测定放射性标记抗体与固定化抗原结合亲和力（K_D）

该方法可测定放射性标记抗体与其抗原的结合亲和力，同时还能测量结合的特异性。此简单方法的主要优势在于能够特异性地表征仅放射性标记抗体的结合亲和力，而不受未结合的亲本抗体的干扰。

该技术可定量验证放射性标记抗体与其靶标结合的能力。这对于多种疾病中的核成像和核治疗应用具有重要意义。本次实验操作将由本实验室的研究生助理 Erika Belitzky 演示。

首先，通过将191毫克碳酸氢钠和23.9毫克碳酸钠加入一个50毫升的锥形管中来配制固定缓冲液。然后加入40毫升18兆欧水，通过涡旋振荡溶解。接着将pH值调节至9.0，再将总体积定容至50毫升。

接下来，取200毫升PBS和100微升Tween 20加入250毫升瓶中，配制200毫升洗涤缓冲液。另取50毫克BSA和25微升Tween 20加入50毫升PBS中，涡旋混匀，配制50毫升结合缓冲液。向50毫升PBS中加入1.5克BSA，配制封闭缓冲液，并轻轻涡旋混匀。

将抗原用包被缓冲液稀释。然后取一块可拆卸的96孔平底板，在8×3阵列的24个孔中，每孔底部加入100 µL抗原。用封板膜覆盖，于4°C孵育过夜。

第二天，用洗涤缓冲液将酶标板洗涤三次。将酶标板在水槽上方迅速倒置以弃去液体，并轻敲酶标板使其接触叠放的纸巾，以去除多余液体。随后，使用多通道移液器向含有抗原的孔中每孔加入300 µL洗涤缓冲液。

向96孔板的24个抗原包被孔和24个空孔中每孔加入300微升封闭缓冲液。然后在室温下孵育1小时，并用300微升洗涤缓冲液将每孔洗涤3次。在结合缓冲液中对放射性标记抗体进行三倍系列稀释，覆盖板上标记为A至H的八个孔行。

首先，计算配制第一浓度的1.2毫升溶液所需的放射性标记抗体储备液体积。然后，向标记为B至H的微量离心管中各加入800微升结合缓冲液，并向标记为A的微量离心管中加入所需体积的结合缓冲液。将计算出体积的放射性标记抗体储备液加入A管中，轻轻涡旋混匀。随后，使用微型离心机离心，使所有液体聚集于管底。

接下来，从两个A管中各取400微升液体加入B管中。涡旋混匀后，使用小型微量离心机离心沉淀。同样地，将B管中的溶液依次加入C管，C管加入D管，直至H管。将每种稀释液各取100微升分别加入三个包被抗原的孔和三个仅用BSA封闭的孔中。然后，将每种稀释液各取100微升加入标记为A标准至H标准的微量离心管中，保存这些管作为放射性标记抗体标准品，用于γ计数器检测。

将培养板在37摄氏度下孵育1小时，同时轻轻摇动。按照文稿中的描述，为每个孔标记微量离心管。使用真空吸液器从96孔板的各孔中吸去放射性标记的抗体。

现在，使用多通道移液器向每个孔中加入 300 微升洗涤缓冲液。吸去洗涤缓冲液，并重复洗涤四次。将各孔拆开，分别放入相应的微量离心管中。

使用γ计数器检测标记为H1、H2、H3至A1、A2、A3的抗原管以及仅含BSA的H4、H5、H6至A4、A5、A6管中的放射活性。放射性标记的阿米凡塔玛布显示出对EGFR和cMET蛋白的特异性结合。同样，单臂放射性标记的Fab片段对EGFR和cMET蛋白的结合亲和力也得以保留。

饱和结合曲线显示，当放射性标记抗体的浓度过低时，无法达到饱和状态，表现为曲线呈线性。而当放射性标记抗体浓度过高时，则会迅速达到饱和，缺乏明显的对数增长阶段，表现为曲线出现水平平台。此外，由于放射性标记抗体浓度过高，还观察到较高的非特异性结合。

该实验步骤可能需要多次尝试，以优化每种特定放射性标记抗体的浓度范围。可利用阴性结果的数据来帮助设计后续实验。一旦确定了结合亲和力，便可将其作为放射性标记抗体表征过程中其他体外实验的参考基准。