自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法

通过本方案，我们可视化了在呈现不同曲率的图案化基底上细胞骨架丝状蛋白的排列情况。我们可以检测曲率敏感性。扫描电子显微镜图像的分辨率足够高，能够实现纳米尺度上结构排列的可视化。

我们所采用的固定方法足够温和，能够保持蛋白质内部结构的组织形态。这仍属于基础研究范畴，旨在理解细胞骨架纤维的行为特性。首先在洁净室环境中，利用波幅为250纳米、横向周期为2微米的波状聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）起伏图案，制备出波状的Norland光学胶（NOA）复型。

为此，将5 µL液体NOA滴加到直径为1厘米的圆形玻璃盖玻片上，然后将PDMS模板置于液滴上。用320纳米的紫外光照射该组装体5分钟，使液体NOA光聚合形成一层薄的聚合物膜。完成后，轻轻从盖玻片上剥离带有新聚合NOA的PDMS模板。

使用空气等离子体清洗仪处理NOA薄膜五分钟，使其表面具有亲水性。按照论文中所述方法制备小单层囊泡（SUVs）溶液，并通过在观察缓冲液中重新悬浮干燥的脂质膜，随后在水浴超声仪中进行超声处理五至十分钟，直至溶液透明，从而获得SUVs。随后，将承载NOA图案的盖玻片插入细胞培养板的孔中，并在室温下用100微升浓度为1毫克/毫升的SUV溶液孵育新近经辉光放电处理的NOA图案30分钟，以形成支撑脂双层膜。

为去除未融合的SUV，用低盐缓冲液对八聚体septin进行彻底冲洗，共冲洗六次，每次冲洗之间切勿让样品完全干燥。将八聚体septin储存液用低盐缓冲液稀释至终浓度为10至100纳摩尔，体积为1毫升。随后，将蛋白溶液在室温下孵育于载玻片上，持续一小时。

洗涤含有融合支撑脂双层的NOA玻片，并用低盐缓冲液孵育Septin蛋白。将Septin低盐缓冲液替换为预先在37摄氏度温育的0.1摩尔焦钒酸钠缓冲液中的2%戊二醛固定液，反应15分钟，随后用0.1摩尔焦钒酸钠缓冲液洗涤固定后的样品三次，每次5分钟。洗涤后，将样品依次在四氧化锇固定液、过滤后的单宁酸溶液和过滤后的醋酸铀酰溶液中各孵育10分钟。

每次溶液处理后，均用蒸馏水将样品洗涤三次。将样品依次在50%至100%的乙醇溶液中孵育，每个浓度孵育2至3分钟。将载玻片转移至已预装乙醇的临界点干燥器内，并按照制造商的说明进行干燥处理。

由于干燥样品具有很强的吸湿性，应立即将盖玻片粘附到样品台上进行包被。然后在盖玻片的上表面涂上一条银导电漆，注意避免形成漆的团聚物。确保盖玻片与样品台之间的连接良好。

当样品完全蒸发后，使用配备等离子体磁控溅射头和旋转行星式样品台的设备，并遵循制造商提供的标准操作规程。在120毫安下进行60秒的预溅射，以去除表面的氧化层。然后在90毫安、工作距离为50毫米的条件下，使用薄膜厚度监测仪沉积1.5纳米的钨层。

随后，将样品保存在真空环境中，以防止其在扫描电镜分析前及分析过程中受到环境空气的影响。为通过内陆探测器检测二次电子实现高分辨率成像，将加速电压设置为3千伏，束流设置为20微米光阑。观察时，采用的分辨率范围为每像素21.25纳米至每像素1.224纳米。

数据分析时采用每像素5.58纳米的分辨率。高分辨率观察时，工作距离设为1至2毫米；若需要增大景深，则设为约3毫米。连续调节扫描速度和线积分，以确保信噪比恒定，每幅图像的采集时间约为30至45秒。

代表性分析展示了在波浪形聚二甲基硅氧烷（PDMS）图案上沉积1.5纳米铂和1.5纳米钨材料后对隔蛋白丝的影响。观察发现，未修饰的巨大单层囊泡（GUVs）呈完美球形。在隔蛋白诱导变形后，囊泡呈现多面体形态，且变形保持静态，未发生波动。

在较高浓度的 septin 条件下，观察到囊泡出现周期性变形。通过冷冻电子显微镜成像并结合倾斜系列样品的三维重构，研究了结合在大单层囊泡（LUVs）上的 septin 丝状结构的自组装行为。利用扫描电子显微镜观察了 septin 丝状结构依赖于曲率的排列方式。

在低倍镜下，可见具有正负曲率周期性的波状图案。在高倍镜下观察到 Septin 纤维的超微结构排列。必须小心剥离 NOA，以防止其降解。

成像后，可进行一些图像分析，以定量表征通过 SCM 观察到的超微结构特征，例如丝状结构的间距和取向。本方法目前已应用于 septin 蛋白，但也可用于其他细胞骨架蛋白或能形成长丝状结构的蛋白质，因而可对曲率具有敏感性。