用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

利用所展示的微流控装置，我们能够在精确的空间和环境控制下，以单细胞分辨率对真菌与其他微生物之间的动态相互作用进行研究。重要的是，真菌的生长可在微流控通道内被限制并定向引导，从而获得高质量的时间序列图像。

因此，可以深入探究真菌-真菌及真菌-细菌相互作用的复杂性。理解真菌与微生物之间的相互作用是定义和保护土壤微生物组的关键步骤。这一知识可被用于开发新型生物防治剂，以促进可持续农业的发展。

首先，在洁净的塑料杯中，用刮刀将聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)，简称PDMS）的基体与固化剂按10:1的比例充分混合，制备约40克PDMS。为去除所有气泡，将杯子放入真空腔中抽气一小时。接着，用透明胶带将母模固定在塑料支架上，并使用压缩过滤空气清除任何灰尘颗粒，然后将PDMS倒入母模中央，静置使其自然铺展。

为防止灰尘颗粒沉积在PDMs表面，用塑料盖松散地覆盖母模，然后将母模转移至烘箱中，在70摄氏度下固化过夜。从烘箱中取出母模并使其冷却后，小心地将固化的PDMs从母模和塑料框架上剥离，注意不要损坏母模上的PDMs。随后，为保持表面无尘，将透明胶带贴在PDMs上压印出的微通道表面。

接下来，使用固定式切片机或剃刀将PDM切割成设计指定的片状结构。在切割用于细菌-真菌相互作用装置（即BFI装置）的PDM片时，需确保微通道完全敞开；而对于用于真菌-真菌相互作用装置（即FFI装置）组装的PDM片，应修剪其每个角落，以便其能够适配玻璃底培养皿。

接下来，根据装置设计，使用精密切割器打出入液口或出液口孔洞。随后，将PDMS切片浸入0.5摩尔的氢氧化钠溶液中。在将切片转移至70%乙醇溶液之前，先用无菌双蒸水冲洗切片。

去除乙醇并再次用双蒸无菌水冲洗切片后，将切片浸入无菌双蒸水中，超声处理五分钟，然后将PDMs切片从水中取出，用过滤压缩空气吹干，并放入无菌方形培养皿中。接下来，将含有PDMs切片的培养皿置于70摄氏度烘箱中孵育一小时。待切片在无尘环境中冷却后，使用胶带和过滤压缩空气清除其表面的灰尘。

为了活化将要键合在一起的PDMs平板和玻璃底培养皿的表面，将它们放入等离子清洗仪中，使待活化的表面朝上。从等离子清洗仪中取出PDMs平板和培养皿后，通过将活化后的表面紧密贴合，轻柔地进行键合。将BFI和FFI的PDMs平板分别与直径为35毫米和55毫米的培养皿键合。为检查键合是否成功，尝试用镊子将PDMs平板从培养皿上剥离。

使用肉眼或普通显微镜仔细观察装置，确保接种入口或微通道无塌陷。对于水饱和或富含营养的条件，在键合后立即用移液器加入100微升所需溶液以填充BFI装置。对于FFI装置，向每个入口加入30微升培养基。

最后，向培养皿中加入 100 至 200 微升无菌双蒸水以维持湿度。然而，在非饱和湿度条件下，仅需向培养皿中加入 100 至 200 微升无菌双蒸水以维持湿度。进行真菌接种时，应在超净工作台内，使用无菌打孔器从培养三天的菌落边缘切取一块琼脂块，并确保保留生长中的菌丝前端完整。

然后将琼脂块接种到BFI和/或FFI装置的真菌入口中，菌丝面朝下，菌丝前端朝向微通道开口，以促进菌丝侵入通道。对于FFI装置，将另一含有第二种真菌的琼脂块接种到对侧入口。接着，用透明封口膜密封培养皿，并在25至28°C避光条件下孵育，直至成像。

进行细菌接种时，将BFI装置从培养箱中取出后，在无菌环境下用移液器吸取10微升细菌悬液，加入细菌入口。待培养皿用透明封膜密封后，将装置直立存放于25°C避光环境中，直至开始成像。采用本方案，可成功观察到真菌Coprinopsis cinerea与细菌Bacillus subtilis之间的相互作用。

观察到，在细菌存在的情况下，真菌的生长速率在共接种约五小时后开始急剧下降。此外，与细菌相关的真菌菌丝呈现出细长且透明的形态。延时荧光显微镜也显示，与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）共接种五小时后，真菌菌丝发生塌陷。

然而，从六小时开始，细菌种群数量也开始下降。真菌-真菌相互作用的可视化结果显示，禾谷镰刀菌对罗斯特里赫德霉的生长具有显著抑制作用，荧光显微镜观察可明显看出该现象。该方案还揭示了长孢轮枝菌在粘土假单胞菌和荧光假单胞菌存在下发生了显著的形态学变化。

研究中采用的高分辨率动态成像技术还揭示了在木霉菌 Clonostachys rosea 存在的情况下，禾谷镰刀菌 Fusarium graminearum 中隔膜的形成过程。荧光标记技术实现了对 Clonostachys rosea 菌丝在 FFI 装置中增殖动态的定量分析。用户可根据需要对这些装置进行调整和修改，以引入不同目标物种，并针对真菌与微生物相互作用相关的特定实验问题开展研究。

生物荧光成像（BFI）和荧光成像（FFI）设备均推动了科学前沿的发展，揭示了真菌在受到真菌、病毒、线虫攻击时传播防御信号和营养物质的机制，并促进了对细菌扩散的研究。