Name: 将质粒DNA电穿孔到小鼠骨骼肌中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 学习电穿孔介导的基因转移技术在小鼠骨骼肌中的应用，该方法无需病毒载体即可高效递送质粒DNA。研究表明此技术不影响肌肉收缩功能，可用于肌肉生理学和基因表达调控研究。

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所有涉及动物的实验均在宾夕法尼亚州立大学医学院进行，并经宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会批准，实验过程遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版中规定的伦理标准。本实验采用12周龄雌性C57BL/6小鼠。所有手术器械在实验前均经过高压灭菌以确保无菌。
1. 胫骨前肌和趾长伸肌注射/电穿孔准备
注意：TA 和 EDL 注射/电穿孔制备的步骤相同。
<ol>
	<li>实验前，将表达质粒构建体纯化至浓度为 1 µg/µL，并溶于无菌 PBS 中。本实验采用市售的无内毒素质粒纯化试剂盒，对 pcDNA3-EGFP（GFP）或 pcDNA3 空载体（对照）进行纯化。</li>
	<li>计算质粒浓度，以确保合适的注射体积（TA 注射量为 50 µg DNA 溶于 50 µL 无菌 PBS；EDL 注射量为 10 µg DNA 溶于 10 µL 无菌 PBS），并分装样品。</li>
	<li>使用选择旋钮设置电穿孔仪参数，按下旋钮进行参数选择：模式 - LV，电压 - 12.5 V/mm（注射时可调整），脉冲时长 - 20 ms，脉冲次数 - 5，间隔时间 - 200 ms，极性 - 单极。</li>
	<li>使用异氟烷气体麻醉小鼠。将小鼠置于含 5% 异氟烷的诱导箱中，通过镊子夹趾无反应确认达到手术麻醉深度后，将异氟烷浓度降至 2% 维持剂量。随后将小鼠转移至 37 °C 循环水浴板上的鼻罩装置中，继续后续操作。</li>
	<li>使用小型电推剪去除双侧后肢毛发。交替使用 70% 乙醇和碘伏对下肢进行擦拭，以消毒注射区域。</li>
</ol>
2. TA 注射/电穿孔
<ol>
	<li>将小鼠置于仰卧位，在后肢外侧透过皮肤定位可见的胫骨前肌（TA）肌腱。使用带有可拆卸30 G针头的50 µL微量注射器，将针头插入肌腱接合部上方1-2 mm处，以约5°的浅角进针，直至针尖到达肌肉的上端。 
	注意：目标是将液体注射至肌肉中段。</li>
	<li>在缓慢沿注射路径回撤针头的同时，缓慢推动注射器推杆，注入50 µL质粒溶液。肌肉应出现肿胀。</li>
	<li>设置计时器为1分钟，并测量TA肌所在位置后肢的厚度。根据小鼠体型不同，该厚度通常为5-10 mm。将卡钳式电极调整至所测得的厚度，并将电穿孔仪的电压设定为12.5 V/mm。</li>
	<li>1分钟后，将卡钳式电极夹住后肢，电极应贴合但不过紧。施加5次方波脉冲，每次持续20 ms，间隔200 ms（每次脉冲应引起肌肉抽动）。</li>
	<li>用对照载体对另一侧肢体重复上述操作。</li>
	<li>将小鼠从麻醉状态中取出，置于设定为37 °C的加热垫上使其恢复。待其完全苏醒后，将其放回笼中。</li>
</ol>
3. EDL 注射/电穿孔
<ol>
	<li>将小鼠仰卧固定，通过视觉观察和轻柔触诊定位胫骨前嵴。
	<ol>
		<li>使用解剖刀，在胫骨前嵴外侧、膝关节下方5 mm至趾长伸肌（TA）肌腱结合部上方2 mm处，沿皮肤做一浅层切口。</li>
		<li>使用小型剪刀钝性分离筋膜，暴露趾长伸肌（TA）肌肉。</li>
		<li>再次使用剪刀进行钝性解剖，通过将TA肌肉向外侧轻轻牵拉，将其与胫骨分离，从而暴露趾长伸肌（EDL）。在操作过程中可使用小型弯头镊子将TA肌肉保持在远离EDL的位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带有可拆卸30 G针头的50 µL微量注射器，将针头沿纵向插入趾长伸肌（EDL），直至针尖到达肌肉近端顶端。</li>
	<li>一边缓慢回撤针头，一边缓慢推动注射器活塞，沿注射路径注入10 µL质粒溶液（肌肉应出现肿胀）。</li>
	<li>设置计时器为1分钟，并测量EDL处腿部的厚度。根据小鼠体型不同，该值通常为5–10 mm。将卡钳电极调节至测得的厚度，并将电穿孔仪电压设定为12.5 V/mm。</li>
	<li>1分钟后，将卡钳电极置于下肢两侧，电极应贴合但不过紧。施加5次方波脉冲，每次持续20 ms，间隔200 ms（每次脉冲应引起肌肉抽动）。</li>
	<li>使用一次性4/0不可吸收尼龙缝线关闭切口。</li>
	<li>对另一侧肢体重复上述操作，或保留该侧肢体不做处理作为绝对对照。</li>
	<li>将小鼠从麻醉状态中移出，放置于设定为37 °C的加热垫上恢复。手术后立即皮下注射适当的镇痛剂&#160;，并在术后12–24小时再次给药。待小鼠恢复意识后，将其放回笼中。 
	注：先前研究表明，电穿孔后趾长伸肌（TA）立即出现肌肉收缩功能下降，且收缩功能在术后3天内逐渐恢复13,15。因此，对TA和EDL肌肉的组织学、蛋白表达或肌肉收缩功能分析应在电穿孔后3–10天进行。已有研究观察到EGFP的表达可持续长达术后3周13。</li>
</ol>

<ol><li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li>
<li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp27+inhibits+IKK%CE%B2-induced+NF-%CE%BAB+activity+and+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li>
<li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory%2C+Integregrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li>
<li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li>
<li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li>
<li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle%3A+studies+on+isolated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li>
<li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li>
<li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li>
<li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li>
<li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li>
<li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732(2015).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li>
<li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li>
<li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficacy%2C+longevity%2C+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li>
</ol>

B.A.H. 和 D.L.W. 声称不存在利益冲突。

体内基因转移结合电穿孔技术是一种用于调控肌肉中蛋白表达的有用且相对简便的工具。我们已展示了在趾长伸肌（EDL）和胫骨前肌（TA）中实现高效基因转移所需的操作步骤，并证实了术后仍可对EDL肌肉进行可行的收缩功能测定。该技术无需使用更复杂的病毒载体，且能够在单块肌肉内直接比较转染与未转染肌纤维的横截面积。该方法的一个局限性在于质粒构建物的摄取效率并非完全均一，部分肌纤维仍处于未转染状态。
上述方法不仅限于表达载体的电穿孔。我们先前已证明，通过使用siRNA或shRNA载体在体内进行相同操作，也可实现蛋白质的敲低in vivo14。此外，还可利用报告基因载体检测靶基因的转录活性2,4,22。这些工具可在单个骨骼肌中同时调控多种蛋白质，并使研究者能够方便地检测转录水平的变化。骨骼肌还可共转染表达载体或sh/siRNA载体与...

质粒DNA电穿孔导入骨骼肌 体内 是通过调控多种生理和病理生理条件下基因表达来评估骨骼肌生理学及分子信号变化的重要工具1,2,3,4,5,6,7,8,9早在1990年，Wolff 等人就已证明将基因转入骨骼肌的实验可行性，其中无需电穿孔即可成功转移RNA和DNA，并且荧光素酶的表达至少维持了2个月。10仅通过注射实现的转染效率相对较低，这一问题较为突出。Aihara 和 Miyazaki 在 1998 年通过将 pCAGGS-IL-5 质粒构建体电穿孔导入胫骨前肌（TA），并检测血清中 IL-5 的表达，证明了电穿孔可显著提高基因转导效率。11自那时以来，许多研究已针对不同DNA浓度、体积及电穿孔参数的效率进行了考察，以确保实现最高的基因转导效率。Mir 等人测试了多种电穿孔参数，包括电压、脉冲次数、脉冲持续时间与频率，以及DNA浓度，结果表明较高的电压、更多的脉冲次数和更高的DNA浓度均有助于提高电穿孔效率12较高的电穿孔电压存在一个主要缺陷：尽管它有助于增加DNA进入肌纤维的摄取量，但同时也会造成肌肉损伤，从而可能干扰实验结果。Schertzer等人的研究表明，在电穿孔后3天，200 V的电穿孔电压导致约50%的肌纤维受损，而50 V时仅有10%的肌纤维受损。13我们已综合考虑了影响高效DNA转导与肌肉损伤的相关变量，发现每厘米卡钳宽度施加125 V的电压足以实现有效的基因转导。
电穿孔后对肌纤维横截面积和整块肌肉收缩功能的分析，是评估基因调控引起肌肉大小和功能变化的方法中的重要环节。我们及其他研究者此前已证实，单独电穿孔导入对照载体不会导致肌纤维面积减小。在这些研究中，绿色荧光蛋白（EGFP）构建体可作为DNA转染的有效荧光指示剂13,14. 许多研究已对此进行了调查 原位 电穿孔后TA的收缩力表现出不同结果。一项研究表明，75 V/cm的电穿孔在电穿孔后3天导致强直收缩力下降约30%，而在电穿孔后7天，强直收缩力恢复至对照水平；而50 V/cm的电穿孔未对收缩力造成影响。13,15另一项研究表明，在180 V/cm电穿孔后3小时，强直收缩力下降了30%，但在7天后恢复至假手术组的收缩力水平16.
在以下详细步骤中，我们展示了将 pcDNA3-EGFP 质粒注射并电穿孔转染至小鼠胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）中的方法。我们同时证明该方法不影响 EDL 整块肌肉的收缩功能。本实验的目的是展示一种可实现质粒高效导入肌纤维且不导致功能丧失的技术。

<table><tbody><tr><td>4-0 尼龙缝线（不可吸收）</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>用于关闭皮肤切口的缝线</td></tr><tr><td>50&amp;micro;l Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>80501</td><td>微量注射器</td></tr><tr><td>C57BLl/6NHsd 小鼠</td><td>Envigo</td><td>044</td><td>12 周龄雌性小鼠，用于实验</td></tr><tr><td>卡尺电极</td><td>BTX</td><td>45-0102</td><td>1.0 cm × 1.0 cm 不锈钢电极</td></tr><tr><td>动态肌肉控制数据采集/分析系统</td><td>Aurora Scientific</td><td>605A</td><td>用于肌肉收缩力测量与分析的软件</td></tr><tr><td>ECM 830 电穿孔系统</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td>电穿孔仪</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>质粒纯化试剂盒</td></tr><tr><td>超窄剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>用于钝性解剖的剪刀</td></tr><tr><td>力传感器</td><td>Aurora Scientific</td><td>407A</td><td>用于测量趾长伸肌（EDL）产生的力量</td></tr><tr><td>微型蚊式止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13010-12</td><td>用于缝合的止血钳</td></tr><tr><td>pcDNA3.1 哺乳动物表达载体</td><td>Fisher Scientific</td><td>V79020</td><td>对照载体</td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP 表达质粒</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>用于表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒</td></tr><tr><td>Semken 弯头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td>用于手术操作的镊子</td></tr><tr><td>不锈钢手术刀片，10 号</td><td>Becton Dickinson</td><td>37 1210</td><td>手术刀片</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋介质</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>组织学冷冻包埋介质</td></tr><tr><td>麦胚凝集素-德克萨斯红（Wheat Germ Agglutinin-Texas Red）</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>W21405</td><td>用于肌肉横切面细胞膜染色</td></tr></tbody></table>

将质粒dna电穿孔导入小鼠骨骼肌

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

通过质粒电穿孔法瞬时调控小鼠骨骼肌基因表达，是评估正常与病理生理状态的有用工具。通过过表达或敲低目的基因，研究人员能够操控特定的分子事件，从而更深入地理解影响肌肉质量、肌肉代谢和收缩功能的机制。此外，编码荧光标签的DNA质粒经电穿孔导入后，可使研究人员在活体（in vivo）条件下检测骨骼肌中蛋白质亚细胞定位的变化。对骨骼肌的一项关键功能评估是肌肉收缩力的测定。在本实验方案中，我们证明在质粒DNA注射、电穿孔及基因表达调控之后，仍可进行完整的肌肉收缩功能研究。本操作指南的目的是逐步演示将DNA质粒电穿孔导入小鼠骨骼肌的方法，以促进其在胫骨前肌和趾长伸肌肌纤维中的摄取与表达，同时证明注射和电穿孔操作不会损害骨骼肌的收缩功能。

电穿孔技术可促进骨骼肌中的基因转移，是评估肌肉生理变化的一种有用方法。我们已展示了一种详细、逐步的操作流程，可用于实现胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）中高效的基因转导。转染效率的差异由多种变量引起，这些变量包括电穿孔参数（脉冲次数、电压、脉冲持续时间等）、基因构建体的大小以及注射DNA的浓度/体积。我们先前已证明，采用125 V/cm电压、每次脉冲持续20 ms、间隔200 ms、共5次脉冲的电穿孔参数，足以在TA肌肉中实现高效的基因转移14。在本研究中，我们还证明，在实验后3天，对EDL肌肉进行DNA注射和电穿孔操作不会导致肌肉收缩功能的丧失。
为了可视化基因转移，将 pcDNA3-EGFP 或 pcDNA3（对照）质粒通过电穿孔法导入小鼠胫骨前肌（TA）或趾长伸肌（EDL）。操作后 3 天，小心分离 TA 或 EDL 肌肉，置于最佳切割温度（OTC）包埋介质中，并在液氮冷却的异戊烷（2-甲基丁烷）中快速冷冻，方法如前所述14,<sup class="xref...

将质粒DNA电穿孔导入骨骼肌是一种在小鼠中调节基因表达而不影响肌肉收缩功能的有效方法。

将质粒DNA电穿孔导入小鼠骨骼肌

通过质粒电穿孔在小鼠骨骼肌中实现瞬时基因表达调控是评估正常与病理状态下基因功能的有用工具...

通过电穿孔介导的基因转移技术可简便高效地研究肌肉生理学变化。我们发现，电穿孔不会影响肌肉的收缩功能。在体内将基因构建体电穿孔导入肌肉是一种简单且高效的手段，无需将基因构建体进一步包装至病毒载体中。由于EDL所处位置较深且体积较小，因此对其进行可视化、分离和注射均较为困难。可在小鼠尸体上进行练习，并注射印度墨水等生物墨水，以帮助确认注射是否充分。本次操作演示将由我实验室的博士后Brian Hain完成。在注射小鼠之前，使用镊子检查其麻醉深度，确认趾夹反射消失以确定已达到手术麻醉水平，随后将小鼠转移至置于37摄氏度循环水板上的鼻罩中，以维持后续操作期间的麻醉状态。将小鼠仰卧位固定后，使用小型电推剪去除双侧后肢的毛发，然后用70%乙醇和碘伏交替消毒注射区域。注射时，于小腿外侧皮肤下可见胫骨前肌（tibialis anterior，TA）肌腱，定位该肌腱并标记TA肌的上端位置。然后将安装在50微升微量注射器上的30号针头以约五度的浅角插入肌肉，在肌腱结合部上方1至2毫米处进针，直至针头到达肌肉的上端。在沿注射路径缓慢拔出针头的同时推动注射器推杆，将50微升质粒溶液注入肌肉。此时肌肉应出现肿胀。将计时器设置为1分钟，测量小腿胫骨前肌（TA肌肉）处的厚度，然后将卡尺电极调整至所测得的厚度值。接着将电穿孔仪的电压设置为每毫米12.5伏。1分钟后，将卡尺电极紧密贴合下肢，但不要过紧，施加5个持续时间为20毫秒、间隔为200毫秒的方波脉冲。每次脉冲刺激时肌肉应发生抽动。使用对照质粒载体，对另一肢体重复上述操作。操作完成后，将小鼠从鼻罩中取出，并将其置于设定为37摄氏度的加热垫上，使其恢复。 恢复后，将小鼠放回笼中。将小鼠置于仰卧位，通过视觉观察和轻柔触诊定位胫骨前嵴。使用手术刀在胫骨前嵴外侧、膝关节下方5毫米至趾长伸肌肌腱结合部上方2毫米处，做一浅表皮肤切口。使用小剪刀钝性分离筋膜，暴露胫前肌（TA），然后用小弯镊轻轻牵拉肌肉，将TA肌与胫骨分离，以暴露趾长伸肌（EDL）。操作过程中需用小弯镊保持TA肌与EDL肌分离。将30号针头沿纵轴方向插入EDL肌，直至针头到达肌肉上端，随后注入10 µL质粒溶液，注射方法如前所示。EDL 肌肉应出现肿胀。测量 EDL 处腿部的厚度，并将游标卡钳电极调整至测得的厚度，以如前所述递送五个方波脉冲。操作完成后，使用一次性不可吸收的 4-0 尼龙缝线关闭切口。随后将小鼠从鼻罩中取出，置于设定为 37 摄氏度的加热垫上使其恢复。手术后立即皮下注射适当的镇痛剂，并在手术后 12 至 24 小时再次给药。待小鼠恢复后，将其放回原饲养笼中。在将 pcDNA3-EGFP 质粒注射并电穿孔至胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）后，观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达，表明肌肉纤维已摄取DNA。在较低放大倍数下成像时，可通过绿色纤维与黑色纤维的对比观察到EDL

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科研

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生物学

将质粒DNA电穿孔到小鼠骨骼肌中

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诱导多能干细胞来源的类血管壁细胞样肌源性前体细胞在小鼠肌肉再生模型中的移植

软脑膜表面是中枢神经系统中一个独特的前体细胞区域，正受到越来越多的关注。本文详细介绍了一种利用改良电穿孔技术快速进行该前体区域遗传操作的方法。该方法可用于研究细胞谱系和参与细胞分化过程的信号通路，进而阐明子代细胞的命运及其生物学特性。...

新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

本文描述了小鼠睾丸的显微注射与电穿孔技术 在 体内...

体内 小鼠睾丸显微注射与电穿孔

本方案利用电穿孔技术将荧光标记的蛋白质导入小鼠肌纤维并使其表达。电穿孔后经恢复，分离肌纤维。随后使用高分辨率共聚焦显微镜对单根纤维进行成像，以观察肌肉结构。...

DNA电穿孔、肌纤维的分离与成像

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通过电穿孔法将质粒DNA递送至小鼠膀胱尿路上皮的新方法

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颅顶耳长肌体内联合电穿孔与短期再神经支配

在此，我们介绍一种基因治疗策略，通过骨内注射将ABE包被的壳聚糖直接递送至骨髓。...

使用壳聚糖纳米颗粒包裹的腺嘌呤碱基编辑器质粒进行骨内注射以增强基因递送与表达

学习电穿孔介导的基因转移技术在小鼠骨骼肌中的应用，该方法无需病毒载体即可高效递送质粒DNA。研究表明此技术不影响肌肉收缩功能，可用于肌肉生理学和基因表达调控研究。

将质粒DNA电穿孔导入小鼠骨骼肌

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