Name: 使用张力测量小体积腔肌图测量小鼠胸主动脉内皮依赖性血管松弛 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习使用张力测量肌图技术评估小鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能。该方法可在严格控制的生理条件下精确测量血管反应性，为研究血管生物学和心血管疾病机制提供可靠工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（R15HL145646）和中西部大学研究生院资助。

所有外科手术操作和动物护理均经中西部大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（IACUC# AZ-3006, AZ-2936）。
1. 缓冲液的配制
注意：尽管HEPES生理盐溶液（HEPES-PSS）缓冲液在4 °C下可稳定保存7天，但仍建议每次实验当天新鲜配制所有缓冲液。每次实验所需的其他所有试剂和激动剂也必须现配现用。本实验方案所用的HEPES-PSS缓冲液是一种广泛使用的缓冲液，适用于 离体 已证明具有超过12小时细胞保护作用，同时保留血管舒张反应的血管研究——本实验方案的主要重点6,7.
<ol>
	<li>配制 HEPES-PSS 溶液（pH 7.4）：混合 10 mmol/L HEPES、6 mmol/L 葡萄糖、1.5&#160;mmol/L CaCl2、130 mmol/L NaCl、4 mmol/L KCl、4 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/L MgSO4、1.2 mmol/L KH2PO4 和 0.03 mmol/L EDTA。</li>
	<li>配制 HEPES-PSS 高 K+ 缓冲液。该缓冲液与 HEPES-PSS 溶液相同，但含有 5 mmol/L HEPES、65 mmol/L NaCl、10 mmol/L 葡萄糖、1 mmol/L MgCl2、80 mmol/L KCl，且不含 MgSO4 和 EDTA。</li>
</ol>
2. 肌动仪装置的准备
<ol>
	<li>打开水浴锅并将其温度设置为 37 °C，确保水位适当。</li>
	<li>将两个标记好的烧杯放入水浴锅中，一个装有 600 mL HEPES-PSS 溶液，另一个装有 150 mL 高钾溶液（high K+ solution）。</li>
	<li>用碳酰气（carbogen gas，含 5% CO2 和 95% O2）对装有 300 mL HEPES-PSS 溶液的烧杯进行通气至少 10 分钟。</li>
	<li>取 30 mL 已通气的 HEPES-PSS 溶液加入一个 50 mL 离心管中，做好相应标记（胸廓，小鼠编号），并置于冰上。将剩余的已通气 HEPES-PSS 溶液也保持在冰上，用于后续主动脉分离过程。</li>
	<li>打开四腔肌动图仪（four-chamber myograph unit），向每个肌动图腔室中加入 6 mL HEPES-PSS 溶液，并将温度设定为 37 °C。让每个腔室中的溶液用碳酰气混合气体通气 30 分钟，同时检查确认各腔室均已达到目标温度 37 °C（可利用此等待时间进行小鼠主动脉的解剖）。</li>
	<li>打开肌动图数据采集硬件及计算机。</li>
</ol>
3. 小鼠主动脉分离
<ol>
	<li>通过吸入5%异氟烷麻醉实验小鼠，并采用颈椎脱位法处死（本演示使用一只6月龄雄性C57BL/6J小鼠）。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术板上，使用手术胶带将其四肢固定在板上。</li>
	<li>用70%酒精喷洒腹部区域，使毛发完全湿润，防止松散或干燥的毛发进入切口。轻轻擦去多余液体。</li>
	<li>使用镊子定位并夹起胸骨剑突下方的腹部皮肤。</li>
	<li>垂直向上提起皮肤以制造张力，使用剪刀进行钝性剪切，去除表层皮肤，暴露胸腔。</li>
	<li>抬起剑突，并沿肋下缘在剑突稍下方做两侧横向切口。</li>
	<li>将侧向切口向头侧延伸，以去除肋骨前部结构。</li>
	<li>在膈肌下方及颈部位置，通过脊柱进行钝性剪切，移除胸腔骨架。 
	注意：研究人员也可直接从动物体内取出主动脉，但需注意保护血管，并冲洗掉主动脉内的凝血。本方案以取出胸腔骨架并仔细清理和分离主动脉为例。经过练习，该方法可快速高效地完成，且有利于保留额外组织用于其他研究，如免疫组织化学、组织学和蛋白质印迹分析。</li>
	<li>将胸腔骨架转移至盛有冰冻通氧HEPES-PSS缓冲液的透明硅橡胶涂层培养皿中，并在两侧固定。 
	注意：使用硅橡胶试剂套装（材料表）。按重量比10:1混合基础剂与固化剂，倒入玻璃培养皿中，在25 °C下静置固化24小时。</li>
	<li>将培养皿置于体视变焦显微镜下，轻轻剪切并从肋骨上分离心脏及相连的主动脉，转移至另一个洁净透明的硅橡胶涂层培养皿中（图1）。</li>
	<li>随后，轻柔地去除主动脉周围的脂肪、结缔组织以及任何凝血。使用锋利的小剪刀，从主动脉弓区域开始向下至降主动脉底部，完整分离并取出整段主动脉。请注意，主动脉弓不适用于血管肌张力测定实验，但可用于组织学研究。</li>
	<li>整个解剖过程中使用冰冷通氧的HEPES-PSS溶液。每10分钟或在视野清晰度下降时（以先到者为准）更换一次溶液。建议每段主动脉环在解剖后20分钟内（最长不超过60分钟）安装至肌张力测定仪腔室中。</li>
</ol>
4. 将主动脉节段安装至肌动图腔室
<ol>
	<li>使用锋利的小型手术剪将解剖好的主动脉切成每段 2 mm 的四段。以培养皿内的微型尺作为参考。</li>
	<li>将肌动描记器腔室置于体视变焦显微镜下，以便清晰观察固定针，并调节微米计，使两根针接近接触（图 2）。</li>
	<li>确保两根组织固定针正确对齐。</li>
	<li>安装主动脉段时需格外注意，避免夹伤主动脉，以防损伤内皮层。</li>
	<li>在已盛有 5 mL 预热并通气的 HEPES-PSS 缓冲液的腔室内，用镊子小心地将每个 2 mm 的主动脉段套在两根固定针上。将主动脉段滑上固定针时动作务必轻柔。内皮层极为脆弱，容易从管腔侧脱落。</li>
	<li>通过逆时针旋转微米计缓慢将固定针分开，以确保将腔室放回肌动描记器装置时主动脉段不会从针上滑脱（图 3）。</li>
	<li>使用先前校准好的解剖显微镜目镜测微尺，测量已安装的主动脉环的真实且准确长度：将测微尺起点对准主动脉段一端（标记为组织端 α1），记录另一端（标记为组织端 α2）在目镜刻度上的读数8。这些数值将在第 5 节的标准化步骤中使用。</li>
	<li>将每个肌动描记器腔室放回装置中，并在 37 °C 下持续通气孵育 30 分钟。 
	&#8203;注意：主动脉的四个节段可作为同一处理的重复样本，也可同时用于不同的实验。</li>
</ol>
5. 标准化
注意：归一化步骤是必要的，以确保实验条件得到适当标准化，并保证所收集的数据具有可靠性和可重复性。&#34;IC1/IC100&#34;，即&#34;归一化因子&#34;，定义为在可记录到最大血管收缩剂反应（例如 60 mM KCl）时的动脉内周长与在跨壁压为 100 mm Hg 时（即 IC100）的内周长之比。因此，将 IC100 乘以该比值，即可确定能够建立最佳反应（即 IC1）时的动脉内周长。
<ol>
	<li>调节千分尺，使两根针尖几乎接触。</li>
	<li>将所有肌动图腔室的力设为零，并让其再平衡 1–2 分钟。</li>
	<li>记录千分尺上的第一个直径读数。此位置即为两针之间间隙视为零的位置（步骤 5.7 所需）。</li>
	<li>在 DMT 下拉菜单中打开数据采集软件的 归一化设置；将弹出一个新窗口，包含以下设置和默认值： 
	目镜校准（mm/格）：0.36 
	目标压力（kPa）：13.3 
	IC1/IC100：0.9 
	在线平均时间（s）：2 
	延迟时间（s）：60 
	延迟完成时播放声音（复选框） 
	声音（带下拉选择菜单或“浏览”功能）</li>
	<li>根据血管段数量，在屏幕上选择相应数量的通道，并开始图表记录。</li>
	<li>使用下拉菜单选择目标通道；归一化窗口将出现。</li>
	<li>在相应输入框中输入以下常量值：组织端点 α1；组织端点 α2；针直径：40 µm；来自模拟千分尺刻度的千分尺读数。</li>
	<li>为记录第一个点（X 的初始值或 X0），点击 添加点 按钮。经过 60 秒延迟后，将显示对应于此千分尺的力值和有效压力（ERTP），同时千分尺读数输入框将变为可用状态。</li>
	<li>通过逆时针旋转千分尺开始拉伸血管。在千分尺读数框中输入数值，然后点击 添加点 按钮（再次有 60 秒延迟）。</li>
	<li>持续拉伸血管并继续添加千分尺读数，直到达到 Micrometer X1 的数值，该值是计算得出的用于将血管拉伸至其 IC1 的千分尺设定值。</li>
	<li>将千分尺设置为 X1 值。 
	注：6 月龄 C57BL6 小鼠的归一化（最佳）张力为 6 mN。</li>
	<li>归一化后，让组织静置并平衡 30 分钟。此时无需更换腔室中的 HEPES-PSS 溶液。 
	注：每个腔室可容纳 8 mL 溶液。本方案使用 5 mL，足以完全浸没血管及固定针。</li>
	<li>利用静置和平衡时间准备以下试剂：
	<ol>
		<li>用去离子水（RO 水）从低到高浓度依次配制乙酰胆碱系列稀释工作液：50 nM、100 nM、500 nM、1 µM、5 µM、10 µM、50 µM、100 µM、500 µM 和 1 mM。实验期间所有试管均需置于冰上。</li>
		<li>用双蒸水配制 100 mM 的 N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）工作溶液，实验期间保持冰上保存。</li>
		<li>根据另设的一组实验结果，配制去氧肾上腺素（phenylephrine）的次最大剂量（10 µM）。 
		&#8203;注：平衡期对于血管段适应肌动图腔室的新环境、重置离子梯度，并在进行不同药理和机械刺激前达到稳定的被动张力水平至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 主动脉环中内皮依赖性血管舒张的测定
<ol>
	<li>30分钟平衡期结束后，排空各个腔室，并向每个腔室加入5 mL新鲜、预温且充氧的HEPES-PSS溶液。每次仅排空一个腔室，以尽量减少组织暴露于空气中的时间。腔室排空使用设定为60 cmHg的真空泵，同时将肌动描记仪的阀门设置为6秒延迟，以确保完全移除5 mL溶液。</li>
	<li>如有需要，重新调整力测量值，使其达到6 mN的最佳张力。每次孵育期间以及每组新实验开始前，必须重新调整力至最佳张力，此步骤极为关键。随后让组织再静置15–20分钟。</li>
	<li>打开数据采集软件，将追踪编号从 50:1 更改为 500:1，然后按下 开始此时，可在软件中查看每个腔室记录的力值。</li>
	<li>在开始新实验之前，务必在数据采集软件中添加适当的标签。</li>
	<li>再次排空腔室，然后加入 5 mL 高钾溶液+ 向每个腔室加入溶液。此步骤适用于在使用主动脉组织进行其他实验方案之前，检测组织的活性以及平滑肌对膜去极化的收缩反应完整性，有助于判断该血管段是否可用于后续实验。</li>
	<li>再次排空室腔，紧随高K+引起的收缩反应之后+ 溶液达到力生成的平台期（图4). 
	注意：不要让高 K+ 溶液在腔室中停留时间不得超过3分钟，否则会损伤组织。</li>
	<li>用HEPES-PSS溶液洗涤组织3次。加入5 mL高K⁺溶液+ 将溶液分别加入每个腔室。在高钾引发收缩反应后，立即排空腔室。+ 溶液达到张力生成平台期后，用 HEPES-PSS 将组织洗涤 3 次，随后让组织再静置 15 分钟。 
	注意：在某些实验室中，血段会接受高 K 处理+ 溶液冲洗三次，以确保在开始肌动图实验前血管的稳定性。在本方案中，新分离的主动脉节段将接受高K+ 在将组织用于后续实验之前，需用溶液清洗两次。在所有实验中保持这一操作的一致性至关重要。</li>
	<li>使用高K⁺刺激后记录到的两个收缩力峰值的平均值+ 用于标准化实验中对其他血管收缩剂和血管舒张剂反应的记录值的溶液</li>
	<li>将组织静置15-20分钟。</li>
	<li>用已确定的亚最大剂量（终浓度为10 µM）的血管收缩剂苯肾上腺素（PE）预收缩主动脉节段。 
	注意：苯肾上腺素的亚最大剂量（10 µM）是在另一组独立实验中确定的，其中主动脉节段暴露于浓度递增的苯肾上腺素溶液，终浓度分别为 1 nM、5 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、1 µM、5 µM、10 µM 和 50 µM。结果表明，10 µM 的苯肾上腺素终浓度可在 2 mm 主动脉节段中产生亚最大收缩力（达到最大收缩力的 90%），此时收缩力尚未进入平台期。采用苯肾上腺素亚最大浓度的目的是避免主动脉组织对血管收缩激动剂出现饱和或脱敏现象。</li>
	<li>让去氧肾上腺素（PE）诱导的收缩曲线达到张力（力）发展的平台期（图5).</li>
	<li>在去氧肾上腺素诱导的张力达到平台期后，通过每3分钟依次加入5 µL浓度递增的乙酰胆碱工作液，进行乙酰胆碱的剂量-反应曲线测定，以在肌动描记室中建立以下乙酰胆碱终浓度：50 pM、100 pM、500 pM、1 nM、5 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM 和 1 µM&#160;(图6). 
	注意：每次加入乙酰胆碱后，需等待至少3分钟（待张力达到平台期），再加入下一次剂量。</li>
	<li>每一步均需将乙酰胆碱储备液极其缓慢地加入浴槽中，并远离主动脉环，以避免对组织造成扰动。</li>
	<li>完成剂量-反应实验后，排空灌流 chamber，并用温热且充氧的 HEPES-PSS 溶液冲洗主动脉节段 3 次，以去除残留药物。</li>
	<li>在开始下一步实验操作前，将组织静置 30 min。每次实验操作前，使用 HEPES-PSS 高钾溶液检测主动脉的活性。+ 溶液。如果正确执行所有制备和实验步骤，主动脉组织的活性将在整个实验过程中（4–6 小时）保持不变。</li>
</ol>
7. 一氧化氮生成广谱抑制剂对内皮介导的血管舒张作用的影响
<ol>
	<li>在仔细清洗主动脉组织并静置至少30分钟后，将同一组织用于本实验部分。 
	注意：利用30分钟的静置时间，用双蒸水配制100 mM的N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）工作液，并在整个实验过程中将该溶液置于冰上保存。</li>
	<li>主动脉片段静置30分钟后，排空浴槽，并向每个浴槽中加入新鲜、预温的高K+（60 mM KCl）溶液。 
	注意：在实验的每个阶段，主动脉组织至少需用一次高K+溶液进行刺激。记录到的收缩峰值将用于标准化该实验阶段所收集的数据。</li>
	<li>一旦高K+溶液引起的收缩反应达到平台期，立即排空浴槽，并用HEPES-PSS溶液洗涤组织3次。</li>
	<li>为了评估一氧化氮（NO）生成对观察到的乙酰胆碱诱导的血管舒张作用的贡献（见第6节），在此阶段通过向每个肌动图浴槽（含5 mL缓冲液）中加入10 µL已配制的100 mM L-NAME工作储备液，使每个浴槽中的终浓度达到200 µM，从而预先孵育主动脉片段。 
	注意：L-NAME是一种非选择性且强效的NOS（负责NO生成的酶）所有亚型的抑制剂，因此被认为是一种有效阻断血管壁内NO生成的工具9。</li>
	<li>让主动脉片段在L-NAME中预孵育30分钟。</li>
	<li>此时不要洗涤。</li>
	<li>不移除L-NAME的情况下，向浴槽中加入去氧肾上腺素的次最大剂量（终浓度10 µM），以诱导主动脉收缩。 
	注意：由于L-NAME对内源性NO生成具有抑制作用，新记录到的去氧肾上腺素诱导的主动脉收缩峰值将显著高于在L-NAME孵育前记录的初始峰值。这是预期现象，因为L-NAME抑制了主动脉壁中的基础NO生成，导致平滑肌产生更强的收缩力，从而引起更大的张力生成。</li>
	<li>等待去氧肾上腺素诱导的收缩曲线达到张力（收缩力）平台期。</li>
	<li>此时，向肌动图浴槽中加入乙酰胆碱，使其终浓度达到500 nM（这是在本方案第5节所述实验中确定的乙酰胆碱次最大浓度）。</li>
	<li>等待数分钟，记录任何可能的张力变化，直至形成稳定的平台期（图7）。 
	注意：由于L-NAME抑制了内皮层对乙酰胆碱刺激产生NO的能力，因此不应观察到对去氧肾上腺素刺激的张力生成有任何变化，因为主动脉内皮型NOS（eNOS）无法响应乙酰胆碱的应用而生成NO。</li>
	<li>排空浴槽，并用预温、充氧的HEPES-PSS溶液洗涤组织3次。</li>
</ol>
8. 内皮层对主动脉血管舒张的贡献
<ol>
	<li>为了强调内皮层在主动脉血管舒张中的作用，需在去内皮的主动脉节段中检测乙酰胆碱诱导的血管舒张，其中内皮层已被去除。</li>
	<li>将肌张力测量室置于显微镜下，并将一根细小的金属丝（可使用与张力测定相同的金属丝）轻柔地穿过主动脉管腔。在管腔内轻柔地移动金属丝（做轻柔的环形运动）一段时间，即可去除内皮或内膜。</li>
	<li>将主动脉切成2 mm长的主动脉环，并按照前述方法将其安装至肌张力测量室中。</li>
	<li>将最佳张力设定为6 mN，并在充氧、温热的HEPES-PSS缓冲液中让组织静置30分钟。</li>
	<li>30分钟平衡期结束后，排空测量室，并向每个室中加入5 mL新鲜、温热且充氧的HEPES-PSS溶液。</li>
	<li>通过逆时针旋转微调螺丝，将所有肌张力测量室的力归零。</li>
	<li>缓慢逆时针旋转微调螺丝以增加两根固定针之间的距离，直至记录的张力达到小鼠主动脉所需的最佳张力（C57BL/6J小鼠主动脉为6 mN）。在最佳张力（6 mN）下再静置组织15–20分钟。</li>
	<li>在向每个测量室加入5 mL高K+溶液前，再排空测量室一次。</li>
	<li>一旦高K+溶液引起的收缩反应达到平台期，立即再次排空测量室，并用HEPES-PSS溶液洗涤组织3次。随后让组织再静置15–20分钟。</li>
	<li>使用血管收缩剂去氧肾上腺素（终浓度10 µM）预收缩主动脉节段。 
	注意：由于内皮层已被去除，主动脉壁的基础一氧化氮（NO）生成显著减少；因此，在缺乏内皮层的主动脉组织中，去氧肾上腺素诱导的收缩峰值（即力生成峰值）预期会更高。</li>
	<li>当去氧肾上腺素诱导的张力达到平台期时，向肌张力测量室中加入亚最大浓度的乙酰胆碱，使其终浓度为500 nM。 
	注意：若内皮层已被完全去除，则加入乙酰胆碱后不应引起去氧肾上腺素诱导张力的任何变化，因为内皮依赖性NO生成已因内皮层的去除而被消除。所记录的曲线将与使用L-NAME处理时观察到的结果非常相似（见第7节）。</li>
	<li>在实验结束前等待3分钟，确保去氧肾上腺素诱导的张力平台期无变化（图8）。 
	注意：若在平台期加入乙酰胆碱导致去氧肾上腺素诱导的收缩出现下降，则表明内皮层未被完全去除。</li>
</ol>

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<li>Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nitric+oxide+on+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of nitric oxide on endothelial function.</a> Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).</li>
<li>Gibson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+aerobic+exercise+blocks+elastin+fiber+fragmentation+and+aortic+dilatation+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome+associated+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).</li>
<li>Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+initial+tension+for+rat+basilar+artery+in+wire+myography%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography.</a> Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).</li>
<li>Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+pharmacological+approaches+to+investigate+the+pathogenesis+of+Marfan+syndrome+in+the+abdominal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta.</a> Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+impairs+soluble+guanylyl+cyclase+function+in+mouse+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412(2021).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

血管生物学领域高度依赖于能够帮助研究人员评估血管壁功能完整性和结构完整性的工具。该领域还需要特别关注血管三层结构——内膜、中膜和外膜之间的直接与间接相互作用。在这三层结构中，内膜由单层内皮细胞构成，在调控血管健康和止血过程中具有非常重要的功能。
众所周知，内皮层的任何损伤都可能影响其释放一氧化氮（NO）及其他血管舒张因子的能力，导致血管功能失调，这一现象见于动脉粥样硬化、动脉瘤和血管炎等多种血管疾病。10,11,12为了理解调控内皮正常功能的潜在机制，并评估血管壁内皮的舒张功能及其完整性，必须采用一种能够模拟血管环境的标准化实验系统 体内 生理条件
对于大动脉（如主动脉），小型张力测定（等长）肌动图被广泛认为是一种可靠的工具，可为血管在体外提供最接近生理条件的环境 离体 该系统还可在实验室环境中长时间维持组...

近几十年来，小血管肌动描记系统已被用于测量血管壁不同层次在各种药物制剂和神经递质作用下的反应性 离体，实时环境下。血管反应性是健康功能血管的重要组成部分，对于外周和脑部血管系统中血流与灌注的调节至关重要1在血管壁内，内皮层与平滑肌层之间的相互作用是决定血管张力的主要因素，而血管壁外周结缔组织层（外膜）的结构变化也会持续影响血管张力。
内皮层通过释放一些血管舒张因子（包括一氧化氮（NO）、前列环素（PGI2）和内皮源性超极化因子（EDHF））或产生内皮素-1（ET-1）和血栓素（TXA2）等血管收缩物质来调控血管运动2,3,4。在这些因子中，一氧化氮（NO）已被广泛研究，其在炎症、细胞迁移、存活和增殖等其他关键细胞功能中的重要调控作用在科学文献中被大量引用2,5。
在血管生物学领域，腔室肌动描记术为血管生理学家和药理学家提供了一种在严格控制的半生理系统中测量内皮功能的宝贵且可靠的工具1。目前，科研人员可使用两种不同的肌动描记系统：导线（或针式）张力测定法（等长）肌动描记术和压力肌动描记术。在导线肌动描记系统中，血管被拉伸于两根导线或针之间，从而实现对血管壁产生的力或张力进行等长测量；而压力肌动描记术则是测量小阻力动脉血管反应性的更优平台，在此类血管中，血压的变化被认为是血管张力和血管运动变化的主要刺激因素。普遍认为，对于肠系膜动脉和脑动脉等小阻力动脉，压力肌动描记术所创造的条件更接近人体内的生理状态。小型腔室肌动描记仪可用于直径非常小的血管（200–500 µm），也可用于主动脉等较大的血管。
尽管有丝张力测定仪是一种在等长条件下记录血管张力的强大系统，但压力测定仪是测量血管在等压条件下直径变化的更合适系统。与主动脉等大弹性动脉相比，小肌性动脉（微动脉）在压力或血流变化时的血管直径变化更为显著。因此，压力测定仪被认为是研究具有显著血管反应性的小血管的更佳工具1。多腔室小体积腔室张力测定法的另一项实际优势在于，可通过研究来自同一只动物的同一动脉的多个（最多四个）血管段，来区分不同机制对血管反应性的贡献，从而降低变异性，获得可靠且具有结论性的数据。该技术在操作上也相对易于建立和维护。有丝张力测定仪几乎可用于研究各种尺寸的血管。它是一种评估血管功能更具成本效益的方案，当分离出的血管长度过短而无法满足压力测定仪实验要求时，可作为压力测定法的良好替代方法。
本报告提供了一种利用DMT-620多腔肌张力测定系统（DMT-USA）在小体积腔室中使用固定针进行小鼠离体胸主动脉环内皮功能评估的详细实验方案。该方案使用6月龄雄性C57BL6小鼠，平均体重为25–35 g。幸运的是，由于该方法适用于多种血管类型和直径，因此也可推广应用于其他种类和体重的动物。

<table><tbody><tr><td>乙酰胆碱</td><td>SigmaAldrich</td><td>A6625-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>碳酰气</td><td>Matheson</td><td>H103847</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMT 620 多腔肌动描记系统</td><td>DMT</td><td>DMT 620</td><td>多腔肌动描记系统</td></tr><tr><td>杜蒙特镊子</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SigmaAldrich</td><td>E5134-10G</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>SigmaAldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7006-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LabChart</td><td>ADI instruments</td><td></td><td>数据采集软件</td></tr><tr><td>光源</td><td>Volpi</td><td>14363</td><td></td></tr><tr><td>L-Name</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-200-7725</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>S6D</td><td>体视变倍显微镜</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>器官浴系统</td><td>DMT</td><td>720MO</td><td></td></tr><tr><td>去氧肾上腺素</td><td>SigmaAldrich</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>泵</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>ADI instruments</td><td>LabChart 8.1.20</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 试剂盒</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>24236-10</td><td>硅橡胶弹性体试剂盒</td></tr><tr><td>气罐减压阀</td><td>Fischer Scientific</td><td>10575147</td><td></td></tr><tr><td>水浴系统</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr></tbody></table>

使用张力测定小体积腔室血管肌动描记法测量小鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

小体积腔室张力测定肌动描记术是一种常用技术，用于评估实验动物以及从人体组织分离的小动脉和大血管的血管收缩功能。该技术使研究人员能够在严格控制且标准化（接近生理状态）的环境中维持离体血管，并可调节多种环境因素，同时对离体血管施加不同的药理学试剂，以诱导血管收缩或舒张反应。肌动描记腔室还提供了一个平台，用于测量血管对各种激素、抑制剂和激动剂的反应性，这些物质可能单独或同时影响平滑肌层和内皮层的功能。血管壁是一种复杂的结构，由三层不同组织构成：内膜（内皮层）、中膜（平滑肌和弹性纤维）以及外膜（胶原蛋白及其他结缔组织）。为了清晰理解各层的功能特性，必须具备一个能够同时研究这三层结构的组合式实验平台与系统。这种研究方法要求具备可模拟生理条件的半生理环境，以重现 体内 环境中的一个 离体 实验环境。小容量腔室张力测定肌动描记术为评估环境信号、实验变量或药理学激动剂与拮抗剂对血管特性的影响提供了理想条件。多年来，科研人员一直采用张力测定肌动描记技术，以测量内皮功能及平滑肌在不同试剂作用下的收缩性。本报告中，采用小容量腔室张力测定肌动描记系统来检测离体小鼠主动脉的内皮功能。本报告重点阐述如何利用小容量腔室张力测定肌动描记术评估大动脉（如胸主动脉）小段组织中内皮细胞功能的完整性。

本文所述的张力测量小室血管环描记法是评估大小动脉血管反应性的标准方法，可同时对同一只实验小动物来源的最多四个血管段进行血管反应性测定。在本报告中，我们特别使用该系统来测定离体小鼠主动脉的内皮功能（图1）。在本方案中，将离体的主动脉段固定在两个微小的不锈钢针之间，并置于小型器官浴槽中（图2和图3）。该血管环浴槽最多可容纳8 mL缓冲液，可在整个实验期间为离体血管提供一个半生理环境。每次实验前，必须对每个离体血管段的活性进行测试和确认，这一点至关重要。评估每个离体血管段完整性和活性的标准方案是使用高浓度氯化钾刺激组织，以诱导平滑肌细胞膜去极化。若离体血管健康且具有反应性，则可在显示器上记录到其产生的收缩力（图4）。所记录的收缩力峰值将用于后续标准化该血管段在实验过程中对激动剂（如去氧肾上腺素）刺激所产生的收缩力。为了测定内皮依赖性血管舒张功能，需先用去氧肾上腺素的亚最大浓度（10 µM）对主动脉组织进行预...

本方案描述了使用多腔室肌动图系统在实验中应用张力测定肌动图技术的原理与技术操作 离体 小鼠主动脉内皮功能评估

小体积腔室张力测定肌动描记术是一种常用技术，用于评估大小血管的血管收缩功能……

我们展示了等长或张力测功法作为在良好控制的生理条件下测量小阻力血管或大导管血管反应性的金标准方案。该测量方法具有高度的可重复性和可靠性。该技术非常有价值，可使研究人员分别研究血管的不同层次，或同时探究血管壁各层之间的相互作用。本实验操作将由我实验室的研究助理专家 Robert Folk 演示。首先打开水浴锅，并将其温度设置为 37 摄氏度。将两个标记好的烧杯放入水浴锅中，一个烧杯盛有 600 毫升 HEPES-PSS 溶液，另一个烧杯盛有 150 毫升高钾溶液。用碳酰气（carbogen）气体对含有 300 毫升 HEPES-PSS 溶液的烧杯进行通气至少 10 分钟。取 30 毫升已通气的 HEPES-PSS 溶液加入一个 50 毫升离心管中，做好相应标记后置于冰上。将剩余的已通气 HEPES-PSS 溶液也保持在冰上，用于后续主动脉分离过程。打开四腔肌动图仪，向每个肌动图腔室中加入5毫升HEPES-PSS溶液，并将温度设置为37摄氏度。使每个腔室中的溶液持续通气30分钟，并检查确认各腔室均已达到所需的37摄氏度。打开肌动图数据采集硬件及计算机。将安乐死小鼠的胸腔取出，转移至盛有冰冷充氧HEPES-PSS缓冲液的洁净硅胶弹性体包被培养皿中，并在两侧固定。在显微镜下，轻轻剪除并移除附着于肋骨的心脏和主动脉，转移至另一洁净的硅胶弹性体包被培养皿中，然后轻轻去除主动脉周围的脂肪结缔组织和凝固血液。使用锋利的小剪刀，从主动脉弓区域开始向下至降主动脉末端，逐段解剖并分离整条主动脉。将解剖好的主动脉切成四段，每段2毫米。使用培养皿内的微型刻度尺作为参考。在已含有5毫升预热并通气的HEPES-PSS缓冲液的浴槽中，用镊子小心地将每个2毫米长的主动脉段穿到两个固定针上。将腔室放回肌动图仪单元时，通过逆时针旋转千分尺缓慢移动针头分开，以防止主动脉段从针上滑脱。将每个肌动图腔室放回仪器中，并在37摄氏度下开始向腔室通气20分钟。排空腔室后，向每个腔室加入5毫升新鲜、温热且已通气的HEPES-PSS溶液。如有需要，重新调整力测量值，使其读取6毫牛顿的最佳张力。让组织再休息15至20分钟。打开数据采集软件。将追踪编号从50调至1，再从500调至1，然后按“开始”。在开始新实验之前，务必在数据采集软件中添加适当的标签。在向每个腔室加入5毫升高钾溶液之前，再次排空腔室。当高钾溶液引起的收缩反应达到产生张力的平台期时，立即再次排空浴槽。用 HEPES-PSS 溶液洗涤组织三次。向每个浴槽中加入 5 毫升高钾溶液。当高钾溶液引起的收缩反应达到张力生成平台期时，立即排出腔内液体，并用 HEPES-PSS 洗涤组织三次，随后让组织静置 15 至 20 分钟。使用血管收缩剂 PE 以亚最大剂量预先收缩主动脉节段。待 PE 诱导的收缩曲线达到张力稳定平台期。按照文稿中所述方法，在肌动仪腔室内加入乙酰胆碱工作储备液，每次5微升，每隔3分钟递增一次剂量，直至建立50皮摩尔至10微摩尔的乙酰胆碱终浓度，从而在苯肾上腺素（PE）诱导的张力基础上形成张力平台。完成剂量反应实验后，排空腔室，用温热且充氧的HEPES-PSS溶液清洗主动脉节段三次，并让组织静息30分钟。主动脉节段静息30分钟后，排空腔室，向每个腔室加入新鲜的温热高钾溶液，待高钾溶液引起的收缩反应达到F平台期时（如前所示），排空腔室并用HEPES-PSS溶液洗涤组织。为评估一氧化氮生成对乙酰胆碱诱导的血管舒张作用的贡献，可通过向浴槽中加入10微升配制好的100毫摩尔工作储备液，用L-NAME预孵育主动脉节段。不洗去L-NAME，向浴槽中加入苯肾上腺素（PE）的次最大剂量以诱导主动脉收缩。待PE诱导的收缩曲线达到张力平台期后，向肌动图浴槽中加入乙酰胆碱，使其终浓度达到500纳摩尔。等待数分钟，以记录张力变化情况，直至形成稳定的平台期。排空浴槽，并用预温的含氧HEPES-PSS溶液冲洗组织三次。将肌动描记器浴槽置于显微镜下，轻轻将一根细丝穿过主动脉管腔。将导丝在管腔内轻轻移动片刻。将主动脉切成2毫米长的血管环，并将这些血管环安装到肌动描记室中。将最佳张力设定为6毫牛顿，然后在充氧的温热HEPES-PSS缓冲液中孵育组织30分钟。随后排空描记室，并向每个室中加入5毫升新鲜的温热充氧HEPES-PSS溶液。将所有肌动描记室的张力归零，缓慢逆时针旋转微米计，增大插针之间的距离，直至记录的张力达到小鼠主动脉所需的最适张力。在最适张力下继续孵育组织15至20分钟，然后再次排空各腔室，再向每个腔室中加入5毫升高钾溶液。待组织对高钾离子溶液的收缩反应达到平台期后，再次排空腔室，并用HEPES-PSS溶液洗涤组织三次。将组织静置15至20分钟，然后用血管收缩剂PE预收缩主动脉节段。当PE诱导的张力达到平台期时，向肌张力测定仪腔室中加入亚最大浓度的乙酰胆碱，使其终浓度为500纳摩尔。等待3分钟，确保记录的PE诱导张力变化已稳定不再改变，再结束实验。通过记录每根分离血管的收缩力生成情况来评估其完整性和活性。记录到的收缩力峰值随后用于标准化同一血管段对激动剂反应所产生的收缩力。内皮介导的血管舒张测量结果表明了平滑肌介导的收缩及力的产生。当苯肾上腺素（PE）诱导的收缩达到平台期后，逐步增加乙酰胆碱剂量可使离体血管节段达到最大血管舒张效应。一氧化氮抑制剂L-NAME完全阻断了预收缩主动脉中乙酰胆碱诱导的血管舒张，表明乙酰胆碱通过增加一氧化氮的生成来诱导主动脉舒张。此外，去除主动脉节段的内皮层也阻断了乙酰胆碱诱导的血管舒张，进一步强调了内皮在血管舒张中的关键作用。在处理、清洗和解剖血管时务必轻柔。将药理学激动剂和抑制剂加入肌动图仪腔室时需格外小心，以避免干扰已固定的血管环。这些信息有助于设计实验，探索针对特定血管各层功能障碍的潜在治疗策略。

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科研

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Biology

生物学

使用张力测量小体积腔肌图测量小鼠胸主动脉内皮依赖性血管松弛

本文介绍了一种用于离体肠系膜动脉张力测量的自动化肌动图方法。该方法采用Mulvany-Halpern自动双丝肌动仪510A，测定血管对苯肾上腺素和细胞外钙的反应。该技术可独立、一致地测定直径为60 - 300...

使用自动化的丝线肌动描记法研究肠系膜动脉的收缩与舒张

在压力肌动描记术中，将一段完整的小血管段固定在两个微小套管上，并加压至适宜的管腔压力。本文中，我们描述了测定小鼠第3rd C57和sGCα中肠系膜动脉的排序1-/-...

使用压力肌动图评估小鼠阻力动脉功能

压力肌动描记法用于评估小动脉在加压时产生持续性收缩的血管活性。本文提供了一项详细方案，用于评估从大鼠分离的小肠系膜动脉节段的血管活性，以及管腔内压力对血管直径的影响。...

利用压力肌动图评估肠系膜阻力动脉的肌源性反应和血管活性

内皮功能障碍与多种疾病状态相关，并可预测人类不良心血管事件。血流介导的血管舒张（FMD）是一种评估内皮功能的无创超声方法。方法学选择和操作者经验可能影响结果。本文讨论了在人类研究中系统化实施FMD的方案。...

临床研究中肱动脉内皮依赖性血流介导血管舒张功能的超声评估

我们介绍一种通过主动脉压力-直径关系来测量主动脉僵硬度的技术 体内...

测量升主动脉僵硬度 体内 在小鼠中使用超声成像

视频显微系统可用于研究分离的脂肪组织小动脉在生理和药理刺激下的功能特性。该技术可用于检测肥胖人群中不同脂肪组织区域的微血管表型。...

利用视频显微镜评估人体脂肪组织微血管功能

利用大鼠离体阻力动脉视频显微技术评估血管调控机制

血管环张力测定技术用于研究血管平滑肌功能并筛选新药。本文报道了一种详细方案，用于测定小鼠肠系膜动脉的等长收缩力，并用于筛选血管平滑肌新的舒张剂。...

利用血管环张力测定法测量小鼠肠系膜动脉的等长收缩力

在缺氧条件下进行高强度训练是一种已被证实可诱导血管适应的方案，这种适应可能对某些患者有益，并能提高运动员的重复冲刺能力。在此，我们测试了在小鼠中采用该方案进行训练的可行性，并通过离体血管功能评估来鉴定这些血管适应性变化。...

小鼠超最大强度低氧运动与血管功能评估

本方案描述了利用导丝肌动图技术评估从小鼠分离的肠系膜动脉的透壁等长张力的方法，特别关注内皮细胞和血管周围脂肪组织释放因子的调节作用。...

利用离体肠系膜动脉评估血管张力反应性：重点关注血管周围脂肪组织的调节作用

学习使用张力测量肌图技术评估小鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能。该方法可在严格控制的生理条件下精确测量血管反应性，为研究血管生物学和心血管疾病机制提供可靠工具。

使用张力测定小体积腔室血管肌动描记法测量小鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能

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