评估肺炎消退的实验模型
2023年2月17日
该手稿描述了小鼠肺炎感染模型的建立和损伤消退的相应表征，以及培养细菌和气管内滴注的方法。还描述了一种使用高维流式细胞术来评估免疫景观的新方法。
该协议提供了一种可重复的肺炎模型，可产生稳健的急性肺损伤。该模型的其他优点是可用于在小鼠中重现传染性ARDS或急性呼吸窘迫综合征。正如我所提到的，该模型具有高度的可重复性，其中可以很容易地滴定死亡率和损伤水平，以评估急性肺损伤的早期和晚期阶段和消退情况，从而作为评估治疗策略的平台。
尽管该协议没有提供诊断或治疗肺损伤的新方法，但它是一种可靠的模型，可以测试新疗法，这对于与免疫学、肺部疾病和传染病相关的领域特别有用。该技术的优点之一是其可重复性。但是，首次使用这种技术的人可能会在气管内插入导管时遇到困难。
这就是为什么理想情况下，学习这种技术的人应该开始在安乐死的动物身上练习。首先，在加热的振荡器或培养箱中将血琼脂板在 37 摄氏度下加热 10 分钟。从冰箱中取出一个新的细菌储备瓶，在 37 摄氏度的水浴中轻轻搅拌解冻，直到小瓶完全解冻。
避免用温水接触 O 形圈或盖子。要手动计数平板上的细菌菌落，请进行 1 次 10 到六分之一的稀释，并在预热的血琼脂平板上从最后一次稀释开始铺板 200 微升。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。
第二天，通过应用给定的公式确定新的细菌浓度。将麻醉的小鼠放在干净且消毒的表面上。将鼠标挂在门牙上，然后轻轻地用胶带粘住前肢。
剃除颈部区域并用氯己定和 70% 酒精消毒该区域。然后使用手术剪刀，在颈部浅中线切口做一个一厘米的浅中线切口，以观察气管。如果看到大量的脂肪组织，请小心地垂直解剖脂肪组织，以观察气管。
轻轻地将舌头向外拉，将一根 20 号的血管导管插入口腔，将导管推进气管。在气管上轻轻按压，以利于插管。插管后，将鼠标连接到呼吸器以确认插管。
将呼吸机参数设置为 200 微升潮气量和每分钟 200 次冲程。确认插管后，断开鼠标与呼吸器的连接，并使用 200 微升移液管凝胶加载吸头小心地通过血管导管滴入 50 微升细菌制剂。安装后，再次将鼠标连接到呼吸器以帮助重新开始呼吸。
将鼠标放在呼吸器上 30 到 60 秒以监测呼吸。如果观察到呼吸缓慢，请再次将鼠标连接到呼吸器。通过在皮肤上滴一滴胶水来闭合切口。
将皮肤褶皱合拢，轻轻按压，直到胶水变干。将安乐死的小鼠仰卧在干净的手术板上，并将其挂在门牙上。用70%乙醇喷洒小鼠皮肤后，使用剪刀进行一个小的浅表中线颈部切除术，以观察气管。
用 20 号导管插管气管，并使用 1 毫升注射器小心地在气管内加入 1 毫升无钙 PBS。让肺完全扩张，然后使用同一注射器吸出液体。重复该过程两次，总共 2 毫升。
将支气管肺泡灌洗液（BAL）转移到 2 毫升等分试样中。用剪刀打开胸腔，露出肺、心脏和气管。小心地解剖横膈膜并取下肋骨架，确保不要夹到肺组织。
横断腹主动脉以允许放血。使用剪刀在右心室做一个约 1 至 2 毫米的小切口，并使用 20 号导管注射 5 毫升冷 PBS，灌注肺组织。成功灌注后，肺组织变白苍白，PBS通过腹主动脉离开血管内隔室。
然后小心地取出肺并将其从气管中解剖出来。或者，如果肺用于组织学检查，请小心地插入一根 20 号导管，用福尔马林溶液将肺部充气至 25 厘米。一旦肺部被吹气，将一根长约 5 厘米的 3/O 缝合线穿过气管下方，并将其牢固地系住两次，以确保福尔马林留在肺组织中。
轻轻地将肺与其他组织解剖，并将其放入含有 10 毫升福尔马林溶液的 15 毫升锥形管中。将 BAL 在 4 摄氏度下以 500 G 离心 5 分钟，然后在单独的管中除去无细胞上清液。通过加入 100 微升裂解缓冲液一分钟来裂解红细胞。
通过加入一毫升PBS中和裂解反应。离心 BAL，并除去上清液，然后将沉淀重新悬浮于 100 至 300 微升 PBS 中。接下来，通过自动细胞计数用 0.4% 台盼蓝染色剂进行细胞计数。
在含有 5 毫升冷 PBS 的 15 毫升锥形管中轻轻地从组织中解剖肺。解剖后，从PBS中取出肺并用纸巾擦干。从也已摘除的其他组织（如气管）中解剖右肺和左肺。
按照文本手稿中的描述准备消化鸡尾酒，并将肺转移到含有一毫升消化鸡尾酒的 C 管中。将试管转移到组织解离器中，并按照标准化方案处理肺组织。解离后，将 10 毫升冷 PBS 加入管中并适当混合。
在冰上的50毫升锥形管上使用70微米细胞过滤器过滤单细胞悬浮液。离心悬浮液并除去上清液。在室温下加入 1 mm 裂解缓冲液 1 分钟。
然后加入 10 毫升冷 PBS 以停止裂解反应并除去上清液。将细胞重新悬浮在PBS中，并通过自动细胞计数用台盼蓝染色剂进行细胞计数。在细菌性肺炎诱导的小鼠肺损伤后，与未感染的对照组相比，感染组的体重更轻。
肺炎链球菌或Spn组的体重在接近基线时恢复，而肺炎克雷伯菌或Kpn感染的小鼠在感染六天后恢复缓慢。感染组的BAL蛋白浓度以及BAL和肺的总细胞计数均明显较高。在接种后第二天、第四天和第六天获得显示两种模型中炎症过程的代表性组织学切片，显示 Kpn 感染小鼠持续肺泡炎症的证据，即使在第 10 天也是如此。
Kpn感染的小鼠在第10天继续损伤，而Spn感染的小鼠在第6天解决了肺部炎症。通过多色流式细胞术观察 Spn 感染 6 天后的免疫细胞景观显示粒细胞、间质巨噬细胞、单核细胞、B 细胞和 T 细胞（包括自然杀伤细胞）数量增加。在尝试这种方法时，插入导管是造成可复制感染的关键。
这是一种可靠的方法，可作为确定急性肺损伤研究和解决靶点的平台。
概述
本手稿提出了一种可重复的小鼠肺炎模型，便于研究急性肺损伤及其恢复。该模型允许评估与传染性疾病和肺部疾病相关的治疗策略。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 传染病
背景
- 该模型产生了强烈的急性肺损伤。
- 它可以在小鼠中重现传染性ARDS。
- 可重复性允许对死亡率和损伤水平进行滴定。
- 有助于测试相关领域的新疗法。
研究目的
- 建立可靠的小鼠肺炎模型。
- 使用高维流式细胞术评估免疫景观。
- 为评估治疗策略提供平台。
使用的方法
- 气管内注入细菌剂。
- 支气管肺泡灌洗以进行免疫细胞分析。
- 肺组织的组织学检查。
- 流式细胞术用于免疫分析。
主要结果
- 该模型高度可重复，并允许对受控损伤进行评估。
- 成功评估了肺损伤中的免疫反应。
- 促进了新的治疗干预措施的测试。
- 提供了关于肺损伤恢复的见解。
结论
- 这种肺炎模型是研究肺部疾病的有价值工具。
- 它支持急性肺损伤的新治疗方法的开发。
- 未来的研究可以利用这个模型获得更多免疫学见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust preclinical models that recapitulate the complexity of human ARDS are critical for de-risking early-stage pulmonary drug discovery. This reproducible murine pneumonia model enables systematic evaluation of lung injury, immune landscape, and resolution phases, supporting predictive confidence in target validation and therapeutic hypothesis testing. Its capacity for titratable injury and high-dimensional immune profiling positions it as a strategic asset for portfolio triage and translational research in respiratory disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in acute lung injury and resolution.
- Supports biological de-risking by modeling key ARDS pathophysiological features.
- Facilitates functional target validation through immune cell landscape analysis.
- Provides a platform for mechanistic studies of lung injury and repair.
Screening & Assay Development
- Prepares validated disease-relevant systems for downstream compound evaluation.
- Delivers reproducible and quantitative outputs such as BAL protein, cell counts, and histology.
- Supports assay standardization and scalability for screening readiness.
- Enables reliable assessment of therapeutic interventions in a controlled setting.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of pulmonary targets.
- Provides risk-adjusted advancement criteria based on immune and injury resolution metrics.
- Offers predictive de-risking for late-stage biological risk in respiratory portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in respiratory disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in acute lung injury and resolution.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay development and compound triage.
- Analytics: Enables high-dimensional flow cytometry and quantitative measurement of injury markers.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases with disease-relevant immune and injury endpoints.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating diverse therapeutic strategies in pulmonary research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for lung injury modeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust preclinical evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of respiratory disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and respiratory physiology.
- Demands access to instrumentation for intubation, BAL, and flow cytometry.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable across infectious agents and injury severities for model flexibility.
- Initial technical challenges in catheter insertion may require training on euthanized animals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:11
Bacteria Thawing for Intratracheal Instillation
2:00
Intratracheal Instillation of Live Bacteria
3:44
Bronchoalveolar Lavage (BAL) and Lung Harvest
5:55
Bronchoalveolar Lavage Processing
6:38
Lung Processing for Single Cell Suspension
8:01
Results: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia
9:29
Conclusion
