将质粒DNA电穿孔到小鼠骨骼肌中
2022年4月6日
将质粒DNA电穿孔到骨骼肌中是一种在不损害小鼠肌肉收缩力的情况下调节基因表达的可行方法。
电穿孔介导的肌肉基因转移是研究肌肉生理学变化的一种简单而有效的技术。我们发现电穿孔不会影响肌肉收缩力。在体内将基因构建体电穿孔到肌肉中是一种简单而有效的过程，不需要将基因构建体更广泛地包装成病毒载体。
由于EDL的位置和小尺寸，很难可视化，分离和注入EDL。在小鼠尸体上练习并注射生物墨水（如印度墨水）可能有助于提供充分注射的证据。演示该过程的将是布莱恩·海恩，我实验室的博士后。
在注射小鼠之前，使用镊子确认手术麻醉平面，没有脚趾捏反射，然后将鼠标转移到鼻锥上，停留在37摄氏度的循环水板上，用于其余的程序。将鼠标置于仰卧位后，使用小毛剪从后肢上取下头发，然后用交替的70%乙醇和甜菜碱消毒注射区域。对于注射，定位胫骨前部或TA肌腱，通过小腿外侧的皮肤可见，并标记TA肌肉的上端。
然后将安装在50微升微量注射器上的30号针头以较浅的五度角插入肌肉中，该角度比肌腱连接处高出一到两毫米，直到针头到达肌肉的上端。按下柱塞，同时沿注射路径缓慢缩回针头，将50微升质粒溶液输送到肌肉中。肌肉应该肿胀。
将计时器设置为一分钟，并测量TA肌肉处腿部的厚度，然后将卡钳电极设置为测量的厚度。然后将电检出器电压设置为每毫米12.5伏。一分钟后，将卡钳电极紧紧地放在下肢周围，不要过于紧绷，以20毫秒的持续时间和200毫秒的间隔提供五个方波脉冲。
肌肉应该随着每个脉搏而抽搐。使用对照质粒载体对另一肢重复该过程。完成后，将鼠标从鼻锥上取下，让鼠标在设置为37摄氏度的加热垫上恢复。
恢复后，将鼠标放回笼子。当鼠标处于仰卧位时，通过视觉和轻柔心悸定位胫骨前嵴。使用手术刀在胫骨前嵴外侧的皮肤上做一个浅切口，该切口位于膝关节以下五毫米至TA肌腱交界处上方两毫米处。
在小剪刀的帮助下，钝地解剖筋膜，暴露TA肌肉，然后通过拉动肌肉以揭示长指伸肌或EDL，轻轻地将TA肌肉与胫骨分开。在手术过程中，使用小弯曲的镊子保持TA与EDL的透明。将30号针纵向插入EDL，直到针头到达肌肉的上端，并如前所述注入10微升质粒溶液。
EDL 肌肉应肿胀。如前所述，在EDL处测量腿部的厚度，并将卡钳电极设置为测量的厚度，以提供五个方波脉冲。完成后，使用一次性4-0不可吸收的尼龙缝合线关闭切口。
然后从鼻锥上取下鼠标，让它在设置为37摄氏度的加热垫上恢复。手术后立即给予适当的皮下镇痛药，术后 12 至 24 小时服用。一旦恢复，将鼠标放回家笼。
在TA和EDL肌肉中注射和电穿孔pcDNA3-EGFP质粒后，观察到GFP表达表明肌肉纤维中的DNA摄取。当以较低的放大倍率成像时，可以通过绿色纤维与黑色纤维的外观来可视化EDL肌肉转染效率。与对照未注射或电穿孔的肌肉相比，注射和电穿孔的EDL在100赫兹时具有相似的破伤风反应。
与未触及的对照组相比，注射和电穿孔的EDL，破伤风肌力，特定的破伤风肌力，峰值张力和一半的松弛时间没有受到影响。准确鉴定要注射的肌肉并有效递送质粒溶液非常重要。可以使用该协议进行许多组织和生化测量。
可以进行靶蛋白细胞定位，靶基因敲低，转录报告基因和一系列组织染色。该技术已被用于识别生理和病理生理条件下肌肉中分子信号传导的大量变化。使用该技术研究基因转移后的肌肉收缩力是可行的。
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概述
本研究探讨了以电穿孔为介导的基因转移技术在骨骼肌中调节基因表达。使用小鼠作为模型系统，研究结果表明，此方法不会损害肌肉收缩性并能有效地将质粒DNA直接传递到肌肉组织中。
关键研究组成部分
研究领域
- 基因转移技术
- 肌肉生理学
- 电穿孔方法
背景
- 电穿孔是一种用于基因递送的技术。
- 基因构建体可以在不使用病毒载体的情况下注射。
- 由于肌肉大小和位置，成功的肌肉注射面临技术挑战。
使用的方法
- 在胫前肌和长伸肌中进行电穿孔和质粒注射。
- 小鼠模型（C57BL/6 品系）。
- 电穿孔电压设置、手术程序和恢复协议。
主要结果
- 电穿孔后肌肉收缩性保持完整。
- GFP 表达表明质粒摄取成功。
- 强直反应和其他肌肉力测量与对照肌肉一致。
结论
- 电穿孔技术允许有效的基因转移而不会对肌肉功能产生不良影响。
- 该方法可以推进肌肉生理学和基因表达调节的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Electroporation-mediated plasmid delivery into mouse skeletal muscle enables rapid, non-viral gene modulation for functional target validation and mechanistic studies. This approach supports predictive confidence in muscle biology by allowing direct interrogation of gene function without compromising contractility. The method is positioned for early discovery and preclinical research, facilitating portfolio decisions in muscle-targeted therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct overexpression or knockdown of target genes in vivo for functional validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in muscle mass, metabolism, and contractility.
- Facilitates rapid hypothesis testing without the need for viral vector development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated muscle systems for downstream contractility and molecular assays.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining muscle function post-electroporation.
- Allows quantitative assessment of gene modulation effects using fluorescent reporters and contractility measurements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling gene manipulation in physiological and pathophysiological muscle states.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation through in vivo functional readouts.
- Provides translational biomarker opportunities via protein localization and contractility outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This electroporation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling gene function studies, target validation, and mechanistic de-risking in muscle biology.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by modulating gene expression in situ.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as GFP expression and contractility metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting functional and molecular biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, non-viral platform for gene modulation across muscle research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with a standardized, scalable, and reproducible gene delivery method.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling rapid functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of muscle-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery and muscle anatomy for accurate plasmid delivery.
- Needs access to electroporation instrumentation and fluorescence imaging for endpoint analysis.
- Demands cross-team standardization to ensure reproducibility of gene delivery and functional assays.
- Adaptable to various muscle groups but may require protocol optimization for different tissues.
- Limited to transient gene expression; not suitable for long-term or systemic modulation without further adaptation.
