Name: 评估肺炎消退的实验模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 了解小鼠肺炎消退实验模型，通过气管内滴注细菌建立急性肺损伤模型，利用支气管肺泡灌洗和流式细胞术评估免疫反应。该可重复模型为感染性疾病和肺部疾病的治疗策略研究提供可靠平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01 HL131812 和 R01HL163881。

本研究中描述的所有动物实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学医学院机构动物护理和使用委员会（ACUC）批准，动物实验方案编号为MO21M160。此外，实验严格遵循机构、州及联邦层面关于动物研究的相关法规进行。
警告：以下所述所有实验方案的实施均须在生物安全二级（BSL-2）柜中进行，并严格遵守机构规定的生物安全柜内BSL-2操作规范。
1. 从商用菌环接种细菌菌种
注意：本方案可用于培养肺炎链球菌（Spn，ATCC 49619）和肺炎克雷伯菌（Kpn，ATCC 43816）的菌种，起始材料为供应商提供的接种环（详见材料表）。
<ol>
	<li>在培养箱中将5%羊血琼脂平板于37 °C预热15分钟。可使用细胞培养箱完成此步骤。</li>
	<li>在生物安全柜中，取下细菌接种环的保护鞘，小心展开，以锯齿形模式在琼脂平板表面划线接种。使用另一块平板重复此操作，作为平行重复。同一接种环最多可用于划线五块平板。</li>
	<li>将平板于37 °C培养过夜，以获得最佳细菌生长。连续传代培养细菌3天，每天一次。每天先将血琼脂平板于37 °C预热15分钟，然后用一次性接种环从前一天的琼脂平板上挑取15至20个菌落，均匀涂布接种于新的、已预热的琼脂平板上。正确标记平板信息。</li>
</ol>
2. 细菌的培养与保藏以备后续使用
<ol>
	<li>3天后，用划线环从血琼脂平板上挑取最多30个菌落，直接放入含有250 mL Todd Hewitt肉汤（TH肉汤）的250 mL锥形瓶中。在37 °C、250 rpm振荡、5% CO2条件下培养约4小时。</li>
	<li>每15分钟取一次等分试样，测定OD620nm，直至达到0.3，相当于每毫升约3 × 108个菌落形成单位（CFU）。</li>
	<li>立即取1 mL新鲜细菌培养物分装至2 mL冻存管中。将分装好的冻存管在液氮中速冻5分钟。将细菌分装样品储存于-80 °C超低温冰箱中（冻存管可在6至8个月内使用，之后活性会下降）。</li>
	<li>冻存7天后，可将分装样品用于动物实验。因此，需测定细菌的新浓度。</li>
</ol>
3. 气管内滴注用细菌的解冻
<ol>
	<li>将血琼脂平板置于37 °C摇床中预热10分钟。从冰箱中取出一支新的菌种保存管，在37 °C水浴中轻轻振荡约2分钟使其融化。注意避免温水接触O型圈或瓶盖。</li>
	<li>在血琼脂平板上进行涂布，以便手动计数细菌菌落。进行1 × 10-6倍稀释，取最后一次稀释液200 µL接种至预热的血琼脂平板上，设两个重复。</li>
	<li>将平板在37 °C条件下孵育过夜，以获得细菌的最佳生长。次日，使用以下公式计算新的细菌浓度：CFU/mL = （菌落数 × 稀释倍数）/ 接种的菌液体积</li>
</ol>
4. 气管内接种活细菌
注意：本方案已优化为经气管内接种50 µL体积。细菌储备液可保存6至9个月。为确保每管中的细菌菌落形成单位（CFU），每次实验前务必进行平板计数，按上述方法计算细菌储备液的CFU，并使用TH肉汤进行后续稀释。
警告：在生物安全柜内，使用无菌外科器械对啮齿类动物进行存活手术操作。
<ol>
	<li>通过腹腔注射每公斤体重100 mg的氯胺酮和每公斤体重2.5 mg的乙酰丙嗪使小鼠麻醉。对同时注射的小鼠数量重复此操作。 
	注意：可使用异氟烷暴露以方便动物操作。然而，有经验的操作者若能进行腹腔注射麻醉而不引起明显动物应激，则可避免使用异氟烷。一次注射的小鼠数量取决于手术者的熟练程度。</li>
	<li>所有小鼠均进入适当麻醉状态后，通过夹捏尾巴确认麻醉效果。将麻醉后的小鼠置于清洁且灭菌的表面上，用门齿悬挂动物，并轻轻用胶带固定前肢（图1A）。 
	注意：为确保动物福利，应对所有麻醉动物提供角膜润滑。可使用羧甲基纤维素眼药水，每眼一滴。</li>
	<li>剃除颈部区域毛发，并用氯己定和70%酒精对该区域进行消毒&#160;。使用手术剪在颈部正中做一长约1 cm的浅表切口，以暴露气管（图1B）。通常一个切口已足够，但如果脂肪组织较多，需沿纵轴小心分离脂肪组织以暴露气管。&#160; 
	注意：应使用无菌手套并通过仅接触器械尖端的技术使用无菌器械。&#160;若在无菌条件下操作，感染风险极低。</li>
	<li>使用镊子对每只小鼠进行插管。轻柔地将舌头向外牵拉，经口腔插入一根20 G套管针，将导管推进至气管内。对气管施加轻柔压力以辅助插管。 
	注意：由于小鼠气管位于身体前侧，建议将导管尖端略微弯曲，有助于获得成功插管所需的角度。颈部切口主要用于可视化观察；操作者也可在无直视情况下盲探插管。</li>
	<li>插管完成后，将小鼠连接至呼吸机以确认插管位置正确。本操作中常用的呼吸机参数为每搏通气量200 µL，呼吸频率200次/分钟。可短暂调高或调低呼吸频率，以便快速简便地确认通气效果。</li>
	<li>确认插管成功后，断开小鼠与呼吸机的连接，使用200 µL移液器加样头经套管针小心注入50 µL细菌制剂。对于对照组小鼠，注入50 µL无菌TH肉汤。</li>
	<li>注入细菌制剂后，再次将小鼠连接至呼吸机以帮助恢复自主呼吸。让小鼠在呼吸机上维持30–60秒。完成所有小鼠注射后，密切监测其呼吸情况。若出现呼吸缓慢，应再次将小鼠连接至呼吸机。</li>
	<li>在皮肤上滴加一小滴医用胶水关闭切口。将皮肤褶皱对合，并施加轻柔压力直至胶水干燥。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上恢复，并密切观察直至其意识充分恢复。完全恢复后将其转移回笼中。术后如需进行疼痛/应激管理，可皮下注射（SC）0.05–0.1 mg/kg剂量的丁丙诺啡进行处理。 
	&#8203;注意：若动物术后体重减轻超过20%，或出现明显应激表现，如嗜睡、无法接触饮水或食物、呼吸困难、对外界刺激反应能力下降或精神警觉性降低，应实施安乐死。</li>
</ol>
5. 支气管肺泡灌洗与肺组织采集
<ol>
	<li>将小鼠放入含有5%异氟烷的密闭容器中实施安乐死。在小鼠停止呼吸后继续暴露于异氟烷1分钟。进行开胸术以确认死亡状态。 
	注意：通过视觉和体格检查确认安乐死。心脏必须已停止跳动，小鼠无呼吸。黏膜应呈白色或苍白。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置于洁净的手术板上，并用门齿悬挂固定。用70%乙醇喷洒小鼠皮肤。使用手术剪在颈部正中线做一小的浅表切口，以暴露小鼠气管。</li>
	<li>用20 G导管插管气管。使用1 mL注射器小心地将1 mL无钙磷酸盐缓冲液（PBS）经气管注入。使肺充分扩张后，再用同一注射器抽吸回收液体。重复此步骤，共收集2 mL灌洗液。</li>
	<li>将支气管肺泡灌洗液（BAL）转移至2 mL离心管中。此步骤重复两次，最终总体积为2 mL。每次灌洗液量不得超过1 mL，以免造成肺泡空间破坏的风险升高。</li>
	<li>用剪刀和镊子打开胸腔，暴露肺、心脏和气管。小心分离膈肌并移除肋骨 cage。操作时注意避免夹伤肺组织。</li>
	<li>横断腹主动脉以允许放血。用剪刀在右心室做约2 mm的小切口，插入20 G导管，注入5 mL冷PBS进行肺组织灌注。PBS应流经肺组织。若灌注充分，肺组织将变为苍白白色，PBS将从血管腔经腹主动脉流出。</li>
	<li>小心取出肺组织，并从气管处分离，用于组织学检查或进一步制备单细胞悬液。</li>
	<li>若用于组织学处理，小心插入20 G导管，用10%中性缓冲福尔马林溶液对肺进行充气，压力至25 cm H2O。肺充分膨胀后，在气管下方穿过一段长约5 cm的3.0缝合线，牢固打结两次，以确保福尔马林保留在肺组织内。轻柔地将肺从周围组织中分离，放入含有10 mL福尔马林溶液的15 mL锥形管中。</li>
</ol>
6. 支气管肺泡灌洗液处理
<ol>
	<li>将支气管肺泡灌洗液（BAL）在 4 °C 条件下以 500 ×g 离心 5 分钟。将无细胞的上清液转移至另一管中，并于 -80 °C 保存。 
	注意：可对 BAL 上清液进行进一步分析，包括蛋白质定量（例如 BCA 法13）或特定生物标志物或细胞因子的检测（如 ELISA 检测，以及使用 MSD 和 Luminex 等平台进行的多重检测）。</li>
	<li>加入 100 µL 红细胞裂解缓冲液，裂解红细胞 1 分钟。随后加入 1 mL PBS 中和裂解反应。将 BAL 在 4 °C 条件下以 500 ×g 离心 5 分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用 PBS 重悬细胞（100–300 µL，根据细胞沉淀量调整）。使用 0.4% 台盼蓝染色液通过手动或自动细胞计数法进行细胞计数。剩余细胞沉淀可用于流式细胞术染色，和/或用冷冻保存液重悬后置于液氮中冷冻保存，以备后续检测。</li>
</ol>
7. 肺组织单细胞悬液制备
<ol>
	<li>轻柔地将肺组织从其他组织中分离，并放入含有 5 mL 冷 PBS 的 15 mL 锥形管中。将肺组织从 PBS 中取出，用纸巾吸干。</li>
	<li>在 1 mL 低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入 1 mg DNase 和 5 mg 胶原酶，配制消化液。将肺组织转移至含有 1 mL 消化液的 C 管中。</li>
	<li>将 C 管放入组织解离仪中，按照标准操作程序处理肺组织14。</li>
	<li>向 C 管中加入 10 mL 冷 PBS 并充分混匀。使用置于 50 mL 锥形管上方的 70 µm 细胞筛过滤单细胞悬液。重复过滤两次。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 xg 离心 5 分钟。小心弃去上清液，加入 1 mL 裂解缓冲液，在室温下作用 1 分钟。加入 10 mL 冷 PBS 终止裂解反应，再次离心并去除上清液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 xg 离心 5 分钟。小心弃去上清液，加入 10 mL 冷 PBS。</li>
	<li>使用台盼蓝染色进行手工或自动细胞计数。取细胞沉淀用于流式细胞术染色，和/或在液氮中冷冻保存以备后续检测。</li>
</ol>

<ol><li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+patterns+of+care%2C+and+mortality+for+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+in+intensive+care+units+in+50+countries%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries.</a> JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>Hariri, L., Hardin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%2C+angiogenesis%2C+and+ARDS+endotypes%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Covid-19, angiogenesis, and ARDS endotypes.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (2), 182-183 (2020).</li>
<li>Ferguson, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berlin+definition+of+ARDS%3A+an+expanded+rationale%2C+justification%2C+and+supplementary+material%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Berlin definition of ARDS: an expanded rationale, justification, and supplementary material.</a> Intensive Care Medicine. 38 (10), 1573-1582 (2012).</li>
<li>Tomashefski Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+pathology+of+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary pathology of the adult respiratory distress syndrome.</a> Clinics in Chest Medicine. 11 (4), 593-619 (1990).</li>
<li>Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cytokines+and+ARDS%3A+Roger+S.+Mitchell+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Lung cytokines and ARDS: Roger S. Mitchell lecture.</a> Chest. 116 (1 Suppl), 2S-8S (1999).</li>
<li>Colletti, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor-alpha+in+the+pathophysiologic+alterations+after+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor-alpha in the pathophysiologic alterations after hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat.</a> The Journal of Clinical Investigation. 85 (6), 1936-1943 (1990).</li>
<li>Donnelly, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+mortality+rates+and+decreased+concentrations+of+interleukin-10+and+interleukin-1+receptor+antagonist+in+the+lung+fluids+of+patients+with+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The association between mortality rates and decreased concentrations of interleukin-10 and interleukin-1 receptor antagonist in the lung fluids of patients with the adult respiratory distress syndrome.</a> Annals of Internal Medicine. 125 (3), 191-196 (1996).</li>
<li>Miller, E. J., Cohen, A. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+interleukin-8+concentrations+in+the+pulmonary+edema+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased interleukin-8 concentrations in the pulmonary edema fluid of patients with acute respiratory distress syndrome from sepsis.</a> Critical Care Medicine. 24 (9), 1448-1454 (1996).</li>
<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (5), 725-738 (2011).</li>
<li>Kulkarni, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%3A+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), e1-e14 (2022).</li>
<li>Borsa, N., Pasquale, M. D., Restrepo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models of pneumococcal pneumonia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4220(2019).</li>
<li>Rubins, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+pneumolysin+in+the+early+pathogenesis+of+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Dual function of pneumolysin in the early pathogenesis of murine pneumococcal pneumonia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 95 (1), 142-150 (1995).</li>
<li>Thermo Scientific, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pierce+BCA+Protein+Assay+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pierce BCA Protein Assay Kit.</a> , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23225 Forthcoming.</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1266(2009).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+a+review+of+analytical+approaches%2C+pathologic+features%2C+and+common+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute respiratory distress syndrome: a review of analytical approaches, pathologic features, and common measurements.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1074-1092 (2015).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Pneumonia.</a> Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 25(2021).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+resolves+pneumonia+via+ER%CE%B2+in+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Estradiol resolves pneumonia via ERβ in regulatory T cells.</a> JCI Insight. 6 (3), e133251(2021).</li>
<li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resolution+of+experimental+ARDS+through+IL-4-mediated+lung+macrophage+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced resolution of experimental ARDS through IL-4-mediated lung macrophage reprogramming.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (8), L733-L746 (2016).</li>
<li>D'Alessio, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+lung+injury+and+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute lung injury and ARDS.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).</li>
<li>Gotts, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+model+of+pneumococcal+pneumonia%2C+ARDS%2C+and+nonpulmonary+organ+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), L717-L736 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肺炎（PNA）的小鼠实验模型为评估急性呼吸窘迫综合征（ARDS）发生与恢复过程中的细胞和分子机制提供了平台。可评估的病理生理学组分包括早期炎症通路、细菌清除、动态免疫微环境变化、炎症消退、纤维增殖以及上皮和血管修复16。然而，在计划复制这种肺炎诱导的肺损伤模型时，必须考虑多个因素，包括动物年龄、性别、小鼠品系、宿主内在因素（例如免疫功能低下状态）、所用特定病原体及其细菌载量，以及操作人员的技术熟练程度。
肺炎是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的主要病因之一。我们选择使用活的Spn和Kpn&#160;，它们分别是人类社区获得性和医院获得性肺炎（PNA）的常见致病菌17。我们建议通过滴定活菌剂量来优化PNA的细菌模型，以达到符合研究者假设的预期死亡率和损伤恢复特征。我们已优化出小鼠气管内接种剂量：Spn为3 × 106 CFU，Kpn为200 CFU，该剂量可引起肺泡炎症、肺泡-毛细血管屏障破坏及器官功能障碍（图2）。然而，即使使用相同菌株和CFU数，不同来源的细菌批次，甚至同一批次内的重复实验，也可能表现出不同程度的炎症和损伤。
因此，为了重复本文所述的实验结果，研究人员应从本文描述的细菌浓度开始；但可能需要增加或减少剂量，以获得相似的模型特征。因此，每一批新使用的细菌都需要优化其在损伤修复方面的潜在效应。我们提供了一种稳定的肺炎模型，具有两种不同的修复结局：一种为自限性修复（Spn），另一种为缓慢或非自限性修复（Kpn），可作为研究者评估免疫机制及测试治疗干预措施的平台，特别是在感染高峰时或之后（例如感染后第2天）进行研究。
年龄、性别、品系和遗传因素均会影响损伤消退过程的动力学特征16。例如，与雄性相比，雌性表现出更快的消退速度18；因此，细菌负荷增加会导致雄性比雌性出现更高的死亡率和更延迟的消退。在确定所用细菌的菌落形成单位（CFU）时，衰老是另一个需要考虑的因素。当我们使用指定剂量的Spn时，老年小鼠表现出100%的死亡率（此处未显示）。在肺炎链球菌性肺炎（PNA）模型中，最常使用的是年轻小鼠（6至14周龄），而老年小鼠（19至26月龄）则表现出改变的免疫反应，常用于研究衰老在PNA中的作用11。为了使老年动物存活，我们必须将CFU降低至原定剂量的300%以下（此处未显示）。本研究使用了雄性C57BL/6小鼠（8至12周龄），并在感染后6至10天内进行观察。不同品系之间在易感性方面也存在显著差异；例如，近交系BALB/C和C57BL/6J对感染的反应不同11,19。
通过气管内直接接种细菌可将接种物更精确地递送至肺部（递送效率高达99%）12，该方法为毒力较弱的血清型提供了一种替代方案，并可减少细菌的气溶胶化11。然而，该操作属于侵入性 procedure，可能存在争议。气管插管操作具有挑战性，需要全身麻醉，且可能导致气管损伤，继而引发气道水肿和喘鸣。小鼠可能出现血管迷走性反射，导致呼吸暂停，因此需配备小型小鼠呼吸机，以便在必要时提供通气支持。实施该操作的外科医师的技术水平是确保成功插管的关键因素之一11。在本研究中，由于实施了适当的疼痛管理，且小鼠体重减轻未超过20%，未出现需实施安乐死的情况。未观察到嗜睡、无法接触饮水或食物、呼吸困难或精神警觉性下降等疼痛与痛苦的迹象。另一种将细菌直接递送至肺部的方法是经口咽部吸入法，但肺损伤的恢复似乎更快，且部分细菌可能进入胃部和胃肠道20。
PNA 的临床前模型使研究人员能够评估免疫微环境。可对支气管肺泡腔和间质腔室中的免疫细胞动态变化进行分析。16此外，细胞可以进行培养和刺激 离体 以确定其特定细胞因子和趋化因子的产生情况。本文重点利用多色流式细胞术探讨肺组织和支气管肺泡灌洗液（BAL）中的免疫细胞图谱。此外，还可进行单细胞RNA测序，以解析损伤修复不同阶段中各类细胞特异性的转录组特征。
肺炎链球菌性PNA-ARDS模型可引发全身性效应，这些效应在疾病发展过程中通过监测体重可早期检测到10。尽管我们不直接测量ARDS的全身性效应，但可通过血液生化谱分析评估器官功能障碍，并通过采集脾脏、肾脏和肝脏等不同组织进行组织学检查。其他研究团队已使用相同菌株对肺炎链球菌性PNA-ARDS的全身性效应进行了既往报道21。
本文描述了一种实验性PNA模型，该模型模拟了人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中一些关键的病理生理学特征。尽管目前尚无能够完全重现人类ARDS复杂性和异质性的理想模型9，但这些模型在研究肺损伤与修复机制方面具有相关性和可重复性，同时也可作为发现新的潜在药物靶点的平台，旨在加速肺部炎症的消退并促进肺组织修复。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Host infection response graphs; body weight, protein, cell counts vs. days; infection comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">
to:
<img alt="Body weight and immune cell count graphs; infection time course; statistical analysis; infection study." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.

Erratum: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）仍是一种常见的致命性且致残的综合征，影响约10%的重症监护病房（ICU）患者以及高达23%的机械通气患者，导致住院死亡率高达35%–46%1。此外，近期的COVID-19大流行再次凸显了研究ARDS的重要性。COVID-19阳性病例导致ARDS死亡率上升，突显了药物治疗的局限性2。
在人类中，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的特点是迅速出现低氧血症（PaO2/FiO2 &#60; 300），并伴有因肺泡-毛细血管通透性过度增加和肺泡炎导致的非心源性双侧肺水肿证据3。尽管ARDS传统上被描述为由多种损伤继发的急性肺损伤（ALI）的一种表现形式，但细菌性和病毒性肺炎（PNA）仍是其最常见的病因之一。目前已描述了三个主要的病理生理阶段，即渗出期、增殖期和纤维化期，而ARDS的两个核心特征为炎症反应失调和肺泡-毛细血管屏障破坏4。在这些过程中，肺泡损伤由炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子[TNF-α]、白细胞介素[IL-1β、IL-6、IL-8等]）的释放、中性粒细胞和炎性巨噬细胞的浸润以及富含蛋白质的液体渗出所引起。最终，这些事件导致斑片状且双侧对称的肺泡损伤5,6,7,8。
尽管在理解早期肺损伤和炎症方面已取得显著进展，但肺炎（PNA）消退背后的机制仍知之甚少，应成为未来机制研究的重点。本文的主要目的是为研究人员提供一种可复制急性呼吸窘迫综合征（ARDS）主要病理生理特征的感染性肺炎损伤-消退模型。我们提出，该模型将有助于更深入地理解肺部炎症消退与修复背后的生物学机制，从而为挽救性治疗策略提供一个研究平台。
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）期间发生的主要病理生理阶段可在急性肺损伤（ALI）的临床前动物模型中复制，这些模型应包括炎症反应、组织损伤、生理功能障碍、肺泡炎以及肺泡-毛细血管屏障改变的组织学证据9。诱导肺炎（PNA）和ALI的小鼠模型具有优势，因其具有高度可重复性、繁殖速度快，并且具备多种可用于开展机制和分子研究的工具。目前尚无单一模型能够完全再现人类ARDS的所有特征9。
小鼠PNA模型能够复制感染性ARDS在人体中产生的关键病理生理机制，例如快速发病、组织学上可见的组织损伤、肺泡-毛细血管屏障功能障碍、炎症反应证据以及生理功能紊乱，同时保持较低的死亡率10。感染性模型可通过局部或全身递送病原体来建立，其中鼻内、气管内和静脉注射是最常用的给药途径。气管内给药可将病原体直接接种至肺部，减少气溶胶化，并优化递送效率11,12。
本文描述了一种通过气管内滴注活的Streptococcus pneumoniae (Spn)或Klebsiella pneumoniae (Kp)建立小鼠细菌性肺炎（PNA）的临床前动物模型的方法。这些模型能够良好地模拟由细菌性肺炎引发的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），具有多项优势，包括：所用病原体是导致人类肺炎相关ARDS的主要病因（涵盖社区获得性和医院获得性感染）；模型可重复性高；可通过调节感染剂量精确控制死亡率和肺损伤程度（以模拟不同程度的肺部炎症），从而产生显著的炎症反应，引发肺泡炎和肺泡-毛细血管功能障碍；可评估肺损伤的早期与晚期阶段及其修复过程；并可在肺炎相关ARDS的不同病程阶段评价治疗策略的效果。

<table><tbody><tr><td>1-200 &amp;micro;L 圆底 0.5 mm 厚凝胶加样吸头</td><td>Corning</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 冻存管</td><td>Corning Incorporated</td><td>431420</td><td>2 mL 自立式，圆底，红色盖，聚丙烯材质</td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf&amp;nbsp;快封盖微量离心生物纯安全锁管</td><td>Fisherscientific</td><td>05-402-24C</td><td>形状：&amp;nbsp;圆形，长度（公制）：&amp;nbsp;38 mm，外径（公制）：&amp;nbsp;10 mm，容量（公制）：&amp;nbsp;2 mL</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>白色，无菌，独立包装</td></tr><tr><td>96 孔透明圆底</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td>&amp;nbsp;经组织培养处理的细胞培养微孔板，带盖，独立包装，无菌</td></tr><tr><td>马来酸乙酰丙嗪注射液，USP 500 mg/50 mL (10 mg/mL)</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-604-04</td><td>每毫升含：马来酸乙酰丙嗪 10 mg、柠檬酸钠 0.36%、柠檬酸 0.075%、苯甲醇 1% 及注射用水</td></tr><tr><td>氯化铵-氯化钾 (ACK) 裂解缓冲液</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-721</td><td>4 × 100 mL</td></tr><tr><td>抗小鼠 I-A/I-E 抗体</td><td>Biolegend</td><td>107628</td><td>APC/Cy7 标记抗小鼠 I-A/I-E [M5/114.15.2]；同型对照：大鼠 IgG2b</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BD 胰蛋白酶大豆琼脂&amp;nbsp;</td><td>BD-Biosciences</td><td>90001-276</td><td>含 5% 羊血的预置培养基叠层平板，BD 诊断</td></tr><tr><td>Biotix 一次性试剂储液槽</td><td>Biotix</td><td>89511-194</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Invitrogen</td><td>509723</td><td>整合素 αE， Armenian Hamster 抗小鼠，FITC 标记，克隆号：2E7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Invitrogen</td><td>RM2817</td><td>PE-Texas Red 标记，克隆号：M1/70.15，Invitrogen</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>565872</td><td>仓鼠抗小鼠，APC-R700 标记，克隆号：N418，BD Horizon</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>APC 标记抗小鼠 CD19 [1D3/CD19]；同型对照：大鼠 IgG2a, &amp;kappa;</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>563450</td><td>大鼠抗小鼠，Brilliant Violet 711 标记，克隆号：M1/69</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>563790</td><td>BUV395 标记；克隆号：GK1.5</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td>103157</td><td>Brilliant Violet 750 标记抗小鼠 CD45 [30-F11]；同型对照：大鼠 IgG2b, &amp;kappa;；</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>612759</td><td>大鼠抗小鼠，Brilliant Ultraviolet 737 标记，克隆号：53-6.7</td></tr><tr><td>细胞计数载玻片&amp;nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1450017</td><td>适用于 TC20 细胞计数仪</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;L 尼龙细胞筛</td><td>Falcon</td><td>198718</td><td>货号 352350</td></tr><tr><td>I 型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>肺炎链球菌接种环&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>R4609015</td><td>ATCC 4961</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>一次性接种环/针</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-603</td><td>蓝色；体积 1 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）&amp;rsquo;&amp;rsquo;</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fc 封闭抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>CD16/CD32 大鼠抗小鼠，未标记，克隆号：2.4G2</td></tr><tr><td>福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>HT501640</td><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td></tr><tr><td>纱布海绵，Covidien</td><td>Curity</td><td>2146-</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 管</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS 组织解离仪</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>序列号：4715</td></tr><tr><td>Hema 3 手动染色系统及快速套装</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>23123869</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷液体吸入剂</td><td>Henry Schein</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>静脉导管 JELCO 20G×1.25&quot;</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc</td><td>405611</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Henry Schein</td><td>1049007</td><td>盐酸氯胺酮注射液 MDV 100 mg/mL 10 mL/支，每盒 10 支</td></tr><tr><td>肺炎克雷伯菌&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td>亚种：肺炎克雷伯菌 (Schroeter) Trevisan</td></tr><tr><td>Loctite 409</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7257009</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128036</td><td>Brilliant Violet 605 标记抗小鼠 Ly-6C [HK1.4]；同型对照：大鼠 IgG2c</td></tr><tr><td>Ly-6G</td><td>BD Biosciences</td><td>740157</td><td>大鼠抗小鼠，Brilliant Violet 510 标记，克隆号：1A8，BD Optibuild</td></tr><tr><td>MiniVent 型号 845</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>4694</td><td>D-79232 March（德国）</td></tr><tr><td>NK-1.1</td><td>BD Biosciences</td><td>553165</td><td>小鼠抗小鼠，PE 标记，克隆号：PK136，BD</td></tr><tr><td>相差血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>1×，不含钙和镁</td></tr><tr><td>圆底管</td><td>Sarstedt</td><td>55.476.305</td><td></td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯试管&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>带细胞筛快封盖，5 mL</td></tr><tr><td>SealRite 1.5 mL 天然微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>无 RNase、DNase、DNA 和热原检测</td></tr><tr><td>Shandon EZ 单孔细胞离心涂片装置</td><td>Epredia</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Siglec-F</td><td>BD Biosciences</td><td>562681</td><td>抗小鼠，Brilliant Violet 421 标记，克隆号：E50-2440</td></tr><tr><td>黑色丝线编织缝合线 30&quot;（75 cm），无菌，不可吸收，符合美国药典标准</td><td>Ethicon</td><td>K-834</td><td>0（3.5 公制）</td></tr><tr><td>不锈钢载玻片夹</td><td>Epredia</td><td>59910052</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性真空过滤装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>1660045</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性 1 mL 注射器</td><td>BD-Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>508BR05740</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 200 µL 黄色吸头补充装</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>TODD HEWITT 肉汤</td><td>RPI</td><td>T47500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TPX 样品室</td><td>Epredia</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>TPX 单样品室、盖子及滤纸片</td><td>Epredia</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Bio-rad</td><td>1450022</td><td></td></tr><tr><td>U-100 胰岛素注射器</td><td>BD-Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>防水多档电热垫</td><td>Cullus</td><td>型号 PR7791AB</td><td>120 伏交流电；45 瓦；认证编号 562B/E26869</td></tr></tbody></table>

评估肺炎消退的实验模型

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）可导致急性肺损伤，其特征是肺泡迅速受损以及严重低氧血症。这进而导致高发病率和高死亡率。目前尚无能够完全模拟人类ARDS复杂性的临床前模型。然而，肺炎（PNA）的感染性模型可以复制ARDS的主要病理生理特征。本文中，我们描述了一种通过在C57BL6小鼠中经气管接种活的Streptococcus pneumoniae和Klebsiella pneumoniae诱导的PNA模型。为评估和表征该模型，在诱导肺损伤后，我们连续测量了小鼠体重并进行支气管肺泡灌洗（BAL），以检测肺损伤相关标志物。此外，我们采集肺组织用于细胞计数与分类、BAL蛋白定量、细胞离心涂片、细菌菌落形成单位计数以及组织学分析。最后，进行了高维流式细胞术检测。我们建议将该模型作为研究肺损伤早期和晚期恢复阶段免疫微环境的工具。

上述操作步骤可在小鼠中建立由细菌性肺炎引发的肺损伤的病理生理机制模型。为开始建模，C57BL/6野生型（WT）小鼠购自杰克逊实验室，并在本机构的动物实验设施中进行繁育。8周龄的雄性WT C57BL/6小鼠分别通过气管内接种TH肉汤（对照组）、3 × 106 CFU 活体Spn或200 CFU 活体Kpn。感染后，分别对Spn和Kpn感染组小鼠进行6天和10天的观察。尽管感染组小鼠的体重低于未感染的对照组，但Spn组小鼠的体重逐渐恢复至基线水平，而Kpn感染小鼠在感染6天后体重恢复较慢（图2A）。在整个研究期间，没有任何小鼠因体重下降超过20%而需要实施安乐死，也未观察到疼痛或痛苦的迹象。
我们在不同时间间隔测量了肺损伤指标。与对照组相比，感染组的支气管肺泡灌洗液（BAL）蛋白浓度以及BAL和肺组织中的总细胞数均显著升高（图2). 在接种后第2、4和6天，分别从两种模型中获取了显示炎症过程的代表性组织学切片（图3)，显示出肺泡持续性炎症的证据 Kpn-感染的小鼠（图4，即使在第10天。 Kpn-感染小鼠在第10天持续表现出损伤图2 和 图4），而 Spn-感染小鼠在第6天消除了肺部炎症（图2 和 图3).
在Spn模型中，于感染后第6天采用18色荧光激活细胞分选（FACS）高维流式细胞术分析肺组织单细胞悬液，以区分免疫微环境。通过t分布随机邻域嵌入（t-SNE）方法，可直观显示免疫细胞组成的总体差异，其中粒细胞（CD45+、CD11b+、CD24+、MHC-II-）、间质巨噬细胞（CD45+、CD11b+、MHC-II-、CD24-）、单核细胞（CD45+、CD11b+、MHC-II-、CD24-、CD64-）、B细胞（CD45+、CD19+）和T细胞（CD45+、CD3+），包括自然杀伤细胞（CD45+、CD3+、NK1.1+）的数量显著增加，如图5所示。设门策略见图6。
<img alt="小鼠手术准备示意图：麻醉、体位固定和气管插管步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：活菌气管内滴注的手术操作流程。（A）小鼠在无菌手术区域内的位置，通过门齿悬挂固定。（B）切口位置及气管暴露。（C）使用20 G导管进行气管插管的过程。图示由Biorender.com制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="体重与免疫细胞反应图；感染影响的时序分析；数据比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：肺炎模型后急性肺损伤（ALI）特征分析 (A) 与对照组相比，随时间变化的体重相对于基线的变化 Kpn 和 Spn （每组 n = 4）). (B) 通过BCA法测定BAL总蛋白含量（n = 4，每组）。C对照组（n = 3）的支气管肺泡灌洗液总细胞计数 Kpn （n = 4），以及 Spn （n = 3）。D对照组肺总细胞数（n = 3）， Kpn （n = 4），以及 Spn （n = 3）。E-G对照组（n = 3）支气管肺泡灌洗液细胞离心涂片的手工组织学计数进行BAL细胞分类 Kpn （n = 4），以及 Spn （n = 3）。统计检验采用单样本 t 检验，比较未感染对照组与感染组。*p &lt; 0.05。每个图表的数据均以标准误（SE）表示。所有图的 y 轴均为感染后天数。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗； Spn = Streptococcus pneumoniae；Kpn = Klebsiella pneumoniae。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig02v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="未感染与肺炎链球菌（Spn）感染条件下的肺组织及支气管肺泡灌洗液（BAL）组织学。显微镜检查，感染时间进程研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3肺组织病理学表现 Spn 感染 苏木精和伊红（H&amp;E) 支气管肺泡灌洗液和肺组织代表性切片在经气管感染后的组织学切片染色 Spn 第2、4、6天进行BAL；BAL放大倍数 = 100倍；肺组织放大倍数 = 10倍。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗； Spn = Streptococcus pneumoniae。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示Kpn感染10天内进展的BAL和肺组织示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：Kpn 感染期间肺组织的组织病理学发现。在气管内接种 Kpn 后第2、4、6和10天，代表性支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织切片的苏木精-伊红（H&amp;E）染色。图像显示高倍放大视野（比例尺 = 50 µm）。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗；Kpn = 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞簇分布、饼图、柱状图；免疫细胞分析、感染影响研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5：肺炎链球菌（Spn）感染6天后通过多色流式细胞术分析的免疫细胞图谱。（A）采用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）方法可视化肺组织中免疫细胞群体（CD45+），比较未感染对照组与感染组。（B）肺组织中各免疫细胞占总CD45+细胞频率的汇总。（C）各细胞亚群的总细胞数。对照组与感染组之间的统计学比较采用t检验。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001。各图数据均以标准误（SE）表示。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗液；Spn = Streptococcus pneumoniae。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析示意图；通过荧光标记和SSC/FSC图鉴定免疫细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：在肺炎发生前及发生后鉴定肺部免疫细胞亚群的设门策略。 支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织单细胞悬液经多色流式细胞术染色。首先利用SSC-A和FSC-A排除碎片，然后通过两种策略（SSC-W vs. SSC-H 和 FSC-W vs. FSC-H）圈选单个细胞。活细胞通过活/死细胞鉴别染料与SSC-A结合进行鉴定。后续细胞亚群根据先前确定的标记物进行鉴定15。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了建立小鼠肺炎感染模型的方法，以及对损伤修复过程的相应表征，并介绍了细菌培养和经气管灌注的技术。文中还描述了一种利用高维流式细胞术评估免疫格局的新方法。

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）可引起急性肺损伤，其特征为肺泡迅速受损和严重低氧血症。这继而导致……

本方案提供了一种可重复的肺炎模型，可引发显著的急性肺损伤。该模型的其他优势在于可用于在小鼠中复制感染性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。如我所提及，该模型具有高度可重复性，其死亡率和损伤程度可轻松滴定，从而用于评估急性肺损伤及其恢复的早期和晚期阶段，为治疗策略的评价提供了平台。尽管本方案并未提供肺损伤诊断或治疗的新方法，但它是一个可靠的模型，可用于测试新的治疗方法，对于免疫学、肺部疾病和传染病相关领域尤为有用。该技术的优点之一是具有良好的可重复性。然而，初次操作该技术的人员可能在将导管插入气管时遇到困难。因此，理想情况下，学习该技术的人员应从已实施安乐死的动物开始练习。首先，在37摄氏度的恒温摇床或培养箱中将血琼脂平板预热10分钟。从冰箱中取出一支新的细菌菌种管，在37摄氏度的水浴中轻轻振荡使其缓慢融化，直至菌种管完全解冻。避免用温水接触O形环或瓶盖。为手动计数平板上的细菌菌落，需进行10⁶倍稀释，并从最后一次稀释液中取200 µL接种至预热的血琼脂平板上。将平板在37°C条件下孵育过夜。第二天，使用给定公式测定新的细菌浓度。将麻醉的小鼠置于洁净且已灭菌的表面上。用门齿悬挂小鼠，并轻轻固定前肢。剃除颈部区域的毛发，并使用氯己定和70%酒精对该区域进行消毒。然后使用手术剪，在颈部正中线处做一个一厘米长的浅表切口，以暴露气管。如果看到大量脂肪组织，需仔细沿纵向分离脂肪组织，以暴露气管。轻轻向外牵拉舌头，经口腔插入一根20号套管针，将套管推进至气管内。对气管施加轻柔压力以辅助插管。插管完成后，将小鼠连接至呼吸机以确认插管成功。将呼吸机参数设置为潮气量 200 µL，呼吸频率 200 次/分钟。确认插管成功后，将小鼠与呼吸机断开，使用 200 µL 移液器配合加样凝胶吸头，经血管导管小心注入 50 µL 细菌制剂。给药完成后，再次将小鼠连接至呼吸机，以协助恢复呼吸。将小鼠留在呼吸机上 30 至 60 秒以监测呼吸。若观察到呼吸缓慢的模式，则再次将小鼠连接至呼吸机。向皮肤滴加一滴胶水以闭合切口。将皮肤褶皱对合并施加轻柔压力，直至胶水干燥。将已处死的小鼠仰卧于洁净的手术板上，并用门齿悬挂固定。用70%乙醇喷洒小鼠皮肤后，使用剪刀在颈部中线处做一个小的表浅切口，以暴露气管。使用20号导管插管气管，并用1毫升注射器将1毫升无钙PBS经气管缓慢注入。让肺充分扩张后，用同一注射器抽吸液体。重复该操作两次，共灌洗2毫升。将支气管肺泡灌洗液（BAL）转移至一个2毫升的等分试样中。使用剪刀打开胸腔，暴露肺、心脏和气管。仔细解剖膈肌并移除肋骨，注意不要夹伤肺组织。横断腹主动脉以放血。用剪刀在右心室做一个约一到两毫米的小切口，使用20号导管注入5毫升冷磷酸盐缓冲液（PBS），以灌注肺组织。成功灌注后，肺组织变为白色且苍白，PBS通过腹主动脉离开血管腔。然后小心取出肺组织，并从气管处进行分离。或者，如果肺组织用于组织学分析，可小心插入一根20号导管，用福尔马林溶液将肺充气至25厘米水柱压力。肺组织灌注完毕后，在气管下方穿过一段长约5厘米的3/0缝线，打结两次以确保福尔马林保留在肺组织内。轻轻将肺组织与其他组织分离，并放入含有10毫升福尔马林溶液的15毫升锥形管中。在4摄氏度下以500 ×g离心支气管肺泡灌洗液5分钟，然后将无细胞的上清液转移至另一管中。加入100微升裂解缓冲液，作用1分钟以裂解红细胞。通过加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中和裂解反应。离心支气管肺泡灌洗液（BAL），弃去上清液，然后将沉淀物重悬于100至300微升磷酸盐缓冲液（PBS）中。接着，使用0.4%台盼蓝染液进行自动细胞计数。在含有5毫升冷PBS的15毫升锥形管中，小心地将肺组织从周围组织中分离出来。解剖完成后，将肺组织从PBS中取出，并用纸巾吸干。进一步分离右肺和左肺，去除一同提取出的其他组织，如气管。按照文稿中所述配制消化液，将肺组织转移至含有1毫升消化液的C管中。将C管放入组织解离仪，按照标准操作流程处理肺组织。解离完成后，向管中加入10毫升冷的PBS缓冲液，并充分混匀。将单细胞悬液用置于冰上、装有50毫升锥形管的70微米细胞滤筛过滤。离心悬液并弃去上清液。在室温下加入1毫升裂解缓冲液，孵育1分钟。然后加入 10 毫升冷 PBS 以终止裂解反应，并移除上清液。用 PBS 重悬细胞，并通过台盼蓝染色和自动细胞计数进行细胞计数。在小鼠细菌性肺炎诱导的肺损伤后，感染组的体重低于未感染对照组。肺炎链球菌（Spn）感染组小鼠的体重逐渐恢复至基线水平，而肺炎克雷伯菌（Kpn）感染小鼠在感染后六天内恢复较慢。感染组支气管肺泡灌洗液（BAL）中的蛋白浓度以及BAL和肺组织中的总细胞计数均明显升高。在接种后第2、4和6天获取了两种模型炎症过程的代表性组织学切片，结果显示Kpn感染小鼠存在持续性肺泡炎症，甚至在第10天仍可见炎症证据。感染Kpn的小鼠在第10天仍持续存在肺损伤，而感染Spn的小鼠在第6天已消退肺部炎症。Spn感染6天后通过多色流式细胞术分析免疫细胞谱系，显示粒细胞、间质巨噬细胞、单核细胞、B细胞和T细胞（包括自然杀伤细胞）数量增加。在尝试该方法时，导管插入是实现可重复感染的关键步骤。这是一种可靠的方法，可作为识别急性肺损伤及其恢复研究靶点的平台。

experimental-model-to-evaluate-resolution-of-pneumonia

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

本视频展示了在免疫功能健全的啮齿类动物模型中建立肺部感染的方法 通过...

在免疫功能健全的啮齿类动物模型中支气管内接种Streptococcus pneumoniae

利用生物发光细菌实时观察肺炎链球菌毒力因子在急性小鼠肺炎模型中的影响

我们通过气管内注射铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

Pseudomonas aeruginosa 诱导的肺损伤模型

文献中已描述了多种在小鼠中建立细菌性肺炎模型的方法。本文介绍一种非侵入性、低成本且快速的方法，通过将细菌接种物滴加至口咽部，使其吸入（即，经气道吸入）以诱导肺炎。同时详细阐述了用于评估肺部固有免疫反应的后续检测方法。...

一种用于小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的非侵入性且技术简便的方法

本文介绍了一种在免疫功能健全的啮齿类动物中建立肺部感染的方法。熟练掌握后，该方法可快速、简便地用于诱导由多种S. pneumoniae、H. influenzae、P. aeruginosa、K. pneumoniae和A.

一种用于评估抗菌疗效的免疫健全啮齿类动物肺炎稳健模型S. pneumoniae,H. influenzae,K. pneumoniae,P. aeruginosa或A. baumannii

感染性肺炎是人类最常见的感染之一。合适的体内模型对于理解疾病发病机制和测试新型治疗药物的疗效至关重要。利用这种小鼠经口咽部吸入性肺炎模型，可研究此类致命感染的发病机制并评估新的治疗方法。...

小鼠经口咽部吸入式呼吸机相关及医院获得性细菌性肺炎模型

本文介绍了一种改进继发性细菌性肺炎研究的方法，通过非侵入性方式将病原体接种至下呼吸道，随后进行病原体回收和转录组分析。这些操作步骤具有可重复性，且无需使用套管、导丝或光纤电缆等特殊设备即可完成。...

一种用于小鼠继发性细菌性肺炎模型的精准病原体递送与回收系统

在小鼠左侧肺进行选择性支气管内酸灌注，可导致单侧且自限性的急性肺损伤，该模型模拟了由胃酸误吸引起的人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。...

通过单侧支气管内注射酸建立自限性急性肺损伤模型

本文描述了一种新型小鼠模型，用于研究肺炎链球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病性病原体的过程。该模型可轻松适用于研究疾病进展不同阶段以及多种宿主中多微生物与宿主-病原体之间的相互作用。...

小鼠模型在转变过程中的应用 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程

用于分析肿瘤细胞与T细胞相互作用的实验性肺转移及CTL免疫治疗小鼠模型 体内.

实验性转移与CTL过继性转移免疫治疗小鼠模型

了解小鼠肺炎消退实验模型，通过气管内滴注细菌建立急性肺损伤模型，利用支气管肺泡灌洗和流式细胞术评估免疫反应。该可重复模型为感染性疾病和肺部疾病的治疗策略研究提供可靠平台。

评估肺炎消退的实验模型

探索更多视频