Name: 利用微流体和荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝和束的组装动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习利用微流体与荧光显微镜技术研究肌动蛋白结合蛋白如何调控单根肌动蛋白丝的组装与解聚动力学。该方法可同时定量分析多根丝的反应过程，精确控制生化与机械条件，为细胞骨架动态研究提供高分辨率实时观测手段。

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我们感谢 B. Ladoux 和 R.-M. Mège 实验室提供其紫外清洁设备的使用，感谢 J. Heuvingh 和 0. du Roure 在硅晶圆模具制备方面的初期培训以及在微流控技术上的建议。本研究得到欧洲研究理事会授予 A.J. 的 StG-679116 项目基金，以及法国国家研究署授予 G.R.-L. 的 Muscactin 和 Conformin 项目基金的资助。

<ol><li>Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li>
<li>Jégou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).</li>
<li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li>
<li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963(2019).</li>
<li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+phosphate+release+from+Arp2%2F3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li>
<li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li>
<li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li>
<li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li>
<li>Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883(2013).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li>
<li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li>
<li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li>
<li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li>
<li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsional+stress+generated+by+ADF%2Fcofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li>
<li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548(2021).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li>
<li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li>
<li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li>
<li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li>
<li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Le Clainche, C., Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+motility+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).</li>
<li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470(2016).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li>
<li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li>
<li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

与传统的单丝方法相比，微流控技术具有多项优势。在传统方法中，肌动蛋白丝通过其长度上的多个位点锚定在表面，或通过甲基纤维素等拥挤剂使其保持在表面附近。由于微流控中与表面的相互作用极小，因此避免了这些相互作用在聚合和解聚过程中可能引发的人为暂停现象。在流动作用下，纤维丝相互平行排列，便于观察并测量其长度。纤维丝周围的溶液持续更新，使其始终暴露于恒定的蛋白质浓度环境中。能够快速（<1 秒，图 3D、E）切换纤维丝所处的不同蛋白质溶液，使得时间可控的连续实验成为可能，这在动力学研究中往往至关重要。最后，流动溶液对纤维丝产生的黏性拖拽力可用于对纤维丝施加可控的机械应力（见“代表性结果”部分）。需要注意的是，适度的流体流动（中等流速压力设置）可使纤维丝靠近表面至约 250 nm 的距离，足以利用 TIRF 高效成像，同时产生的张力极小（<1 pN）14。
与经典的单丝检测相比，微流控技术需要更大体积的蛋白质溶液：通常为几...

肌动蛋白丝及其网络结构的组装与解聚受到多种生化反应的调控，并依赖于机械环境。为了深入理解这些复杂的机制，能够观察到单个肌动蛋白丝上的单个反应（在足够大的数量下）具有极其重要的价值。在过去的几十年中，利用全内反射荧光（TIRF）显微镜实时观察动态肌动蛋白丝已成为一项关键技术，获得了大量无法通过传统的溶液生化实验所取得的研究成果1。
为实现这一点，需要将荧光标记的肌动蛋白丝维持在显微镜盖玻片表面附近，同时使其暴露于肌动蛋白结合蛋白（ABPs）溶液中，这些蛋白也可带有荧光标记。这样做可在严格控制的生化条件下监测单根肌动蛋白丝上发生的事件，从而量化反应速率。然而，需考虑若干特定限制因素。通过多个锚定点或使用甲基纤维素等拥挤剂人为地将肌动蛋白丝维持在表面附近，可能改变其行为（例如导致其聚合与解聚过程出现暂停2）。追踪每根肌动蛋白丝的轮廓可能具有挑战性，特别是当随着时间推移，视野中不断积累新的肌动蛋白丝或丝段时。反应发生在有限体积内，肌动蛋白单体和ABPs的浓度可能随时间变化，这可能导致难以准确推导反应速率常数。最后，在少于30秒内更换或更新ABPs溶液难以实现，且通常会导致样品中蛋白质分布不均。
大约10多年前，受到已有研究单个脱氧核糖核酸（DNA）链方法的启发3，我们引入了一种基于微流控技术的新方法，用于观察和操控单个肌动蛋白丝4。该方法能够规避上述传统单丝技术的局限性。在这些微流控实验中，肌动蛋白丝从吸附在盖玻片上的血影蛋白-肌动蛋白种子上生长出来。因此，丝状物仅一端固定于微流控腔室底部，并在表面之上自由波动而不会粘附。在流入溶液的流动作用下，丝状物会沿流动方向排列，从而便于监测其轮廓长度，并使其保持在盖玻片上方较浅的区域，以便使用全内反射荧光（TIRF）显微技术。不同的溶液可同时流入腔室但互不混合，从而使丝状物能够依次快速地暴露于不同溶液中。
本文提出了一系列在实验室中建立单根肌动蛋白丝微流控实验的基本方案。盖玻片和微流控腔室可预先制备（耗时约半天），而实验本身可在不到一天的时间内完成，期间可同时测试多种不同的生化条件。

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-酪蛋白</td><td>Merck</td><td>C6905</td><td>使用浓度为 8 mg/mL</td></tr><tr><td>活检打孔器（带推杆）</td><td>Ted Pella</td><td>15115-2</td><td>内径 0.75 mm，外径 1.07 mm</td></tr><tr><td>生物素-BSA</td><td>Merck</td><td>A8549</td><td>使用浓度为 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A8022</td><td>使用浓度为 50 mg/mL</td></tr><tr><td>盖玻片迷你支架&lt;br/&gt; 聚四氟乙烯支架</td><td>Invitrogen</td><td>C14784</td><td>适用于 8 个盖玻片</td></tr><tr><td>盖玻片 22x40 mm&lt;br/&gt; 厚度 #1.5</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1370</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>D27802</td><td>f-buffer 的组分</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-D</td><td>f-buffer 的组分</td></tr><tr><td>琥珀酰亚胺基酯 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td>用于标记 Lys328 位点的肌动蛋白荧光染料</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21338</td><td>用于在 Lys328 位点对肌动蛋白进行生物素标记</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td>玻璃器皿清洗剂</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>开源软件</td></tr><tr><td>Laboport</td><td>KNF</td><td>811kn.18</td><td>真空泵（极限真空：240 mbar）</td></tr><tr><td>魔力透明胶带</td><td>Scotch</td><td>7100024666</td><td>标准透明办公胶带</td></tr><tr><td>微量管</td><td>Simport</td><td>T341-6T</td><td>2 mL 微流控储液管</td></tr><tr><td>微流控装置 第一部分：Flow Unit S</td><td>Fluigent</td><td>FLU-S-D-PCKB</td><td>流量计</td></tr><tr><td>微流控装置 第二部分：Fluiwell-4C-2 mL</td><td>Fluigent</td><td>14002001PCK</td><td>储液池支架</td></tr><tr><td>微流控装置 第三部分：MFCS-EZ</td><td>Fluigent</td><td>EZ-11000001&lt;br/&gt; EZ-00345001</td><td>压力控制器</td></tr><tr><td>Model 42 - UVO-Cleaner</td><td>Jelight Inc.</td><td>42-220</td><td>紫外清洁仪</td></tr><tr><td>N6-(6-氨基己基)-ATP-ATTO-488</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-805-488</td><td>用于标记肌动蛋白的 ATP-ATTO 探针</td></tr><tr><td>中性亲和素（neutravidin）</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td>在 PBS 中使用浓度为 1 mg/mL</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS) Sylgard 184 硅弹性体</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>包含 PDMS 基料和固化剂</td></tr><tr><td>聚醚醚酮 (PEEK) 管</td><td>Merck</td><td>Z226661</td><td>&amp;ldquo;蓝色&amp;rdquo;：内径 = 0.25 mm</td></tr><tr><td>安全吹尘枪</td><td>Coilhose Pneumatics</td><td>700-S</td><td>过滤空气</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>VWR</td><td>228-0701P</td><td>连接 PEEK 管与接头</td></tr><tr><td>不锈钢导管接头</td><td>Prime Bioscience</td><td>SC22/15</td><td>插入 PDMS 进样口和出样口，用于连接 PEEK 管</td></tr><tr><td>热塑性薄膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PM996</td><td>标准 &quot;Parafilm&quot; 封口膜</td></tr><tr><td>超纯乙醇</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>VWR</td><td>USC200TH</td><td>可容纳 1 L 烧杯</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td>用于对 PDMS 或溶液脱气</td></tr></tbody></table>

利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

为了阐明调控肌动蛋白丝组装与解聚的复杂分子机制，在严格控制的条件下实时监测单个反应过程具有重要意义。为此，过去20年来发展出了活细胞单丝实验技术，主要采用全内反射荧光（TIRF）显微镜，获得了大量关键性研究成果。2011年，为了进一步拓展此类实验的可能性并避免反复出现的技术性伪影，我们在这些实验中引入了简单的微流控技术。本研究详细描述了我们的基本实验方案：将单个肌动蛋白丝一端锚定于经过钝化处理的盖玻片表面，在流动作用下使其定向排列，并可依次暴露于不同的蛋白质溶液中。我们还介绍了特定应用的实验方案，并解释了如何利用流动溶液的黏性拖拽力施加可控的机械力。我们强调了这些实验中的技术注意事项，并简要展望了基于该技术的可能发展方向。结合当前易于使用的微流控设备，这些实验方案与说明应有助于非专业研究人员在各自实验室中建立并实施该技术。

对于上述所有实验，应能清晰观察到荧光标记的肌动蛋白丝，且对比度良好，表明表面背景荧光较低（图4，常见问题的解决方案见补充文件1）。肌动蛋白丝不应粘附于表面：当主导流速较低时，在实时观察下应可察觉肌动蛋白丝的侧向波动，从而明确判断其仅由一端锚定。同样，在使用全内反射荧光（TIRF）成像时，应可通过其长度方向上随时间变化的荧光强度变化，观察到肌动蛋白丝的垂直波动。根据所施加的流速，可能需要调整TIRF的穿透深度，以优化通过TIRF获取的肌动蛋白丝图像质量。
在将细丝暴露于聚合条件时（见第8节），细丝的延伸应保持规律（即细丝末端的延伸不受表面相互作用或永久性粘附的阻碍）。此外，所测得的细丝正极（barbed end）延伸速率应与试管中肌动蛋白浓度所预期的数值相符1,20，这表明管内溶液已正确流入微流控腔室（图4A）。同样...

我们介绍了简单的肌动蛋白丝微流控实验方案，结合荧光显微镜技术，可实时准确监测单个肌动蛋白丝，并依次将其暴露于不同的蛋白质溶液中。

为了阐明调控肌动蛋白丝组装与解聚的复杂分子机制，能够实时监测……具有重要意义。

我们将荧光显微镜与微流控技术相结合，研究肌动蛋白结合蛋白如何调控肌动蛋白丝的组装与解聚过程。利用微流控技术，我们能够同时定量分析数十根单个肌动蛋白丝上发生的反应，并精确控制生化和机械条件。请注意，溶液首先并行注入，直至到达反应腔室，随后通过改变压力设置，使肌动蛋白丝依次暴露于每种溶液中。为了开始制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）腔室组件，将加热板预热至100摄氏度。将一个已清洁的PDMS腔室和一个玻璃盖玻片置于洁净的培养皿中，在深紫外清洁仪中暴露于紫外光下三到五分钟。完成后，将PDMS腔室放置在盖玻片上方，使两个直接暴露于紫外光的表面相互接触。为去除PDMS盖玻片界面处截留的气泡，可用手指轻轻按压腔室表面。在角落和边缘处用力按压，确保腔室的顶部不会接触到玻璃表面。将腔室底部朝下放置于100摄氏度的加热板上，加热五分钟。然后立即使用该腔室，或将其置于洁净的培养皿中保存一周。冲洗进样和出样管路时，取一支2毫升的储液管，加入300微升F缓冲液，旋紧至微流控支架上，并将压力设为300毫巴。让5到8滴F缓冲液流出废弃，随后将压力调至零，对每个通道重复此操作。接着，将第四储液管出口的压力设置为50毫巴，当管尖有液滴流出后，将管路连接至PDMS腔室的出口。当液体充满腔室并从所有入口流出时，将出口压力调至20毫巴。随后，将储液管的压力设置为1至50毫巴。为避免引入气泡，在将管路连接到入口一之前，应确保管路和PDMS入口处有液滴流出。将入口压力设置为30毫巴。按照示范方法连接入口二和入口三后，将所有入口的压力均设置为20毫巴，出口压力设置为0毫巴。确保各入口的流速大致相等。更换储液器时，将所有入口压力设为12毫巴，出口压力设为5毫巴。若需快速注入溶液，将相应入口压力设为150毫巴，并调节其他入口压力至约100毫巴，使各入口的最终流速达到500纳升每分钟。更换溶液时，将 200 至 300 微升的新溶液加入新的储液管中，并将压力调至更换模式。然后，拧下进液口的储液管。待管尖形成一小滴溶液后，旋入装有新鲜溶液的新储液管，并将压力设置更改为高流速模式。根据微流控装置的构型和腔室几何形状，等待三到五分钟，使溶液充满管路并到达腔室。可通过随时间测量荧光强度的增加来监测该过程。进行表面功能化时，更换溶液，注入200微升含50皮摩尔血影蛋白-肌动蛋白种子的F缓冲液，以高流速三持续注入两分钟。进行表面钝化时，将三号管更换为含5% BSA的F缓冲液300微升，然后在高流速三条件下注入5分钟，接着在中流速三条件下继续注入5分钟，同时将一、二号通道的压力降低至7至8毫巴，以获得每分钟100纳升的反向流。整个腔室表面将实现BSA钝化。随后将三号管更换为F缓冲液，在高流速三条件下冲洗通道5分钟。随后，按照文中的说明，分别用一微摩尔的肌动蛋白结合蛋白（actin profilin）、0.15 微摩尔的肌动蛋白以及 F 缓冲液更换第 1 至第 3 号管，并使用高流速预设模式注入新配制的溶液，持续三到四分钟。打开显微镜，将相机曝光时间调整为 100 至 200 毫秒，激发激光功率设为 10% 至 20%，全内反射荧光（TIRF）深度设为 200 至 300 纳米，使用 60 倍物镜采集图像。接着，将压力设置为中等流速一，持续 10 分钟，以每 20 秒一帧的速率记录丝状体的聚合过程，随后切换至中等流速二，持续 15 分钟以进行丝状体老化。以每五秒一帧的频率在落射荧光模式下捕获去聚合过程，获取一到两帧后，切换至中等流速三，以记录每秒约10个亚基的微丝去聚合过程。要重置实验，需将所有荧光标记的微丝暴露于最大功率激光下持续照射两分钟，使其完全断裂。通过更换溶液一、二或三，并以高流速注入三至四分钟，测试不同条件。此处展示了基本聚合/解聚实验的结果。利用所得的明场显微图像来定量分析聚合和解聚速率。当生长的肌动蛋白丝暴露于荧光标记的cofilin溶液时，cofilin簇在肌动蛋白丝上成核，并向尖端和钝端延伸生长。当单根细丝暴露于fascin时，会形成束状结构，这些束状结构看起来更亮，且与流动方向不完全对齐。在更换管道时，必须避免将气泡引入系统，并注意不要让储液管排空。该技术对于在数十根单根细丝上施加拉力、研究formin和cofilin的力学敏感性以及ARP2/3介导的去分支过程至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

利用微流体和荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝和束的组装动力学

利用延时显微镜监测肌动蛋白解聚过程

本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。...

利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

我们提出一种构建分子穿梭装置的方案，其中表面附着的驱动蛋白马达推动带有染料标记的微管。驱动蛋白与表面之间的弱相互作用使其能够可逆地附着于表面，从而形成一种纳米尺度系统，该系统在保持功能完整性的同时，展现出组分的动态组装与解聚行为。...

组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测...

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

学习利用微流体与荧光显微镜技术研究肌动蛋白结合蛋白如何调控单根肌动蛋白丝的组装与解聚动力学。该方法可同时定量分析多根丝的反应过程，精确控制生化与机械条件，为细胞骨架动态研究提供高分辨率实时观测手段。

利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

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