Name: 寡核苷酸的化学三磷酸化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 学习寡核苷酸化学三磷酸化方法，使用水杨基磷酰氯和焦磷酸盐试剂，适用于RNA、DNA及非天然L-RNA等多种核酸类型。该方案突破酶法限制，为合成生物学和生物技术研究提供重要工具。

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作者感谢 Greg Springsteen、Natasha Paul、Charles Olea, Jr.、Jonathan Sczepanski 和 Katrina Tjhung 就化学三磷酸化反应最佳实践提供的有益讨论，并感谢 Gerald Joyce 提出的宝贵意见。本工作由美国国家科学基金会资助，项目编号为 MCB 2114588。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此处描述的三磷酸化方法广泛适用于采用标准亚磷酰胺化学法的寡核苷酸合成。核苷亚磷酰胺单体应带有碱不稳定的保护基团，这些保护基团需能与AMA39中的快速脱保护相兼容，包括亚磷酸基团上的标准β-氰乙基，以及核碱基环外氨基上的异丁酰基、二甲基甲酰胺基、乙酰基、苯氧乙酰基或4-异丙基苯氧乙酰基。核糖2'-羟基应由硅基保护基团保护，如t-丁基二甲基硅基（TBDMS）或三异丙基硅氧甲基（TOM）40,41。据报道，碱不稳定的匹伐酰氧甲基（PivOM）保护基也与化学三磷酸化反应相兼容30。
已报道多种用于合成寡核苷酸化学三磷酸化的方法28,29,30,31,32,33,34,35我们使用Ludwig-Eckstein试剂发现了三磷酸化现象37 是最易实施的方法之一，无需特殊试剂合成，也无需专用设备。通过该方法制备的寡核苷酸5′-三磷酸盐已被常规用作RNA连接酶核酶的底物，包括使用酶法难以获得的L型RNA寡核苷酸三磷酸盐，以实现该类分子的模板依赖性合成与复制 &#34;镜像&#34; 核酸14,16,17,18该方法也适用于制备小的5′-三磷酸化茎环RNA，这类RNA是脊椎动物先天免疫反应的有效激活剂6,7.
Ludwig-Eckstein试剂，即亚磷酰氯水杨酸酯37，对水具有高度反应性，在将该试剂溶解并加载到寡核苷酸柱之前，可有效清除引入的任何水分。然而在此之后，5′-亚磷酰化的寡核苷酸将优先与体系中引入的水反应，而不是与焦磷酸反应，后处理后会生成5′-H-亚磷酰酸酯副产物28,37,38。通过仔细制备三磷酸化试剂和三磷酸化反应腔室，可确保不产生该副产物。对于溶剂干燥，4 Å分子筛通常由大多数寡核苷酸合成试剂公司以特氟龙袋预包装形式出售，在多种品牌下均适用于大多数有机溶剂。通常无需采取额外预防措施，例如在无水气氛的手套箱中进行三磷酸化反应。
5′-磷酸化的寡核苷酸与TBAP反应生成环状5′-三磷酸亚磷酸中间体，随后使用寡核苷酸合成氧化液（碘/水/吡啶/四氢呋喃）将其氧化为环状5′-三磷酸。需要注意的是，市售氧化液中碘的含量各不相同，必须使用高浓度（0.1 M）的碘溶液，以确保完全氧化为三磷酸。该环状产物在同一溶液中水解生成最终的线性5′-三磷酸37；若希望使用除水以外的其他亲核试剂实现开环，则必须采用无水氧化体系（见下文应用部分）33。然而，任何残留的环状三磷酸亚磷酸盐在后续寡核苷酸的碱性去保护过程中也会被线性化。环状5′-三磷酸亚磷酸盐的水解仅生成线性而非支链的三磷酸产物37,46。
寡核苷酸脱保护通常无需针对5′-三磷酸化进行修改，但应采取一些预防措施。三磷酸基团对短时间的碱性条件相对稳定，但应避免将其暴露于AMA中的时间超过必要时长。应避免使用那些需要在65 °C下于氨水或AMA中处理超过10分钟才能去除的保护基团。当与其他磷酰胺保护基团相容时，较为温和的处理方式（例如室温下在氨水中处理2小时）是可以接受的。一种常见的快速脱保护方法用于硅基保护的合成RNA寡核苷酸，该方法使用三乙胺三氢氟化物并结合高温处理47；然而，在制备RNA 5′-三磷酸时应避免使用此法，因为长时间的酸性条件会加速三磷酸的水解31,32。
制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）已被证明是脱保护后纯化5′-三磷酸化寡核苷酸最简单且最可靠的方法（图3 和 图4）。然而，也可使用制备型反相高效液相色谱法（HPLC）纯化三磷酸化产物。在通过质谱验证三磷酸化时，通常会观察到5′-二磷酸以及少量5′-单磷酸副产物的存在。我们发现，在化学合成或转录法制备的高纯度样品中，尤其是在仪器未针对寡核苷酸分析进行优化的情况下，质谱检测过程中常发生5′-三磷酸基团的断裂。尽管如此，反相液相色谱（RP-LC）分析通常显示，在较长的5′-三磷酸化寡核苷酸中，约有10%–20%的5′-二磷酸副产物存在（图4）。市售的四丁基铵焦磷酸盐（tributylammonium pyrophosphate）可能被高达20%的单磷酸盐污染，这将在三磷酸化反应中产生5′-二磷酸作为副产物30,31。在实验室中仔细制备该试剂可获得纯度更高的TBAP储备液31。然而，我们发现，使用市售TBAP进行三磷酸化的寡核苷酸在作为底物参与酶促反应时，其反应活性仍与体外转录（in vitro transcription）制备的材料相当甚至更高（图5B）。
利用Ludwig-Eckstein试剂对寡核苷酸进行三磷酸化的另一个重要应用，是基于其生成的环状三偏亚磷酸中间体33。若后续氧化步骤采用1 M t-丁基过氧化物的己烷溶液进行——该条件常用于无水环境下的寡核苷酸氧化——则亚磷酸基团的氧化可在不发生环打开水解的情况下进行，从而生成环状三偏磷酸酯中间体。该中间体可进一步与伯胺或醇类亲核试剂反应，生成在γ-磷酸基团上带有修饰的5′-三磷酸化产物。这些修饰包括通过磷酰胺酯键连接疏水性标签，从而实现通过反相液相色谱（RP-LC）对三磷酸化产物进行快速特异性纯化，随后通过酸性水解将标签从三磷酸基团上切除33。此外，也可在γ-磷酸位置引入荧光修饰，用于核酶催化的连接反应的实时荧光检测15,33。

RNA的5′-三磷酸化形式在生物学中普遍存在，因为它在所有生命领域的RNA转录过程中以及许多RNA病毒生命周期中的RNA复制过程中均会生成。这些三磷酸化分子在真核生物中作为形成7-甲基鸟苷酸帽状mRNA的底物，因此在蛋白质表达中发挥着关键作用1。相比之下，细菌和病毒中会保留三磷酸基团；因此，RNA 5′-三磷酸可被真核生物的先天免疫应答调控因子识别2,3,4,5,6,7。在生物学之外，已进化出多种RNA连接酶核酶，可在体外利用5′-三磷酸基团in vitro8，并已被改造用于诊断检测9,10,11,12,13,14,15。其中一种核酶可用于以小分子L-RNA寡核苷酸5′-三磷酸为原料，进行模板依赖性的L-RNA合成，L-RNA是天然D-RNA的非生物来源“镜像”对映体16,17,18。常规制备不同序列和骨架组成的三磷酸化寡核苷酸，对于研究这些系统至关重要。
实验室中制备RNA 5′-三磷酸盐最常用且易于实现的方法是通过 体外 转录。然而，该方法产生的RNA在序列和大小上受到RNA聚合酶对启动子和底物要求的限制。T7 RNA聚合酶及其特化衍生物是用于此目的最常用的聚合酶。19,20,21,22. 体外 使用这些酶制备的转录RNA必须以5′-末端嘌呤开始，且在前10个核苷酸中显著偏向于嘌呤23,24此外，天然聚合酶对碱基或骨架修饰的核苷酸进行酶促掺入的效率极低，甚至通常无法实现，这限制了除天然D-RNA以外的寡核苷酸5′-三磷酸的合成机会。另一个限制因素是，通过转录生成的RNA 体外 转录产物可能含有显著的5′端和3′端异质性，当长度短于20 nt时，会产生极为异质的产物23,24,25,26,27.
相比之下，通过固相亚磷酰胺合成法制备的寡核苷酸进行化学三磷酸化28,29,30,31,32,33,34,35，可用于制备任意序列、长度为 3–50 nt 的寡核苷酸 5′-三磷酸盐。此外，在进行 5′-三磷酸化之前，还可将多种可通过亚磷酰胺合成法引入的核酸修饰引入寡核苷酸中14,15,16,17,18,29,36。这些方法中的许多均使用水杨酰氯磷酸酯作为磷酰化试剂，该试剂由 Ludwig 和 Eckstein 开发，最初用于单核苷的液相三磷酸化反应37。使用该试剂对寡核苷酸进行三磷酸化可在固相上完成，具体步骤包括：对寡核苷酸 5′-羟基进行磷酰化，随后与焦磷酸盐反应并氧化生成三磷酸基团，最后通过标准程序将寡核苷酸从固相载体上切割下来，并进行脱保护和纯化（图 1）28。
<img alt="使用试剂和溶剂制备核苷亚磷酰胺的化学合成示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：合成寡核苷酸三磷酸化的反应路线图。 第一步中，寡核苷酸5ʹ-羟基与SalPCl发生磷酰化反应；第二步中，5ʹ-水杨酸亚磷酸酯与TBAP反应生成环状亚磷酸中间体；第三步在DNA/RNA合成仪的氧化溶液（0.1 M 碘/吡啶/H2O/THF）中将其氧化，生成环状5ʹ-三偏磷酸酯，并在同一溶液中迅速水解为线性5ʹ-三磷酸产物28,33,37。随后，在水相MeNH2/氨溶液中从固相CPG载体上进行碱性裂解并脱除保护基，此过程可将任何残留的环状三偏磷酸酯进一步水解为线性形式。缩写：SalPCl = 水杨酸亚磷酰氯；TBAP = 三丁基铵焦磷酸盐；THF = 四氢呋喃；CPG = 控孔玻璃；MeNH2 = 甲胺。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
尽管早期使用该方法的发表报告常因产率低和产生不期望的副产物而受限28,37,38，但只要严格维持无水条件，即可常规获得高产率。通过仔细准备试剂并使用由标准塑料组件组装的简易反应装置，即可实现这一条件。本文中，我们演示了寡核苷酸化学三磷酸化的适当步骤，包括试剂准备、反应室组装、三磷酸化反应，以及随后对三磷酸化寡核苷酸的去保护和纯化。此外，还展示了5′-三磷酸化寡核苷酸作为连接酶核酶底物的代表性应用，用于合成具有天然D-RNA和非生物L-RNA骨架的较大核酸产物。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 聚醚砜注射器滤器</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>用于去除破碎的聚丙烯酰胺凝胶颗粒的注射器滤器（第5节）</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PTFE 注射器滤器</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>用于去除CPG树脂的注射器滤器（第5节）</td></tr><tr><td>1 mL 塑料注射器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-823-434（BD 309659）</td><td>三磷酸化装置的组成部分（第2节）&amp;ndash;4)</td></tr><tr><td>1,4-二噁烷，无水</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>三磷酸化溶剂（第2节）&amp;ndash;4)</td></tr><tr><td>2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮，水杨酸亚磷酸氯（SalPCl）</td><td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>三磷酸化试剂（第2节&amp;ndash;4)</td></tr><tr><td>30 mL 玻璃瓶</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>用于配制三磷酸化溶剂和TBAP溶液的瓶子（第2节）</td></tr><tr><td>三通旋塞阀，聚碳酸酯/聚丙烯材质</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>7328103</td><td>三磷酸化装置的组成部分（第2节）&amp;ndash;4)</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，19:1</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司</td><td>1610144</td><td>用于PAGE（第5节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>乙腈，无水，100 mL</td><td>格伦研究公司</td><td>40-4050-50</td><td>三磷酸化溶剂（第2节）&amp;ndash;4)</td></tr><tr><td>氨中和捕集器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ANT100 和 ANS121</td><td>与 Speedvac DNA130 配合使用（第 5 节）</td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1610700</td><td>用于PAGE的丙烯酰胺聚合催化剂（第5节&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>氨水，28%</td><td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>用于制备AMA去保护试剂（第5节）</td></tr><tr><td>40% 水合甲胺</td><td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>用于制备 AMA 去保护试剂（第 5 节）</td></tr><tr><td>自动化DNA/RNA寡核苷酸合成仪</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 DNA/RNA合成仪</td><td>任何基于柱的合成仪均可接受（第1节）</td></tr><tr><td>磁珠捕获磁铁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12320D</td><td>用于链霉亲和素磁珠捕获（第7节）</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1610404</td><td>用于PAGE尿素上样缓冲液（第5节）</td></tr><tr><td>深真空油泵</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VLP200-115</td><td>用于冻干机（第5节）</td></tr><tr><td>Drierite 干燥剂，10-20 目</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>用于储存三磷酸化化学品和设备的干燥剂（第1节）&amp;ndash;2)</td></tr><tr><td>D-RNA 27.3t 跨手性聚合酶</td><td>自行制备&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td>5&amp;prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&amp;prime;</td><td>用于手性交叉核酶反应（第7节）</td></tr><tr><td>D-RNA CPG 固相载体，1,000&amp;Aring;，预包装 1 &amp;micro;摩尔合成柱</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>代表性，用于D-RNA寡核苷酸合成（第1节）</td></tr><tr><td>D-RNA TOM保护的亚磷酰胺</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>代表性，用于D-RNA寡核苷酸合成（第1节）</td></tr><tr><td>空的快速合成柱，1&amp;micro;m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>用于Expedite DNA/RNA合成仪的合成柱（第1节）</td></tr><tr><td>EPPS，N-(2-羟乙基)哌嗪-N&amp;prime;-(3-丙烷磺酸)，固体</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>核酶反应缓冲液组分（第6节）</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA），固体</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>用于各种缓冲液的二价金属离子螯合剂（第5节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>用于加速合成柱的滤器</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Expedite型合成柱过滤器，用于空合成柱（第1节）</td></tr><tr><td>荧光/磷光凝胶扫描仪</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB，29187193</td><td>用于可视化分析性PAGE（第6节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>甲酰胺，去离子</td><td>VWR生命科学</td><td>97062</td><td>用于PAGE甲酰胺凝胶上样缓冲液（第6节&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>凝胶图像定量分析软件</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>用于定量分析扫描的凝胶图像（第6节）</td></tr><tr><td>玻璃干燥器</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>三磷酸化溶剂储存（第2节）</td></tr><tr><td>L-RNA CPG 固相载体，1,000&amp;Aring;，大量</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>L-型RNA寡核苷酸合成（第1节）</td></tr><tr><td>L-RNA 锤头状模板</td><td>自行制备&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td>5&amp;prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&amp;prime;</td><td>用于交叉手性核酶反应（第7节）</td></tr><tr><td>L-RNA 引物</td><td>自行制备&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td>5&amp;prime;-fluorescein-GGCUCGA-3&amp;prime;</td><td>用于交叉手性核酶反应（第7节）</td></tr><tr><td>L-RNA TOM保护的亚磷酰胺</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>L-型RNA寡核苷酸合成（第1节）</td></tr><tr><td>冻干机/冷冻干燥器</td><td>VirTis</td><td>台式K</td><td>用于寡核苷酸的浓缩（第5节）</td></tr><tr><td>六水合氯化镁，固体</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>核酶反应（第6节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺，无水</td><td>MilliporeSigma</td><td>227056</td><td>三磷酸化溶剂（第 2 节）</td></tr><tr><td>NAP-25 脱盐柱（Sephadex G-25 树脂）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>45000150</td><td>一次性重力流凝胶过滤层析柱，内含 Sephadex G-25 树脂（第 5 节）</td></tr><tr><td>非穿刺型不锈钢针头，20 G</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-815-410</td><td>用于穿刺橡胶隔垫的针头（第2节）&amp;ndash;4)</td></tr><tr><td>寡核苷酸消光系数计算器</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>寡核苷酸分析工具</td><td>最近邻模型短寡核苷酸260 nm消光系数计算器（第5节）</td></tr><tr><td>氧化剂溶液，0.1 M 碘/四氢呋喃/吡啶/水</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>三磷酸化试剂（第 4 节）</td></tr><tr><td>PAGE 胶板</td><td>Timberrock/CBS</td><td>NGP-250-BO 和 NO</td><td>用于PAGE（第5节&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>PAGE 电源供应器</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>用于PAGE（第5节&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>PAGE 垫片和梳子（分析型）</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-0725 和 VGC-0714</td><td>用于PAGE（第6节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>PAGE 垫片和梳子（制备型）</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R 和 VGC-3001</td><td>用于PAGE（第5节）</td></tr><tr><td>PAGE 凝胶支架</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>用于PAGE（第5节&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-374-12（Bemis PM999）</td><td>三磷酸化装置用石蜡密封膜（第2节）&amp;ndash;4)</td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>C1000 Touch 梯度PCR仪</td><td>用于交叉手性核酶反应（第7节）</td></tr><tr><td>PD-10 脱盐柱（Sephadex G-10 树脂）</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>一次性重力流凝胶过滤层析柱（含 Sephadex G-10 树脂），用于寡核苷酸分离 &amp;lt; 15 nt（第5节）</td></tr><tr><td>磷光屏</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>用于可视化 &lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P标记的RNA（第6节）</td></tr><tr><td>亚磷酰胺合成试剂</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>代表性，用于标准 RNA/DNA 合成（第 1 节）</td></tr><tr><td>聚丙烯螺口密封管</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>带螺口盖和硅胶O型圈的1.5 mL微量离心管，用于安全的AMA去保护反应（第5节）</td></tr><tr><td>吡啶，无水</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>三磷酸化溶剂（第2节）</td></tr><tr><td>反相液相色谱/电喷雾电离质谱法（RP-LC/ESI-MS）</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>专注于寡核苷酸的液相色谱/质谱商业服务（第5节）</td></tr><tr><td>橡胶隔垫（内径 × 外径 7.9 mm × 14 mm），白色</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>用于制备三磷酸化溶剂和TBAP的隔膜（第2节）</td></tr><tr><td>自我复制核酶 E</td><td>自行制备&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td>5&amp;prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&amp;prime;</td><td>用于自复制核酶反应（第6节）</td></tr><tr><td>自复制底物A</td><td>自行制备&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td>5&amp;prime;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&amp;prime;-OH</td><td>用于自复制核酶反应（第6节）</td></tr><tr><td>自复制底物 B，转录产物</td><td>自行制备&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td>5&amp;prime;-pppGAGACCGCAACTTA-3&amp;prime;</td><td>用于自复制核酶反应（第6节）</td></tr><tr><td>小型干燥陷阱，4 个 &amp;Aring; 分子筛</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>用于DNA/RNA合成仪的亚磷酰胺和三磷酸化试剂的干燥捕集阱（第1节）&amp;ndash;2)</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl），固体</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>用于各种缓冲液的盐（第5节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH），固体</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>用于各种缓冲液的盐（第5节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>统计数据分析拟合软件</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>用于将分析型PAGE数据拟合至动力学模型（第6节）</td></tr><tr><td>链霉亲和素包被的磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>65002</td><td>用于捕获交叉手性核酶反应中的生物素标记RNA（第7节）</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>用于PAGE尿素上样缓冲液（第5节）</td></tr><tr><td>TBE 电泳缓冲液，10 倍浓缩液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AAJ62788K3</td><td>用于PAGE（第5节&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>四丁基氟化铵，1.0 M 四氢呋喃溶液</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>用于去除2&amp;prime;硅基保护基团（第5节）</td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1610801</td><td>用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的丙烯酰胺聚合（第5节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>三丁胺</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>三磷酸化试剂（第 2 节）</td></tr><tr><td>四磷酸二丁基铵（TBAP）</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>三磷酸化试剂（第 2 节）</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>用于多种缓冲液的缓冲剂（第5节）&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 吐温-20 去垢剂</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>用于磁珠的中性洗涤剂（第 7 节）</td></tr><tr><td>尿素</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>用于PAGE和上样缓冲液（第5节&amp;ndash;7)</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>用于测量寡核苷酸浓度（第5节）</td></tr><tr><td>真空离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 真空浓缩仪</td><td>用于去除AMA和THF（第5节）</td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1610423</td><td>用于PAGE尿素上样缓冲液（第5节）</td></tr></tbody></table>

寡核苷酸的化学三磷酸化

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

5′-三磷酸是一种存在于所有生命体中的重要核酸修饰，目前在生物技术和合成生物学中正越来越多地被用作寡核苷酸的功能性修饰。寡核苷酸5′-三磷酸的传统制备方法 体外 通过酶学方法实现。然而，这些方法仅限于天然RNA寡核苷酸，具有显著的序列偏好性，且往往产生异质性产物。化学三磷酸化新方法的出现，不仅与亚磷酰胺化学法实现的自动化寡核苷酸合成成本降低相辅相成，也适应了当前可获得的多种核苷酸修饰形式。因此，现在可以合成任意序列和长度的寡核苷酸三磷酸酯，并可选择性地引入多种非天然修饰。
本文介绍了使用水杨酰氯磷酸酯和焦磷酸盐对寡核苷酸进行化学三磷酸化的适当方法与技术。该方法采用 commercially available 试剂，适用于大多数通过标准固相合成法制备的寡核苷酸，可在寡核苷酸合成后、脱保护和纯化前2小时内完成。文中展示了化学三磷酸化寡核苷酸作为催化性RNA酶底物的两种应用，包括利用非天然L-构型RNA三磷酸盐合成锤头状核酶的镜像版本。

应使用适合磷酸亚胺键和自动化DNA/RNA合成仪的标准方案合成寡核苷酸，使产物寡核苷酸仍连接在原始塑料合成柱中的固相载体上，并去除5ʹ端二甲氧基三苯甲基以获得游离的5ʹ-羟基（第1节）。本实验中使用的所有寡核苷酸均以1,000 Å控制孔径玻璃（CPG）树脂作为固相载体，并在0.2或1 µmole规模下进行合成。合成仪柱、树脂、试剂和磷酸亚胺单体的代表性示例如材料表所示。对于更大规模的反应，后续步骤中使用的体积和时间可能需要相应调整。
三磷酸化反应在定制的反应室中进行，该反应室为柱上结构（图2，第3节）使用所列的标准化市售组件 材料表 并遵循图示方案 图1 （第4节）28在整个三磷酸化过程中必须严格保持无水条件，所有溶剂和试剂均需预先用分子筛处理，并在使用前充分干燥（第2节）。三磷酸化反应通常需要2小时完成，随后，经洗涤和干燥的柱子可按照标准的寡核苷酸脱保护与纯化程序进行处理（第5节）。
脱保护后，寡核苷酸三磷酸通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化，在紫外背影显影下可见单一主产物条带，可将其切下并从凝胶中洗脱。对于短链寡核苷酸，5′-三磷酸产物可有效分离于反应副产物之外，如DNA三核苷酸5ʹ-三磷酸pppAAA和pppCCC以及L-RNA三核苷酸5ʹ-三磷酸pppGAA所示（图3A、B）。AAA和CCC DNA三聚体的5′-羟基和5′-三磷酸产物均被切下，并通过质谱鉴定，在图3A中相应标注。额外出现的条带（如AAA DNA三聚体中可见）通常所含物质不足以回收和鉴定。然而，这些条带的存在与未纯化反应产物中的额外产物质荷比相关（图3C），通常代表5′-二磷酸、单磷酸以及H-亚磷酸副产物，如下文所述。
PAGE 纯化后，可使用碾碎浸泡法洗脱较大的寡核苷酸42 以及后续的乙醇沉淀。然而，少于15个核苷酸的寡核苷酸无法有效进行乙醇沉淀，因此需要采用改良的凝胶洗脱程序（步骤5.11.3）。所列的一次性凝胶过滤层析柱在 材料表 仅适用于长度超过10个核苷酸的寡核苷酸。然而，我们发现，短至三聚体的寡核苷酸也可根据生产商推荐的方案有效进行脱盐。尽管如此，在脱盐较短的寡核苷酸时（如步骤5.6和5.11.3中所述），建议将层析柱洗脱液分段收集，并使用紫外-可见分光光度计在260 nm处通过吸光度鉴定产物组分。一种针对较短寡核苷酸优化的凝胶过滤层析柱包含在该试剂盒中 材料表 作为替代选择。最终产量来自 1 µmole 纯化后寡核苷酸合成的常规规模为 50–300 nmol。
可通过质谱法确认三磷酸化，其中三磷酸化产物的质荷比比5′-羟基寡核苷酸大+239.94 Da，但通常也会观察到对应于5′-二磷酸和单磷酸的物质（分别为+159.96 和 +79.98 Da）。还可能观察到一种5′-H-亚磷酸酯副产物，其质量比5′-OH寡核苷酸大+63.98 Da；该副产物含量较高表明三磷酸化反应过程中条件不够无水。在纯化前，脱保护的寡核苷酸通常会显示上述所有产物（图3C），而纯化后的样品则主要显示对应于5′-三磷酸产物的峰，同时伴有5′-二磷酸和单磷酸峰（图3D、E）。
仅使用质谱法通常无法准确测定5′-三磷酸的纯度，因为在电离过程中三磷酸基团的电离和碎裂速率存在差异。为测定最终产物的纯度，建议采用反相液相色谱串联电喷雾质谱法（RP-LC/ESI-MS），特别是对于较长的寡核苷酸。对D-RNA 5ʹ-三磷酸pppACGAGG和pppGAGACCGCAACUUA进行RP-LC/ESI-MS分析（分别为图4A、B）显示典型的最终产物纯度，其中含有20%的5ʹ-二磷酸杂质，因为当这两种物质存在于较长的寡核苷酸上时难以完全分离。
合成的5′-三磷酸寡核苷酸在生化研究中通常表现出与酶法制备材料相当甚至更优的性能。在第6部分中，以14个核苷酸的5′-三磷酸RNA底物为例，该底物可通过化学合成或酶法两种方式制备 体外 在RNA催化的自我复制反应中对转录进行了比较14,15,43,44,45核酶E催化底物A与B的连接，生成E的新拷贝，该自催化反应能够实现指数级增长。图5A）。E 和 32P标记的A组分通过以下方法制备： 体外 转录，且三磷酸化底物B是通过上述方法合成制备，或通过 体外 转录14通过定期取样并采用变性PAGE分析及定量，监测自复制反应的进程 通过 荧光/磷光凝胶扫描仪。将所得数据拟合至逻辑生长函数后显示，无论是转录的还是合成的B底物均能支持指数级增长，但合成B产生的产物略多图5B）。该结果可能反映了通过体外转录方法制备的RNA 5′端存在组成上的异质性 体外 转录23,24.
化学三磷酸化还能够合成那些无法通过生物学方法制备的寡核苷酸三磷酸酯 体外 或在细胞中。在第7部分中，使用了由L-RNA（天然D-RNA的对映体）组成的非生物性寡核苷三磷酸，这些底物按照第1–5部分的方法制备，用于D-RNA“交叉手性”聚合酶核酶27.3t（图6A），可催化短链L-RNA寡核苷酸5′-三磷酸在无特定序列依赖性的条件下，以模板指导的方式聚合生成更长的L-RNA产物。例如，该核酶能够合成L-RNA形式的锤头状自切割结构基序（图6B)18纯化的L-RNA三核苷三磷酸与荧光素标记的L-RNA引物和L-RNA模板混合（图6C）并与交叉手性连接酶反应。在反应过程中采集样品，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析，并使用荧光/磷光凝胶成像仪成像，以证明以模板编码的L-RNA型锤头状核酶的合成图 6D).
<img alt="电泳结果、质谱数据、蛋白质分析、强度与质量关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：三核苷酸5ʹ-三磷酸盐的纯化。（A）DNA三核苷酸三-脱氧腺苷（AAA，蓝色）和三-脱氧胞苷（CCC，红色）的三磷酸化反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析（通过紫外背影显影观察），故意过载以观察少量副产物。5ʹ-三磷酸产物（ppp）和5ʹ-羟基（OH）起始原料均被切下，并通过基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）鉴定。（B）L-RNA三核苷酸GAA的三磷酸化产物的制备型PAGE，主产物条带被切下，并通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）鉴定为5ʹ-三磷酸（ppp）。（C）去保护后粗反应产物的MALDI-MS图谱，以及（D）来自（A）的纯化产物。图中标注了5ʹ-三磷酸（ppp；pppAAA理论值1,119 Da，实测值1,118 Da；pppCCC理论值1,047 Da，实测值1,046 Da）、5ʹ-二磷酸（pp）、5ʹ-单磷酸（p）、5ʹ-羟基（OH）和5ʹ-H-磷酸酯（Hp）。（E）来自（B）的分离5ʹ-三磷酸产物直接进样电喷雾电离质谱（ESI-MS）的去卷积质谱图，峰已标注（理论值1,181.6 Da，实测值1,181.0 Da）。同时检测到5ʹ-二磷酸（pp）产物，以及三磷酸和二磷酸产物的钠离子峰（+22 Da）。常见污染物峰以星号标注。为便于比较，各质谱图均归一化至各自谱图中的最高强度，并以该值的百分比表示。缩写：PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳；MALDI-MS = 基质辅助激光解吸/电离质谱；ESI-MS = 电喷雾电离质谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示 pp、ppp 化合物分析中峰强度与保留时间关系的色谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：6 nt 和 14 nt D-RNA 寡核苷酸三磷酸的分析型反相液相色谱（RP-LC）。 （A）5ʹ-pppACGAGG-3ʹ 和 （B）5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ。串联电喷雾电离质谱（ESI-MS）鉴定出两个样品中的主峰（约 70%）为 5ʹ-三磷酸（ppp），另有少量 5ʹ-二磷酸（pp）。缩写：RP-LC = 反相液相色谱；nt = 核苷酸；ESI-MS = 电喷雾电离质谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA二级结构图与动力学分析用浓度-时间曲线图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：化学合成与酶法合成寡核苷酸5ʹ-三磷酸底物的比较 体外 转录 (A自复制核酶 E 连接 RNA A 与 5′-三磷酸化 RNA B。B) 使用自复制反应的比较 10 µM A 和 10 µM B，无论是合成的（空心圆圈）还是 体外 转录的（实心圆）。(B数据拟合至逻辑生长方程：[E] = a / (1 + be-ct），其中 a 为最终产量，b 为S形曲线的弯曲程度，c 为指数生长速率。两种反应的生长速率相同，均为 1.14 h-1，而使用合成 B 的反应最终程度高出 10%。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="RNA二级结构、转录过程示意图以及实验设置中的电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：核酶介导的跨手性L-RNA聚合反应。 （A）D-RNA 27.3t聚合酶核酶，可催化依赖模板的L-RNA连接反应。（B）由27.3t合成的L-RNA产物构成锤头状内切酶结构的一部分。（C）27.3t利用生物素标记的L-RNA模板（棕色）、末端标记的L-RNA引物（品红色）以及四种化学合成的L-RNA三核苷三磷酸（青色）催化L-RNA聚合反应。（D）在4小时和24小时后对（B）中延伸产物进行的PAGE分析，显示每次三核苷酸的逐步加入直至全长产物（黑点）。未反应的L-RNA引物作为参照标记。缩写：PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳；M = 参照标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

寡核苷酸5′-三磷酸盐是多种重要生物途径中的常见组分，并在生物技术应用中日益广泛使用。本文介绍了从通过标准自动化合成方法制备的寡核苷酸出发，常规合成与纯化寡核苷酸5′-三磷酸盐的技术。

5′-三磷酸是一种存在于所有生命体中的必需核酸修饰，正越来越多地被用作……的功能修饰

三磷酸化是生物学中RNA普遍存在的5'端修饰，且在生物技术应用中日益广泛。本文所述方案可实现通过标准自动化合成制备的任何寡核苷酸的5'端三磷酸化。该化学三磷酸化方法适用于含有RNA、DNA或非天然核酸的寡核苷酸。在此，合成了生物来源D-RNA的对映体——三磷酸化左旋L-RNA，并对其进行纯化后用于核糖体反应。三磷酸化修饰在自动化寡核苷酸合成之后、脱保护之前进行。这些步骤未在本文展示，但研究人员应熟悉相关标准操作方法。首先，确保磷酸化反应的工作区域配备带有至少两条管线的气体分配装置，并将鼓泡器连接至可调节压力的干燥氩气源，因为三磷酸化反应必须在氩气氛围下进行。然后，在各管线上安装1毫升塑料注射器，以便与反应装置连接。接着，准备好所需设备，包括1毫升塑料注射器、三通聚丙烯旋塞、无针头穿刺针、1.5毫升聚丙烯离心管和小型金属刮勺，并将其存放于密闭容器或干燥器中，加入干燥剂，在室温下干燥至少一天后再使用。在氩气压力下，从密封瓶中抽取30毫升无水1,4-二氧六环。转移至一个干燥的30毫升玻璃瓶中，并加入干燥阱。用橡胶隔垫密封，存放于装有干燥剂的干燥器中。同样，分别准备 30 毫升的 N, N-二甲基甲酰胺、乙腈，以及按体积比为三份二氧六环与一份吡啶组成的混合液。按照论文所述方法，将固体三丁基铵焦磷酸盐与二甲基甲酰胺和三丁基胺混合，在 30 毫升玻璃瓶中配制 TBAP 溶液。加入三个捕集阱。在氩气环境下用橡胶隔垫密封瓶子，并通入氩气鼓泡30分钟。使用自动DNA/RNA合成仪在合成柱上制备带有游离5'羟基的寡核苷酸。通过从干燥的1毫升注射器中取出活塞来准备反应室。使用剪刀或剃刀切掉注射器的顶部，并将注射器连接到合成柱上。在注射器顶部安装一个三通旋塞，并将旋塞的侧向入口通过鼓泡器连接至干燥氩气源，使旋塞的顶部入口作为试剂加样口。用夹具将该装置固定在支架上，并用石蜡密封膜密封所有上游接头。然后调节活塞，使进样口关闭，装置与氩气源相通。关闭鼓泡器，让氩气在低压下通入反应室持续五分钟。重新打开鼓泡器后，将一个注射器连接到合成柱底部，该注射器作为废液收集用。接下来，使用废液注射器反复将氩气通入柱中，然后重新连接推杆完全推入的注射器。添加试剂或溶剂时，将针头连接至干燥氩气源，并插入试剂或溶剂瓶的隔垫中，注意不要将针头浸入瓶内液体中。随后，装配一个带有针头的干燥注射器，并将其插入试剂或溶剂瓶的隔垫中，同样避免针头接触瓶内液体。随后，用氩气充满注射器，将针头从隔膜中抽出并排出氩气。再次用氩气充满注射器并排空一次后，在氩气氛围下吸取所需体积的溶剂或试剂。调节旋塞，使氩气源关闭，进样口打开。快速调整装置上的止动装置后，将装满的注射器和针头从试剂瓶中取出，擦去粘附在针头侧面或尖端的任何溶剂，然后将针头插入进样口。将试剂排入操作室的前室后，取出针头并关闭进样口，同时重新打开装置与氩气源的连接。使用废液注射器轻轻地将前室中的液体完全抽过合成柱，使所有液体均保留在废液注射器中。现在缓慢将溶液推回合成柱中，确保柱内无气泡。如需混合或搅动，可用废液注射器轻轻将溶液在柱内上下抽吸。若要从柱中移除试剂或溶剂，应缓慢将溶液吸入废液注射器中。当大部分溶液已进入废液注射器后，通入氩气以冲洗色谱柱中残留的溶剂。接着，移除废液注射器接口周围的石蜡密封膜。然后取下注射器，并弃去废液。随后，将废液注射器更换为新的干燥注射器，并重新密封接头。组装好三磷酸化装置后，通过向反室加入 200 微升吡啶二氧六环混合液来开始三磷酸化反应，操作方法如前所述。但此时暂勿将样品抽入合成柱中。按照文稿所述，将SalPCl溶解于二氧六环后，用干燥的注射器将其加入反相室并加载至合成柱上。然后让其反应15分钟，再用废液注射器如前所述移除并弃去SalPCl溶液。在移除SalPCl溶液后，立即向反相室中加入250微升TBAP溶液，并用注射器将其加载至合成柱上。振荡反应20分钟，然后按前述方法弃去。随后，用0.5毫升N,N-二甲基甲酰胺洗涤柱子，再用0.5毫升乙腈洗涤，每次加入溶剂后均除去废液。加入氧化剂溶液后，移除氧化剂，并按照上述相同步骤再次用乙腈洗涤柱子。最后拆卸装置，用5毫升乙腈冲洗柱子。随后，干燥柱子。按照文中所述的标准方案，将三磷酸化寡核苷酸从固相载体上裂解并进行脱保护。接着，将干燥后的脱保护寡核苷酸溶解于尿素上样缓冲液中，加热至80摄氏度，然后上样至聚丙烯酰胺凝胶，在25至35瓦功率下电泳运行一到两个小时。凝胶电泳结束后，取下凝胶板，拆开并用聚氯乙烯薄膜包裹凝胶。接着，使用254纳米紫外光背照法识别产物条带，并用剃刀切下主要产物条带。通过塑料注射器挤出或机械方法将切下的凝胶碾碎。对于少于15个核苷酸的寡核苷酸，使用至少12小时振荡或摇动，以三倍凝胶体积的无核酸酶水中洗脱。然后通过装有0.2微米滤器的注射器过滤溶液，去除固体凝胶碎片，并通过冷冻干燥进行浓缩。浓缩后，使用一次性尺寸排阻柱去除残留的盐和小分子物质，并如前所述通过冷冻干燥再次浓缩。按照文稿所述，配制含有聚合酶核酶、L-RNA 引物模板和三磷酸三核苷酸的 10 微升 RNA 溶液后，将其在 PCR 扩增仪中于 90 摄氏度加热 1 分钟，随后以每秒 0.2 摄氏度的速率冷却至 23 摄氏度进行退火。将 RNA 溶液在 17 摄氏度孵育后，加入 10 微升浓度为反应体系两倍的起始缓冲液以终止反应，取 10 微升等分试样，用 5 微升 pH 8 的 0.5 摩尔 EDTA 淬灭，并按照文稿所述方法处理各样品以分离 RNA。将沉淀的 RNA 溶解于 10 微升变性凝胶上样缓冲液中，并按文中所述制备未反应的末端标记引物。样品制备完成后，加热至 80 摄氏度。每个加样孔中加入 5 µL 样品，在 40 瓦条件下电泳约 40 分钟。将凝胶板从电泳槽中取出后，使用荧光或磷光凝胶扫描仪扫描，以观察交叉手性 L-RNA 延伸产物。凝胶纯化后，紫外背影显影显示存在5'三磷酸，表现为单一主要产物，如AAA和CCC DNA三聚体及GAA L-RNA三聚体所示。5'羟基副产物通常可见为迁移较慢的条带，该条带已被分离并通过质谱法鉴定为DNA三聚体的副产物。在凝胶纯化过程中出现的其他条带，在未纯化反应产物的质谱分析中对应于5'二磷酸、单磷酸和H-亚磷酸副产物。5'三磷酸产物显示出对应于5'三磷酸的主要质谱峰，同时伴有5'二磷酸和单磷酸的质谱峰。在RNA聚合反应中，使用了化学合成的与三磷酸相关的L-RNA三核苷酸，并以L-RNA引物和L-RNA模板进行反应，反应产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析，并采用荧光凝胶成像系统进行成像。由黑色圆圈标记的延伸产物表明，已合成了由模板编码的锤头状核酶的L-RNA版本。在三磷酸化过程中接触水分会降低产率。请仔细遵循干燥试剂的制备步骤及反应装置的组装流程。在装置中转移液体时应缓慢进行，以避免密封处断裂。化学三磷酸化对于制备非生物来源的寡核苷酸三磷酸盐至关重要，包括左旋RNA。该技术使得交叉手性核酶能够合成生物学中RNA分子的镜像版本。

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