Name: 用于在细胞水平上探测真菌 - 微生物相互作用的微流体工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 探索微流控技术在细胞水平上研究真菌与微生物相互作用的应用。该方法利用高分辨率延时成像技术，精确控制空间环境，揭示土壤微生物组的动态过程，为可持续农业开发生物防治剂提供重要依据。

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我们感谢伦敦帝国理工学院生物工程系和利华休姆信托基金（研究资助编号：RPG-2020-352）提供的经费支持。

注意：本方案中所述步骤的摘要以图2直观展示。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig02.jpg" /> 
图2：本方案中所述方法的示意图，包含五个主要部分。 使用计算机辅助设计（CAD）软件创建器件设计，并通过光刻技术制造主模具（1）。利用该模具浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS），随后将PDMS切割成片状，并键合至底部为玻璃的培养皿上，形成微流控器件（2）。将研究中涉及的微生物进行培养（3），并用于接种器件（4）。通过显微镜观察相互作用，并结合图像分析技术进行量化分析（5）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 主模具制备
<ol>
	<li>光刻掩模制作
	<ol>
		<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件生成微流控装置的设计图。所示装置的尺寸见图1，有关具体设计特征的更多细节在相应出版物中已有全面列出40,41。</li>
		<li>以合适的格式（例如 .dwg、.dxf）导出CAD设计文件。将导出的CAD设计文件发送至商业供应商，用于打印胶片光刻掩模。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光刻 
	注意：以下步骤应在无尘且光照可控的环境中进行，例如层流罩或洁净室设施内。此处提供的实验条件仅作为参考，需在实验室内进行优化。作者建议接受专门培训并参考已建立的实验方案42。
	<ol>
		<li>将100 mm硅片置于烘箱中，在200 °C下烘烤2小时。使用SU-8 2010光刻胶对硅片进行旋涂，目标厚度为10 µm，旋涂条件如下：500 rpm下旋转10秒（加速度100 rpm/s），随后3,000 rpm下旋转45秒（加速度300 rpm/s）。 
		警告：SU-8光刻胶具有危害性，操作时应小心，避免吸入及皮肤接触。该物质易燃，可能具有致癌性，并对环境有毒。</li>
		<li>将涂覆光刻胶的硅片在95 °C下烘烤2.5分钟（前烘）。使用胶片光刻掩模和掩模对准器，在365 nm波长下以140 mJ/cm2的能量剂量对光刻胶进行紫外（UV）曝光。</li>
		<li>将涂覆光刻胶的硅片在95 °C下烘烤3.5分钟（曝光后烘烤）。将硅片浸入显影液中并轻轻振荡3分钟，以去除未曝光区域的光刻胶，从而显现出微加工结构。 
		警告：显影液可能易燃，操作和储存时应采取适当预防措施。</li>
		<li>用新鲜显影液冲洗10秒。再用异丙醇冲洗10秒，然后用空气干燥。使用过滤后的压缩空气确保结构完全干燥。例如可使用台阶仪测量SU-8结构的高度。</li>
		<li>通过施加50 mbar的真空压力，使用50 µL三甲基氯硅烷对每个母模进行硅烷化处理，持续2小时。作者指出，母模无需重复硅烷化处理。 
		警告：三甲基氯硅烷为危险物质。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），小心处理，避免与皮肤和眼睛接触，防止吸入。远离点火源，并在通风良好的区域使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 器件制备
注意：以下步骤应在无尘环境中进行，例如在层流罩内。
<ol>
	<li>聚二甲基硅氧烷（PDMS）平板的制备
	<ol>
		<li>在洁净的塑料杯中，使用刮刀以10:1的比例充分混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基液与固化剂，制备约40 g PDMS。将装有PDMS混合物的塑料杯置于真空干燥箱中，在50 mbar的真空压力下脱气1小时，以彻底去除所有气泡。</li>
		<li>用透明胶带将主模具固定在塑料支架上。使用压缩过滤空气清洁，以去除任何灰尘颗粒。 
		注意：也可将铝箔包裹在玻璃培养皿周围，然后用其承载主模具并容纳PDMS43.</li>
		<li>将PDMS混合物倒入主模具的中心位置，确保其处于水平表面，并静置使其自然流平。 
		注意：应将PDMS混合物尽可能靠近母模表面倾倒，并保持连续流动，以尽量减少气泡的引入。可通过将压缩空气吹向气泡表面，或使用细针挑出的方式去除气泡。</li>
		<li>用塑料盖 loosely 盖住母模，以防止灰尘颗粒沉降到 PDMS 表面。将母模转移至烘箱中，在以下条件下过夜固化： 70 &#176;C.</li>
		<li>从烘箱中取出母模并使其冷却。小心地将固化的PDMS从母模和塑料框架上剥离，注意避免损坏母模或PDMS。</li>
		<li>在PDMS上微通道的凸起部分覆盖透明胶带，以保持表面无尘。在键合前需确保移除胶带。</li>
		<li>使用装有刀片的切片器或剃刀刀片，按照模具设计将PDMS切割成块状（例如，若主模具的设计中包含多个装置，则可从一次浇铸中制备多个装置）。切割BFI PDMS块的侧向开口时，确保微通道完全打开图1A）。对于FFI PDMS平板，确保修剪每个角落，以便其能够放入所示的玻璃底培养皿中 图1D.</li>
		<li>根据装置设计冲压所需的入口/出口孔。使用精密冲孔器分别为示例BFI装置和FFI装置冲压3.18 mm和4.75 mm的入口孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS 板材键合以制备器件 
	注意：以下洗涤步骤（2.2.1–2.2.2）使用装有纯化水（ddH₂O）的超声波清洗器2O）在 37 kHz 条件下。清洗 PDMS 块有助于增强成功键合44 并降低污染风险。操作PDMS切片时，应使用洁净的镊子，并通过进样孔进行夹取，以避免对微通道或器件表面造成损伤。
	<ol>
		<li>将PDMS切片浸入0.5 M NaOH溶液中，超声处理5 min。用无菌ddH₂O冲洗。2O. 将PDMS板转移至70%乙醇溶液中，超声处理5 min，然后用无菌ddH₂O冲洗。20.</li>
		<li>将PDMS平板浸入无菌ddH₂O中2O，并超声处理5分钟。将PDMS板从无菌ddH2用过滤的压缩空气吹干，然后放入无菌的方形培养皿中。</li>
		<li>将含有PDMS切片的方形培养皿放入烘箱中 70 &#176;C 干燥1小时。从烘箱中取出，在无尘环境中冷却。使用胶带和/或过滤的压缩空气清除PDMS平板表面的灰尘。</li>
		<li>使用等离子清洗仪激活待键合的PDMS板和玻璃底培养皿表面，设置参数如下：真空压力0.75 mbar，功率50%，处理时间1 min。将待激活（随后用于键合）的表面朝上放置于等离子清洗仪中。</li>
		<li>从等离子清洗机中取出PDMS块和底部为玻璃的培养皿，通过轻轻将活化后的表面相互贴合，使其紧密接触并键合。将BFI和FFI的PDMS块分别键合至直径为35 mm和50 mm的玻璃底培养皿（玻璃厚度0.17 mm）。 
		注意：键合时切勿施加过大压力，以免导致微通道塌陷。</li>
		<li>用镊子尝试将PDMS块从玻璃底培养皿上剥离，以检查粘合是否成功。通过肉眼或普通显微镜观察装置，确保接种入口或微通道无塌陷。 
		&#8203;注意：对于饱和条件（即水饱和和/或营养丰富的条件），需包含方案中的步骤 2.2.7。若需要非饱和水分条件，则进行至步骤 2.2.8。装置可填充水或培养基。</li>
		<li>键合后立即用移液法向装置中填充液体 100 &#181;L 目标溶液的BFI装置（细菌入口和侧向开口） 30 &#181;L 每孔加入培养基（60 &#181;L 总时间）用于FFI设备。如果存在气泡，由于PDMS具有多孔性，气泡将在填充后约10分钟内消散。</li>
		<li>加入无菌的ddH₂O2O（约100-200 &#181;L在培养皿中保持湿度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微生物培养
注意：以下步骤提供了真菌和细菌培养的一般微生物学操作流程，应在无菌条件下（即使用火焰或微生物安全柜）进行，且所采取的防护等级应符合目标微生物所需的 containment 水平。在每一节末尾提供了针对特定目标物种的具体示例。
<ol>
	<li>真菌培养
	<ol>
		<li>制备添加琼脂的所需培养基。在121 °C下高压灭菌15分钟。待培养基冷却至50 °C后，在无菌条件下倒入直径为9 cm的培养皿中。</li>
		<li>使用打孔器从冰箱保存的菌株斜面中取出含有菌丝的4 mm直径琼脂块，以活化该菌株。此步骤旨在确保真菌在接种装置前实现标准化且旺盛的生长。 
		注意：微生物也可从甘油保存液中活化，即保存在含50%甘油溶液中的琼脂块，于-70 °C保存41。</li>
		<li>将带有菌丝的一面朝下，置于未接种培养皿中央的琼脂表面。盖上皿盖并密封，随后在适合目标菌株的温度下培养所需时间，通常约为3至4天。 
		注意：Trichoderma rossicum 的示例培养条件：麦芽提取物琼脂培养基，25 °C避光培养48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌培养
	<ol>
		<li>从原始保存菌种（如甘油保存液或琼脂平板上的单菌落）中挑取目标细菌菌株，在琼脂平板上划线以获得单菌落，并确保无污染45。用封口膜密封平板。</li>
		<li>在目标菌株所需的特定温度和时间条件下进行培养，直至观察到单个菌落。</li>
		<li>制备所需的液体培养基。例如，每1 L ddH2O中加入10 g胰蛋白胨、10 g NaCl和5 g酵母提取物，以制备用于B. subtilis培养的LB培养基。在121 °C下高压灭菌15分钟。</li>
		<li>待培养基冷却至室温后，在无菌环境下将其加入无菌的培养瓶中。</li>
		<li>使用无菌接种环接触琼脂平板上的单个细菌菌落，然后将接种环轻轻接触液体培养基表面，将菌体转移至其中。</li>
		<li>用无菌瓶盖或铝箔密封培养瓶，并在摇床培养箱中过夜培养，设置条件需适用于所选菌种。 
		&#8203;注意：B. subtilis 的示例培养条件：i) 液体培养——在LB培养基中，37 °C、200 rpm有氧培养；ii) 平板培养——在LB琼脂平板上室温培养。有关不同真菌菌株培养的更多细节，请参见FFI/BFI相关论文40,41。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 装置接种
注意：以下步骤应在使用无菌设备的层流罩内进行。
<ol>
	<li>真菌接种
	<ol>
		<li>使用已灭菌的打孔器（ø = 4 mm）从培养3天的菌落边缘切取一块琼脂块（步骤3.1），确保生长中的菌丝前端保持完整。</li>
		<li>将琼脂块接种至真菌入口，菌丝面朝下，菌丝前端的生长方向朝向微通道开口，以促进菌丝侵入通道。</li>
		<li>若使用FFI装置，对第二种真菌重复步骤4.1.1–4.1.2，将琼脂块接种至相对的入口；若使用BFI装置，则跳过此步骤，继续进行步骤4.1.4。</li>
		<li>用透明封口膜密封培养皿，并在黑暗条件下于25–28 °C培养，直至开始成像。根据拟观察的生物学事件（如真菌-真菌相互作用）以及真菌在装置内的生长速率，确定成像前的培养时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌接种
	<ol>
		<li>将过夜培养的细菌（步骤3.2）用步骤3.2.3中所述的相同培养基按1:25比例稀释，于37 °C培养3小时。</li>
		<li>将菌液在2000 x g 条件下离心10分钟以收集菌体，弃去上清液，用所需体积的0.9% w/v氯化钠溶液重悬菌体。</li>
		<li>再次离心以获得菌体沉淀，弃去上清液，将菌体重悬于液体培养基中（例如，C. cinerea 最小培养基，调整至OD600为1），并根据具体细菌菌株优化OD600值。</li>
		<li>将BFI装置从培养箱中取出，在无菌环境中打开，用移液器将10 µL菌悬液加入细菌入口。 
		&#8203;注意：应针对具体的细菌-真菌相互作用优化接种时间。例如，若使用C. cinerea，可在真菌接种后18小时将细菌引入BFI装置。</li>
		<li>用透明封口膜密封培养皿，在黑暗条件下于25 °C培养，直至开始成像。装置需直立存放。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 显微镜观察与图像分析
<ol>
	<li>显微镜技术 
	注意：研究人员应根据实验性质选择合适的成像方法，例如倒置宽场落射荧光显微镜或共聚焦显微镜。此处提供一般性概述，具体细节将取决于所选显微镜系统的特性。
	<ol>
		<li>打开显微镜计算机、显微镜主机（如适用）、相机、温控培养箱和光源。确保显微镜已正确设置，例如已正确调节科勒照明以实现样品的均匀照明。启动成像软件程序。 
		注意：使用温控培养箱时，实验开始前需让显微镜温度平衡数小时。</li>
		<li>将微流控装置安装到载物台插槽中。确保装置已牢固固定（例如使用胶带），以防止在载物台移动过程中装置移位。</li>
		<li>获取接种后装置的图像，例如单时间点或时间延时实验图像。有关BFI和FFI装置实验所涉及的详细成像参数，已在前述相应出版物中提供40,41. 
		注意：明场图像通过相位对比显微镜获取，利用自动对焦软件结合10倍放大、0.30数值孔径（NA）或20倍放大、0.45数值孔径（NA）物镜，以观察菌丝在生长通道中的增殖情况。荧光报告蛋白的激发采用高功率发光二极管光源系统，其波长与所用荧光染料相匹配。</li>
		<li>将图像导出为适合后续图像处理的格式，例如 .tiff。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析 
	注：作者推荐使用 Fiji46 作为图像分析工具，但也可使用其他软件包。以下是利用Fiji软件对已发表的BFI和FFI装置研究中的图像进行分析的示例。这些步骤针对Mac系统，若使用PC可能略有不同。
	<ol>
		<li>菌丝生长速率测定 
		注意：本方法已在BFI论文稿件中使用40 用于测量单个菌丝的生长速率。
		<ol>
			<li>下载、安装并启动 Fiji。通过选择导入延时实验中的图像序列 文件 &#62; 导入 &#62; 图像序列. 找到存储数据的文件夹并选择 开放. 在 序列选项 窗口，选择 偏好设置，然后 好的.</li>
			<li>选择 直线 从主工具栏中选择图标。通过点击并同时拖动光标至窗口内的另一位置，将直线的起点定位在生长中的菌丝尖端。一条黄色直线将随之出现，线上有三个方框，分别标示直线的起点、中点和终点。</li>
			<li>按住以移至图像序列中的下一帧 Ctrl 和 &#62;将直线末端置于生长菌丝的尖端，方法是选择并拖动方形框至正确位置。</li>
			<li>按压并保持 Ctrl 和 M 以像素为单位测量线条的长度。A 结果 窗口将显示测量数据。按以下方式定义结果窗口中显示的数据：单击 结果 窗口，然后选择 结果 &#62; 设置测量参数.</li>
			<li>按住以移至图像序列中的下一帧 Ctrl 然后 &#62;将直线的起点定位在生长菌丝的顶端，方法是选择并拖动方形框至正确位置。</li>
			<li>按压并保持 Ctrl 然后 M 以像素为单位测量线条的长度。A 结果 将出现一个窗口，显示测得的数据。</li>
			<li>重复步骤 5.2.1.5–5.2.1.6，直至完成对菌丝生长像素的测量。</li>
			<li>选择数据中的全部内容 结果 将数据复制并粘贴到其他软件程序（例如电子表格）中进行处理。以时间为横坐标，菌丝生长长度（单位为像素或微米）为纵坐标作图，并计算平均生长速率。每项实验至少进行三次生物学重复。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>荧光强度测量 
		注意：本方法已用于FFI发表的文章中41 评估菌丝中荧光强度的变化 Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP 在接触时 Clonostachys rosea 016 随时间的变化函数。
		<ol>
			<li>下载、安装并启动 Fiji。通过选择从延时实验中导入图像序列 文件 &#62; 导入 &#62; 图像序列. 找到存储数据的文件夹并选择 打开. 在 序列选项 窗口选择 偏好设置 然后 好的.</li>
			<li>使用主工具栏中的矩形工具，指定一个感兴趣区域（ROI），用于测量菌丝的绝对荧光强度。该正方形的大小可精确设定如下： 编辑 &#62; 选择 &#62; 指定；也可以通过选择将该区域保存至区域管理器（ROI Manager）中，以供日后参考 编辑 &#62; 筛选 &#62; 添加到管理器.</li>
			<li>测量整个图像序列或图像堆栈中每幅图像所定义的 ROI 内的绝对荧光强度（平均灰度值），步骤如下： 图像 &#62; 堆叠 &#62; 测量堆栈。该 结果 当图像堆栈中的所有图像处理完毕后，窗口将自动打开。 
			注意：显示在下方的数据 结果 窗口可定义如下：单击 结果 窗口，然后选择 结果 &#62; 设置测量参数确保 平均灰度值 已选定。</li>
			<li>选择数据中的所有内容 结果 窗口中复制并粘贴到其他软件程序（例如电子表格）中，以绘制指定 ROI 的绝对荧光强度随时间变化的曲线。</li>
			<li>重复步骤 5.2.2.2–5.2.2.4，以获取每个 ROI 的绝对荧光强度测量值，即在目标菌丝上、目标菌丝旁或相应对照通道内的区域。</li>
			<li>以任意单位（AU）计算适当的相对荧光强度，例如将目标菌丝 ROI 的绝对荧光强度除以对照通道 ROI 的绝对荧光强度。请参考 FFI 相关文献41 有关更具体的细节。</li>
			<li>每个实验至少进行三次生物学重复，并将相对荧光强度随时间的变化绘制成图。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文介绍了一种利用通道微流控技术研究真菌-微生物相互作用的实验方案。作者旨在展示这些装置的多功能性，并鼓励根据研究人员的兴趣进行相应改进和应用。通过使用BFI和FFI这两种典型装置，可以比以往更详细地研究真菌-微生物之间的相互作用。通过消除土壤背景的复杂性和异质性，调控菌丝生长使其局限于单层结构，并精确控制环境参数，能够随时间连续获取这些生物学事件的高分辨率图像。利用这些装置，可通过生长速率、荧光定量以及形态特征的观察性生物成像等方法，对微生物伙伴之间的相互作用进行表征。
可以设计设备以实现对真菌-微生物相互作用在细胞水平上的表征。由于其设计灵活且易于操作，非专业人员也可使用本方案，适用于广泛的研究问题。BFI 和 FFI 设备具有透明特性和玻璃结合表面，可适配多种显微镜，满足不同的实验目标。设备在结构设计和理化参数方面均可定制；例如，湿度、温度或通道饱和度可改变测试对象所处的环境条件。此外，可通过设计通道结构、尺寸或引入障碍物等方式，使设备在物理上引导生物生长或诱发特定行为，如相互作用事件或导航策略。而现有的方法（如琼脂平板实验）则无法实现此类功能<sup class="xref...

土壤是一种极为多样的环境，含有丰富的微生物，这些微生物在碳循环和磷循环中发挥着重要作用1,2。丝状真菌是多种生态系统的重要组成部分，能够分解有机物和无机物，并通过与植物形成共生关系促进植物营养吸收3,4。在土壤中，真菌与其他多种微生物（如其他真菌5、细菌6、病毒7和线虫8）之间存在动态相互作用。这些相互作用对土壤健康和植物健康具有重要影响。然而，由于缺乏能够以高分辨率成像微生物相互作用的合适实验系统，许多相互作用至今仍未被明确界定。
关于细菌-真菌相互作用（BFIs）和真菌-真菌相互作用（FFIs）的研究在多个领域具有重要应用价值，包括医学中的抗菌药物开发以及农业中的生物防治剂。例如，真菌Coprinopsis cinerea可产生一种名为copsin的多肽，已被证实对人类病原体Listeria monocytogenes9具有抗菌活性。类似地，来源于真菌的化合物灰黄霉素（griseofulvin）被广泛用于治疗人类真菌感染，同时还可抑制植物病原真菌Alternaria solani10,11的生长。此外，多种土壤生Bacillus subtilis菌株也已被证明对植物病原真菌Rhizoctonia solani12,13具有良好的生物防治效果。然而，由于传统研究方法存在局限性，目前在单细胞水平上对BFIs和FFIs的理解仍然十分有限。
传统研究通常在宏观尺度上利用含有两种或多种物种对峙培养的琼脂平板来探索细菌-真菌相互作用（BFIs）和真菌-真菌相互作用（FFIs）。通过测量对峙物种的生长速率和代谢产物生成来评估它们的相互作用14,15,16；然而，该方法仅能解析到菌落水平。为了在细胞水平上研究这些相互作用，可将细菌和真菌接种物培养在涂有琼脂的玻璃显微镜载片上，随后在显微镜下成像17。然而，由于缺乏空间限制，使用载片难以追踪单根菌丝，导致难以获取时间序列图像。此外，在此类实验装置中，无法实现将其他微生物精确地限制在菌丝体的特定区域，或建立可被扰动的明确定义的化学环境。土壤的“黑箱”特性也进一步增加了在单细胞水平研究真菌-微生物相互作用的复杂性18。通过在远离土壤微生物组复杂多样性的环境中观察相互作用的物种，可以更准确地评估各个成员之间相互作用的具体方式。因此，仍需开发多功能平台，以实现对细菌-真菌相互作用和真菌-真菌相互作用的高分辨率、单细胞成像。
微流控技术，即所谓的“芯片实验室”系统，为在单细胞水平上研究菌丝-菌丝相互作用（BFIs）和菌丝-基质相互作用（FFIs）提供了理想的平台。微流控领域起源于化学分析和微电子技术的发展，现已被生物科学领域广泛采用19。微流控技术可在定制的微型化通道网络中精确调控微量液体，这些通道至少有一个维度处于微米尺度，其在生物研究中的应用正不断拓展20。特别是，已有多种微流控装置被开发用于研究丝状真菌的生长21,22,23,24,25,26,27,28,29,30。该技术的一个优势在于，菌丝在微通道中的受限生长以及营养物质的分布更接近土壤环境的真实结构，优于传统的琼脂培养方法31。近年来，微流控平台已被用于研究人类中性粒细胞与真菌病原体之间的相互作用32、细菌与植物根系之间的相互作用33，以及真菌与线虫之间的相互作用34,35。
使用微流控技术研究微生物相互作用的诸多优势之一，是能够精确控制微通道环境。例如，可利用层流状态产生特定的浓度梯度，这在研究细菌趋化性时尤为有用36。另一个优势在于聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane), PDMS）具有透明特性；PDMS是一种成本低廉、生物相容性良好的弹性聚合物，广泛用于微流控器件的制造，其透明性便于利用明场和荧光显微镜对单个细胞进行高分辨率成像37。同样，将微生物限制在微通道内，使得可以开展追踪单细胞的延时实验，从而记录并量化单个细胞的响应行为37。最后，由于微流控装置可设计得易于操作，非专业人员也能轻松使用38。
深入了解土壤微生物之间相互作用的知识，对于改进旨在维持生物多样性和减缓气候变化对陆地环境影响的可持续生态系统管理实践具有重要意义39。因此，开发新型的微流控工具对于在细胞水平上拓展对真菌及其相互作用的理解至关重要。本实验方案将重点介绍两种用于研究细菌-真菌相互作用（BFIs）40&#160;和真菌-真菌相互作用（FFIs）41&#160;的微流控装置，如图1所示。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg" /> 
图1：细菌-真菌相互作用（BFI）与真菌-真菌相互作用（FFI）装置的视觉图示与示意图。（A）BFI装置的图像。将菌丝块置于微通道一端的入口处，以允许菌丝生长进入装置。细菌进样口位于另一端。比例尺 = 5 mm。（B）BFI装置的示意图，显示细菌进样口的位置以及菌丝通过相互作用微通道的生长方向。通道深度为10 µm，宽度为100 µm，长度为7 mm，共包含28条观察通道。（C）在琼脂平板上进行的Coprinopsis cinerea与Bacillus subtilis NCIB 3610的对峙实验（左侧），比例尺 = 20 mm；显微镜图像显示C. cinerea与B. subtilis NCIB 3610在微通道内的相互作用（中、右），即细菌在真菌菌丝上的极性附着。比例尺分别为25 µm（中）和10 µm（右）。（D）FFI装置键合于玻璃底培养皿的图像，两端分别接种菌丝块。比例尺 = 1 cm。（E）FFI装置的示意图。将两个真菌接种块分别引入装置两端的进样口，使菌丝可进入微通道进行探索。对照通道仅连接一个真菌进样口，并设有盲端通道，以防止测试真菌之间的相互作用。相互作用通道连接两个真菌进样口，允许测试真菌的菌丝在微通道内发生相互作用。每条相互作用通道由18个菱形区段组成，总长度为8.8 mm（每个菱形区段为490 × 430 µm），深度为10 µm，相邻菱形之间的连接区域为20 µm。通道类型为重复设置，比例尺 = 1 mm。（F）来自装置两端、相互接近的两条菌丝前沿在互连的相互作用通道中形成的相互作用区域。相差显微镜图像，比例尺 = 250 µm。本图中的各图板经修改自 Stanley 等，2014（A-C）40 和 Gimeno 等，2021（D-F）41。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td>用于在培养皿中固化细菌和真菌培养基</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11759408</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD 2021</td><td>Autodesk, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器（VX-75）</td><td>Systec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机（5810R）</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三甲基氯硅烷</td><td>Merck Life Sciences</td><td>386529</td><td>注意：三甲基氯硅烷为危险物质。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并小心处理。避免与皮肤和眼睛接触，防止吸入。远离点火源，并在通风良好的区域使用。</td></tr><tr><td>打孔器</td><td>SLS</td><td>COR1000</td><td></td></tr><tr><td>显影液（mr-Dev 600）</td><td>Microresist Technologies</td><td></td><td>注意：mr-Dev 600 显影液易燃</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>VWR</td><td>214-1108</td><td>例如 200 mL；根据具体需求选择合适规格</td></tr><tr><td>乙醇（70% v/v）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>E/0650DF/15</td><td>由 99.8%（分析纯级）稀释而成</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>图像处理的代表性软件包</td></tr><tr><td>过滤压缩空气</td><td></td><td></td><td>大多数实验室的标准配置。也可使用无油空气压缩机配合调压装置。</td></tr><tr><td>平头晶圆镊子</td><td>SLS</td><td>INS5026</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10008051</td><td>弯头、尖头</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td>50 mm</td></tr><tr><td>玻璃结晶皿</td><td>VWR</td><td>216-1865</td><td>用于清洗聚二甲基硅氧烷（PDMS）块</td></tr><tr><td>玻璃结晶皿</td><td>VWR</td><td>216-1866</td><td>用于主模具的制备</td></tr><tr><td>玻璃培养基瓶</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15456113</td><td>例如 250 mL；根据具体需求选择合适规格</td></tr><tr><td>玻璃注射器（Hamilton）</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10625251</td><td>用于分装三甲基氯硅烷</td></tr><tr><td>加热板（HP 160 III BM）</td><td>SAWATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>VWR</td><td>COPA175CS01</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>Air Science (PCR)</td><td></td><td>用于设备制造的代表性层流罩</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP9723-500</td><td>用于细菌过夜培养的代表性营养肉汤</td></tr><tr><td>发光二极管光源系统（LedHUB）</td><td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td><td></td><td>可用于成像真菌-微生物相互作用（荧光）的代表性光源</td></tr><tr><td>MA6 紫外光刻掩模对准仪</td><td>Suss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麦芽提取物</td><td>VWR</td><td>84618</td><td>用于制备代表性真菌培养基（麦芽提取物琼脂）</td></tr><tr><td>掩模写入仪</td><td>Applied Materials</td><td>4700DP</td><td>可用于光刻掩模制作的代表性掩模写入设备</td></tr><tr><td>主模具塑料支架</td><td></td><td></td><td>实验室自制的3D打印定制支架</td></tr><tr><td>微生物安全柜&amp;nbsp;（BioMat2）</td><td>Contained Air Solutions</td><td></td><td>用于微生物培养和设备接种的代表性微生物安全柜</td></tr><tr><td>Milli-Q纯水</td><td></td><td></td><td>生物学实验室的标准配置。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research 成像软件</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于图像采集的代表性软件包</td></tr><tr><td>NIS-Elements Free Viewer</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于查看已采集图像的代表性软件包</td></tr><tr><td>烘箱（Binder BD115）</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15602126</td><td>用于固化聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td></tr><tr><td>烘箱（CLO-2AH-S）</td><td>KOYO</td><td></td><td>用于硅片的预处理</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>HS234526B</td><td>透明薄膜</td></tr><tr><td>方形无菌培养皿</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11708573</td><td>120.5 mm</td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15370366</td><td>90 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>Micro Lithography Services Ltd. UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机（Zepto）</td><td>Diener Electronic</td><td>100012601</td><td></td></tr><tr><td>塑料杯</td><td>Semadeni</td><td>8323</td><td></td></tr><tr><td>塑料刮刀</td><td>Semadeni</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>便携式精密天平（OHAUS Scout）</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15519631</td><td>用于称量 PDMS、培养基组分等</td></tr><tr><td>精密切割刀</td><td>Syneo</td><td>HS1251135P1183</td><td>刀刃直径：3.18 mm</td></tr><tr><td>精密切割刀&amp;nbsp;</td><td>Syneo</td><td>HS1871730P1183S</td><td>刀刃直径：4.75 mm</td></tr><tr><td>轮廓仪&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Dektak XT-触针式</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>H&amp;auml;berle Labortechnik</td><td>9156110</td><td></td></tr><tr><td>冰箱</td><td>Haden</td><td></td><td>4–6 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Retiga R1 CCD 相机</td><td>Qimaging</td><td></td><td>可用于成像真菌-微生物相互作用的代表性相机</td></tr><tr><td>Scotch magic 透明胶带</td><td>Office Depot</td><td>3969954</td><td>19 mm 透明胶带；无色胶带</td></tr><tr><td>摇床培养箱（Cole-Parmer SI500）</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10257954</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>Inseto</td><td></td><td>100 mm</td></tr><tr><td>钠钙玻璃板</td><td>Inseto</td><td></td><td>125 mm × 125 mm × 2 mm。用于在掩模对准仪中固定光刻掩模</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪&amp;nbsp;</td><td>SAWATEC</td><td>SM-180-BM</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2010 光刻胶</td><td>MicroChem</td><td></td><td>注意：SU-8 光刻胶具有危险性，操作时需谨慎，避免吸入及皮肤接触。易燃，可能具有致癌性，对环境有毒。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td>用于制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置</td></tr><tr><td>温控培养箱</td><td>Okolab</td><td></td><td>可用于成像真菌-微生物相互作用的代表性培养箱</td></tr><tr><td>Ti2-E 倒置落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td>可用于成像真菌-微生物相互作用的代表性显微镜</td></tr><tr><td>超声波清洗机 S-Line</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>FB15050</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10528861</td><td>硅烷化和 PDMS 脱气应在不同的干燥器中进行</td></tr><tr><td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL 物镜</td><td>Nikon</td><td>MRH20105</td><td>可用于成像真菌-微生物相互作用的代表性物镜</td></tr><tr><td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL 物镜</td><td>Nikon</td><td>MRH48230</td><td>可用于成像真菌-微生物相互作用的代表性物镜</td></tr></tbody></table>

用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

丝状真菌是土壤中成功的定居者，在土壤生态系统中发挥着重要作用，例如参与有机物和无机物的分解以及养分水平的调控。在土壤中，它们还拥有大量机会与多种其他微生物（如细菌或其他真菌）相互作用。然而，由于土壤具有类似“黑箱”的特性，对真菌在细胞水平上的相互作用进行研究仍具挑战性。目前，新型的微流控工具正在被开发用于研究真菌相互作用，其中两种用于研究细菌-真菌及真菌-真菌相互作用的平台尤为突出。在这些微通道中，可在受控的理化环境中以比以往更高的时间与空间分辨率监测真菌-微生物相互作用。这些工具的应用已带来诸多新颖的生物学发现，例如观察到细菌在菌丝上的极性附着，或揭示出此前未被描述的真菌-真菌拮抗现象。这些方法学的一个关键特征是其操作简便，非专业人员亦可轻松使用，从而产生高度可转化的技术，适用于微生物学实验室。

代表性结果来自示例 BFI40 和 FFI41 装置。利用这些装置结合常规显微技术，可便捷地获取菌丝生长速率的测量数据。图3A-B 展示了 C. cinerea 菌丝与 B. subtilis NCIB 3610 之间的细菌-真菌相互作用。B. subtilis 的存在在共接种后约 5 小时（图3B）即抑制了 C. cinerea 的生长。箭头所示为菌丝变细且透明度增加的同步形态学现象（图3A）。同时观察到未受影响的菌丝细胞仍持续增殖。图3C-D 显示了 F. graminearum ...

由于土壤不透明，其内部微生物组分之间的相互作用难以在细胞分辨率下直接观察。本文介绍了两种微流控工具，为研究真菌-微生物相互作用提供了新的机会。这些装置用途广泛且操作简便，能够实现高时空控制，并在细胞水平上进行高分辨率成像。

丝状真菌是土壤中成功的定居者，在土壤生态系统中发挥重要作用，例如参与有机物和无机物的分解……

利用所展示的微流控装置，我们能够在精确的空间和环境控制下，以单细胞分辨率对真菌与其他微生物之间的动态相互作用进行研究。重要的是，真菌的生长可在微流控通道内被限制并定向引导，从而获得高质量的时间序列图像。因此，可以深入探究真菌-真菌及真菌-细菌相互作用的复杂性。理解真菌与微生物之间的相互作用是定义和保护土壤微生物组的关键步骤。这一知识可被用于开发新型生物防治剂，以促进可持续农业的发展。首先，在洁净的塑料杯中，用刮刀将聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)，简称PDMS）的基体与固化剂按10:1的比例充分混合，制备约40克PDMS。为去除所有气泡，将杯子放入真空腔中抽气一小时。接着，用透明胶带将母模固定在塑料支架上，并使用压缩过滤空气清除任何灰尘颗粒，然后将PDMS倒入母模中央，静置使其自然铺展。为防止灰尘颗粒沉积在PDMs表面，用塑料盖松散地覆盖母模，然后将母模转移至烘箱中，在70摄氏度下固化过夜。从烘箱中取出母模并使其冷却后，小心地将固化的PDMs从母模和塑料框架上剥离，注意不要损坏母模上的PDMs。随后，为保持表面无尘，将透明胶带贴在PDMs上压印出的微通道表面。接下来，使用固定式切片机或剃刀将PDM切割成设计指定的片状结构。在切割用于细菌-真菌相互作用装置（即BFI装置）的PDM片时，需确保微通道完全敞开；而对于用于真菌-真菌相互作用装置（即FFI装置）组装的PDM片，应修剪其每个角落，以便其能够适配玻璃底培养皿。接下来，根据装置设计，使用精密切割器打出入液口或出液口孔洞。随后，将PDMS切片浸入0.5摩尔的氢氧化钠溶液中。在将切片转移至70%乙醇溶液之前，先用无菌双蒸水冲洗切片。去除乙醇并再次用双蒸无菌水冲洗切片后，将切片浸入无菌双蒸水中，超声处理五分钟，然后将PDMs切片从水中取出，用过滤压缩空气吹干，并放入无菌方形培养皿中。接下来，将含有PDMs切片的培养皿置于70摄氏度烘箱中孵育一小时。待切片在无尘环境中冷却后，使用胶带和过滤压缩空气清除其表面的灰尘。为了活化将要键合在一起的PDMs平板和玻璃底培养皿的表面，将它们放入等离子清洗仪中，使待活化的表面朝上。从等离子清洗仪中取出PDMs平板和培养皿后，通过将活化后的表面紧密贴合，轻柔地进行键合。将BFI和FFI的PDMs平板分别与直径为35毫米和55毫米的培养皿键合。为检查键合是否成功，尝试用镊子将PDMs平板从培养皿上剥离。使用肉眼或普通显微镜仔细观察装置，确保接种入口或微通道无塌陷。对于水饱和或富含营养的条件，在键合后立即用移液器加入100微升所需溶液以填充BFI装置。对于FFI装置，向每个入口加入30微升培养基。最后，向培养皿中加入 100 至 200 微升无菌双蒸水以维持湿度。然而，在非饱和湿度条件下，仅需向培养皿中加入 100 至 200 微升无菌双蒸水以维持湿度。进行真菌接种时，应在超净工作台内，使用无菌打孔器从培养三天的菌落边缘切取一块琼脂块，并确保保留生长中的菌丝前端完整。然后将琼脂块接种到BFI和/或FFI装置的真菌入口中，菌丝面朝下，菌丝前端朝向微通道开口，以促进菌丝侵入通道。对于FFI装置，将另一含有第二种真菌的琼脂块接种到对侧入口。接着，用透明封口膜密封培养皿，并在25至28°C避光条件下孵育，直至成像。进行细菌接种时，将BFI装置从培养箱中取出后，在无菌环境下用移液器吸取10微升细菌悬液，加入细菌入口。待培养皿用透明封膜密封后，将装置直立存放于25°C避光环境中，直至开始成像。采用本方案，可成功观察到真菌Coprinopsis cinerea与细菌Bacillus subtilis之间的相互作用。观察到，在细菌存在的情况下，真菌的生长速率在共接种约五小时后开始急剧下降。此外，与细菌相关的真菌菌丝呈现出细长且透明的形态。延时荧光显微镜也显示，与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）共接种五小时后，真菌菌丝发生塌陷。然而，从六小时开始，细菌种群数量也开始下降。真菌-真菌相互作用的可视化结果显示，禾谷镰刀菌对罗斯特里赫德霉的生长具有显著抑制作用，荧光显微镜观察可明显看出该现象。该方案还揭示了长孢轮枝菌在粘土假单胞菌和荧光假单胞菌存在下发生了显著的形态学变化。研究中采用的高分辨率动态成像技术还揭示了在木霉菌 Clonostachys rosea 存在的情况下，禾谷镰刀菌 Fusarium graminearum 中隔膜的形成过程。荧光标记技术实现了对 Clonostachys rosea 菌丝在 FFI 装置中增殖动态的定量分析。用户可根据需要对这些装置进行调整和修改，以引入不同目标物种，并针对真菌与微生物相互作用相关的特定实验问题开展研究。生物荧光成像（BFI）和荧光成像（FFI）设备均推动了科学前沿的发展，揭示了真菌在受到真菌、病毒、线虫攻击时传播防御信号和营养物质的机制，并促进了对细菌扩散的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于在细胞水平上探测真菌 - 微生物相互作用的微流体工具

微流控装置可用于实时观察复杂自然过程，并在适当的物理尺度上进行可视化。我们开发了一种简单的微流控装置，可模拟天然多孔介质的关键特征，用于研究地下环境中细菌的生长与迁移。...

微观世界的窗口：用于研究多孔介质中微生物迁移的简单微流控系统

我们介绍一种简单的方法，用于制备微流控装置，可在无需洁净室或软光刻技术的情况下，对多种不同菌株施加类似的动态条件。...

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

来源：Miquel Guennoc, C., 等。利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上的细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法。J. Vis. Exp.

建立真菌-细菌共培养以形成生物膜

本方案介绍了用于原核微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器（PLBR）的制备、装置搭建及基本操作。作为原理验证，对具有工业相关性的微生物进行了分析，从而获得了在特定时间段内的生长速率、形态特征及表型异质性等方面的深入信息，而这些信息采用传统方法极难实现。...

用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。...

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

本方案描述了一种在真菌菌丝上培养并利用共聚焦显微镜和电子显微镜对细菌生物膜进行定性分析的新方法。...

一种利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法

植物防御素在植物抵御病原体过程中发挥着重要作用。为了有效利用这些抗真菌肽作为抗真菌剂，了解其作用机制（MOA）至关重要。本文描述了一种活细胞成像方法，用于研究这些肽作用机制中的关键方面。...

活细胞成像技术研究抗真菌植物防御素进入真菌细胞的方式及其亚细胞定位

单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

活性荧光染料是现代真菌细胞生物学中活细胞成像分析的重要工具。本文详细介绍了已知及较少使用的荧光染料在丝状真菌中用于追踪质膜动态、内吞/外排作用以及细胞壁形态发生的应用方法。...

膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

本文介绍了一种基于质谱蛋白质组学的方法，用于在感染过程中分析宿主与病原体之间的相互作用。该方法通过非标记定量技术，在单次实验中同时检测宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如Cryptococcus...

基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用

我们介绍一种无需标记的活体成像方案，利用透射光显微技术对丝状真菌A.

使用活体显微镜和开源软件对Aspergillus nidulans生长速率进行定量分析

探索微流控技术在细胞水平上研究真菌与微生物相互作用的应用。该方法利用高分辨率延时成像技术，精确控制空间环境，揭示土壤微生物组的动态过程，为可持续农业开发生物防治剂提供重要依据。

用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

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