用于在细胞水平上探测真菌 - 微生物相互作用的微流体工具

由于土壤的不透明度，其组成微生物之间的相互作用不能用细胞分辨率轻松可视化。在这里，介绍了两种微流体工具，它们为研究真菌 - 微生物相互作用提供了新的机会。这些器件用途广泛且易于使用，可在细胞水平上实现高时空控制和高分辨率成像。

使用所提出的微流体装置，我们可以通过精确的空间和环境控制以及单细胞水平的高分辨率成像来检查真菌与其他微生物之间的动态相互作用。重要的是，真菌的生长可以被限制和引导在微流体通道内。能够获得高质量的延时图像。

因此，可以探索真菌 - 真菌和真菌 - 细菌相互作用的复杂性。了解真菌微生物相互作用是定义和保护土壤微生物组的重要步骤。这些知识可用于开发具有可持续农业的新型生物防治剂。

首先，制备约40克聚（二甲基硅氧烷）或PDM，方法是在干净的塑料杯中使用刮刀以10比1的比例将碱和固化剂彻底混合。要去除所有气泡，请将杯子放入真空室中一小时。接下来，使用透明胶带将母模固定在塑料支架中，并使用压缩过滤空气去除任何灰尘颗粒，然后将PDM倒入主模的中心并使其沉降。

为了防止灰尘颗粒在PDM表面上沉降，用塑料盖松散地覆盖主模具，然后将主模具转移到烤箱中并在70摄氏度下固化过夜。从烤箱中取出主模并使其冷却后，将固化的PDM从主模和塑料框架上剥离，而不会损坏PDM中的主模。然后，为了保持无尘表面，将透明胶带放在压花到PDM中的微通道上。

接下来，使用安装的断头台或剃须刀片将PDM切割成设计指定的板坯。当切割用于细菌 - 真菌相互作用装置或BFI装置的PDM板的横向开口时，确保微通道完全打开。但是，对于用于组装真菌 - 真菌相互作用装置或FFI的PDM板，应修剪每个角，使其适合玻璃底培养皿。

接下来，使用精密切割机根据设备设计冲孔或出孔。接下来，将PDM板浸入0.5摩尔氢氧化钠溶液中。在将板坯转移到70%乙醇溶液中之前，用无菌的双蒸馏水冲洗板坯。

除去乙醇并再次用双蒸馏无菌水冲洗板坯后，将板浸入无菌双蒸馏水和超声处理液中五分钟，然后从水中取出PDM板，用压缩过滤空气干燥，并将其置于无菌方形培养皿中。接下来，将培养皿与PDM板一起在70摄氏度的烤箱中孵育一小时。一旦板坯在无尘环境中冷却，使用胶带和压缩过滤空气清除其表面的任何灰尘。

要激活PDM板和玻璃底培养皿的表面，随后将它们粘合在一起，将它们放在等离子体清洁器中，要激活的表面朝上。从等离子体清洁器中取出培养皿中的PDM板后，通过将激活的表面彼此保形接触来轻轻粘合它们。将BFI和FFI PDMs板分别与直径为35毫米和55毫米的培养皿粘合，以检查粘合成功，请尝试用镊子将PDM实验室从其培养皿上拉下来。

用眼睛或普通显微镜仔细观察设备，以确保接种入口或微通道不会塌陷。对于水饱和或营养丰富的条件，移液100微升所需的溶液，以在粘合后立即填充BFI设备。对于 FFI 设备，在每个入口中加入 30 微升介质。

最后，向培养皿中加入100至200微升无菌双蒸馏水以保持湿度。但是，对于水不饱和条件，只需向培养皿中加入100至200微升无菌双蒸馏水即可保持湿度。对于真菌接种，在层流罩内，使用无菌的软木螟，从三天龄培养物外围的菌落中取出琼脂塞，确保保持生长的菌丝前部完好无损。

然后将琼脂塞引入BFI和/或FFI装置的真菌入口，菌丝体一面朝下，在菌丝体前部朝向微通道开口，以鼓励通道的菌丝浸润。对于FFI设备，将另一个带有第二种真菌的琼脂塞引入相反的入口。接下来，用透明薄膜密封培养皿，并在25至28摄氏度的黑暗中孵育，直到成像。

对于细菌接种，从培养箱中取出BFI装置后，在无菌环境中将10微升细菌悬浮液移液到细菌入口中。用透明薄膜密封培养皿后，将设备直立存放在25摄氏度的黑暗中，直到成像开始。使用该协议，可以成功可视化真菌Coprinopsis cinerea和枯草芽孢杆菌之间的相互作用。

观察到在细菌存在的情况下，在共同接种约五个小时后，真菌的生长速率开始急剧下降。此外，与细菌相关的真菌菌丝具有薄而透明的外观。延时荧光显微镜检查还显示，枯草芽孢杆菌共接种5小时后真菌菌丝塌陷。

然而，从六个小时开始，细菌数量也开始下降。真菌 - 真菌相互作用的可视化表明，镰刀菌强烈抑制了红木霉的生长，这在荧光显微镜下很明显。该方案进一步揭示了在细菌Synxantha假单胞菌和荧光假单胞菌存在的情况下真菌黄萎病的显着形态学变化。

该研究中使用的高分辨率动态成像技术还揭示了在真菌Clonostachys rosea存在的情况下，禾谷镰刀菌中的隔膜形成。荧光标记提供了FFI装置中玫瑰梭菌菌增殖的动态定量。这些设备可以由用户进行调整和修改，以结合感兴趣的不同物种，并解决其关于真菌微生物相互作用的特定实验问题。

BFI和FFI设备都推动了科学前沿，揭示了真菌如何在真菌，病毒，线虫的攻击下传播防御信号和营养物质，并能够对细菌传播进行研究。