件分析视频以获得蛋白质质量分布。如果不同隔膜异质低聚物尺寸的峰重叠过多或检测到太多事件，则降低最终隔膜浓度并再次测量。当没有测量足够数量的单个分子时，增加隔肽浓度并再次测量。
对于隔膜分析，制备5X darkSPB和由100%深色隔膜素组成的隔膜混合物，其浓度比隔膜缓冲液中所需的最终浓度高六倍，和1毫摩尔二硫苏糖醇。然后通过混合水，20%5X darkSPB和16.67%隔肽混合物，按此特定顺序聚合隔膜，并在室温下孵育30分钟。将三至五微升样品加入发光放电的电子显微镜网格中并孵育一分钟。
现在，通过添加一滴 darkSPB 缓冲液清洗网格两次，并用滤纸吸收液体。用水洗涤一次，用2%乙酸铀酰孵育30秒。接下来，吸干污渍并将样品风干几分钟。
然后以 120 千伏和 5， 000X 和 60， 000X 之间的放大倍率对隔肽束进行成像，散焦为 1 到 2 微米。HisTrap和StrepTrap色谱图显示，混合馏分从洗脱峰开始到吸光度分别稳定在约250毫升和50毫升。隔膜条带在变性凝胶电泳中表现出相似的强度，表明隔膜是完整的。
在天然电泳中，观察到对应于完整异低聚物的主条带和对应于三聚体或四聚体的次要条带。msfGFP标记复合物的表观分子量与未标记复合物的表观分子量无法区分。质量光度法检测到隔膜中完整的八聚体和六聚体。
在241千道尔顿处的另一个峰表明存在两种花生蛋白DSep1和mEGFP-DSep2。隔膜络合物的透射电子显微镜图像显示了六聚体和八聚体的棒状物。msfGFP 标签在隔膜蛋白 2 msfGFP 人隔肽octamers_9i1的两端可见为模糊密度。
在浅层TIRF场中可以观察到小的蛋白质簇。共聚焦显微镜显示大簇漂浮的丝状结构。透射电子显微镜显示与全内反射荧光显微镜和共聚焦显微镜观察到的簇相对应的小和大隔膜束。
我们建议在纯化过程中始终在冰上工作，并添加我们在方案中指定的新鲜试剂。我们对隔膜素在细胞分裂背景下的相互作用感兴趣。我们将隔膜蛋白与现代膜肌动蛋白和微管一起重建，用显微镜和几种生物物理测定来研究它们。
我们使用纯化的隔膜素来研究隔膜素如何与肌动蛋白丝、微管和脂质相互作用。我们还使用纯化的隔膜素来构建合成细胞，其中隔膜素促进细胞分裂。
概述
本协议概述了一种纯化高质量septin复合物的方法，这对于研究它们在细胞分裂和迁移中的作用至关重要。该方法使用Addgene质粒简化了纯化过程，使研究人员能够更好地研究septin的复杂相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 蛋白质纯化
- 细胞骨架研究
背景
- Septin是参与各种细胞过程的重要细胞骨架蛋白。
- 由于它们众多的相互作用，在体内研究septin具有挑战性。
- 体外重组允许更清晰地理解其功能。
- 高质量的蛋白质纯化对于准确的实验结果至关重要。
研究目的
- 开发一个可靠的septin复合物纯化协议。
- 促进研究septin在细胞分裂和迁移中的作用。
- 提高纯化蛋白的质量和寿命。
使用的方法
- 生长转化的细菌培养用于蛋白质表达。
- 使用亲和层析纯化His标记和Strep-II标记的septin。
- 通过光学吸收测量监测蛋白质质量。
- 为干涉散射显微镜准备样品。
主要结果
- 成功纯化了高质量的septin复合物。
- 建立了一个简单的蛋白质纯化协议。
- 通过体外研究改善了对septin相互作用的理解。
- 增强了分析septin异源寡聚体的方法。
结论
- 开发的协议有效用于纯化septin复合物。
- 该方法允许在更好的实验条件下研究septin。
- 未来的研究可以在这项工作的基础上更详细地探索septin的功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-quality purification and rigorous quality control of recombinant septin complexes are essential for deconvoluting cytoskeletal mechanisms in early discovery and target validation. This workflow enables precise interrogation of septin interactions with actin, microtubules, and membranes, supporting predictive confidence in mechanistic studies. Robust septin reconstitution underpins translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in cytoskeletal drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic dissection of septin function in cell division and migration.
- Supports biological de-risking by isolating septin interactions from cellular complexity.
- Facilitates functional target validation through reconstitution of defined septin assemblies.
- Provides predictive confidence for downstream cytoskeletal modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers validated septin complexes for reproducible in vitro assays.
- Standardizes input material for quantitative biophysical and imaging-based screens.
- Enables scalable preparation of septin isoform variants for comparative studies.
- Supports reliable evaluation of compound effects on septin polymerization and structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro septin reconstitution with disease-relevant cytoskeletal models.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of septin-targeting agents.
- Supports biomarker development by linking septin assembly states to functional readouts.
- Reduces translational risk by providing high-fidelity model systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model development, providing a foundation for cytoskeletal target evaluation and compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled septin reconstitution.
- Screening: Provides assay-ready, quality-controlled septin complexes for reproducible screening workflows.
- Analytics: Delivers quantitative outputs via mass photometry, gel electrophoresis, and microscopy for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights with preclinical cytoskeletal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for septin complex production across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeletal research.
- Operational Value: Standardizes septin purification and quality control for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of cytoskeletal targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of septin-related discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification and biophysical characterization.
- Needs access to chromatography systems, mass photometry, and advanced microscopy platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization of purification and QC protocols.
- Adaptation may be needed for different septin isoforms or species.
- Protein stability and degradation must be managed by rapid processing and cold-chain handling.
