利用微流体和荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝和束的组装动力学

我们将荧光显微镜与微流体相结合，研究肌动蛋白结合蛋白如何调节肌动蛋白丝的组装和拆卸。通过微流体，我们能够同时量化数十个单个肌动蛋白丝上发生的反应，同时精确控制生化和机械条件。请记住，溶液首先平行注射，直到它们到达腔室，然后通过改变压力设置将细丝依次暴露于每个溶液中。

要开始制备聚二甲基硅氧烷或PDMS，腔室组装，将热板预热至100摄氏度。在深层紫外线清洁剂中，将清洁培养皿中的一个清洁的PDMS室和一个玻璃盖玻片暴露在紫外线下三到五分钟。完成后，将PDMS腔室放在盖玻片上，使直接暴露在紫外线下的两个表面接触。

要去除困在 PDMS 盖玻片接口处的气泡，请用手指轻轻按压腔室表面。用力按压角落和侧面，确保腔室的天花板不会与玻璃表面接触。将玻璃底朝向热板的腔室置于100摄氏度下五分钟。

然后立即使用该室，或将其存放在干净的培养皿中一周。要冲洗入口和出口管，请用300微升F缓冲液填充一个2毫升的储液管，将其拧在微流体支架上，并将压力设置为300毫巴。让五到八滴F缓冲液被浪费，然后将压力设置为零并重复每个通道的过程。

接下来，设置4至50毫巴的储液管出口压力，一旦液滴从油管尖端出来，将油管连接到PDMS室的出口。当液体充满腔室并从所有入口流出时，将出口压力设置为20毫巴。之后，将储液管的压力设置为 1 至 50 毫巴。

为避免引入气泡，请确保在将管道连接到入口之前，有液滴从管道和 PDMS 入口中流出。将入口压力设置为 30 毫巴。如图所示连接入口 2 和 3 后，将所有入口的压力设置为 20 毫巴，将出口压力设置为零毫巴。

确保入口处的流速大致相等。更换储液罐时，将所有入口压力设置为 12 毫巴，将出口压力设置为 5 毫巴。为了快速注入溶液，请将相应入口的压力设置为150毫巴，并将其他入口中的压力调节到100毫巴左右，使得入口处的流速为每分钟500纳升。

要更换溶液，请在新的储液管中填充200至300微升的溶液，并将压力设置为变化设置。然后，拧下入口的储液管。一旦在管尖上形成一个小液滴，用新鲜的溶液拧入新管，将压力设置更改为高流量。

根据微流体配置和腔室几何形状，等待三到五分钟，让溶液填充管子并到达腔室。该过程之后可以测量荧光随时间的增加。对于表面官能化，在F-缓冲液中将溶液3至200微升50皮摩尔光谱蛋白肌动蛋白种子，并以高流量三将溶液注入两分钟。

对于表面钝化，在F缓冲液中用300微升的5%BSA更换管三，然后在高流量三处注入五分钟，然后在中流三处注入五分钟，在通道1和2中减压7至8毫巴，以获得每分钟100纳升的逆流。整个腔室表面将被BSA钝化。将试管三改为F缓冲液，在高流量三下冲洗通道五分钟。

之后，如手稿中所述，分别用一个微摩尔肌动蛋白profilin，0.15微摩尔肌动蛋白和F缓冲液更换一至三个管，并使用高流量全部预设注入新鲜制备的溶液三至四分钟。打开显微镜并将相机曝光时间调整为100至200毫秒，激发激光功率至10至20%，全内反射荧光或TIRF深度为200至300纳米，以使用60X物镜捕获图像。接下来，将压力设置为中流一，持续10分钟，以每20秒一帧的速率记录长丝聚合，然后以中流二速记录15分钟，用于长丝老化。

在落射荧光模式下，每五秒钟一帧，一到两帧后，切换到中流三，以记录以每秒约10个亚基解聚的细丝。为了重置实验，通过将荧光标记的灯丝以最大功率连续暴露在激光下两分钟来打破所有荧光标记的灯丝。通过更换溶液一，二或三并以高流量注入三到四分钟来测试不同的条件。

这里给出了基本聚合/解聚实验的结果。由此产生的缩模照片用于量化聚合和解聚速率。当生长的肌动蛋白细丝暴露于荧光标记的科菲林溶液中时，科菲林簇成核并朝向尖头和带刺的末端生长。

当单个细丝暴露于迷彩时，它们会形成看起来更亮的束，并且不完全与流动对齐。在更换储液管时，避免在系统中引入气泡非常重要，并且注意不要让储油管变空。该技术对于在数十根单丝上施加拉力，查看formin和cofilin机械灵敏度以及ARP2 /3去支散至关重要。