快速脂质分析的样品制备 果蝇 利用基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术研究大脑

基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MS成像）是一种成熟且有效的工具，可用于鉴定和可视化脂质的丰度与分布，且无需对样品进行过度修饰。MALDI成像的主要优势在于能够无需标记而原位检测脂质，并可同时分析大量样品。熟能生巧。

在处理真实实验样品之前，务必进行充分练习。尽量缩短样品制备时间，并在整个操作过程中避免污染。开始时，将最佳切割温度介质（OCT）加入塑料冷冻模具中，填充至模具深度的一半，同时避免产生气泡。

将模具在平坦的表面上静置数分钟，然后转移至干冰上。保持冷冻模具在干冰上处于水平状态，使OCT形成平整且均匀的表面。等待直至OCT在模具中完全凝固。

立即使用冷冻的OCT载片，或将其在-80摄氏度下保存。用二氧化碳麻醉成年果蝇后，准备一个含有实验室擦拭纸的培养皿。用水润湿擦拭纸的一部分，以减少静电。

保持擦拭纸一半湿润、一半干燥。在解剖显微镜下切下果蝇头部后，收集四到五个头部，置于实验擦拭纸的干燥区域。将OCT载台从干冰转移至显微镜二。

立即将头部转移到OCT包埋台上并迅速排列，整个过程需在30至60秒内完成，以避免OCT融化。每个果蝇大脑周围应预留约1毫米的空白空间，以确保OCT提供足够的支撑；同时，包埋块边缘应预留4至5毫米的空白空间，以便于后续切片操作。将OCT包埋台放回干冰上，静置约三分钟，确保OCT包埋台保持完全冻结和固态。

在所有果蝇头部对齐后，将包埋盒（OCT）置于干冰上再静置5到10分钟。将包埋盒从干冰上转移至平坦表面，迅速加入足量OCT包埋剂，完全覆盖所有样品并填满整个冷冻模具，此过程约需三秒钟。随后立即将冷冻模具放回干冰中，冷冻含有包埋组织的完整OCT组织块。

将OCT载板置于干冰上再静置5到10分钟。在冷冻模具边缘标记样品，并将冷冻后的样品在-80摄氏度条件下保存，直至准备切片。通过使用万用表（调至电阻模式）检测ITO载玻片的导电性，以确认ITO编码侧。

将具有电阻测量值的一侧标记为用于黏附组织的一侧。对其进行标注，并始终在载玻片底部放置一张实验室擦拭纸，以避免载玻片污染。然后，将组织置于冷冻切片机舱内平衡30至45分钟。

用70%乙醇清洁冷冻切片机。擦拭切片阶段的滚轮板并更换已使用的刀片。使用额外的洁净擦拭纸确保乙醇已完全挥发，并在开始切片前保证所有表面干燥。

接下来，根据组织类型调整冷冻切片机腔室和样本头的温度。使用OCT将组织固定在样本托上。注意使用足量的OCT覆盖OCT包埋块的底部，并尽可能平整地安装包埋块。

将洁净的刀片放置于载物台上并固定。根据需要调整样本头部朝向载物台的位置，以达到所需的切割角度。随后以厚切片开始切割，直至找到目标区域。

用预冷的艺术家画笔不断刷去多余碎屑，以保持工作区域清洁。根据需要适当调节切片室温度，当到达目标区域后，将切片厚度调整为10至12微米。小心收集目标切片。

取一片室温的ITO载玻片，将其置于切片上方。轻柔地接近切片，使其黏附在载玻片上，避免在冷冻切片机载物台上留下痕迹。将载玻片放置在架子上或冷冻切片机外的实验擦拭纸上，以备多次切片收集期间使用。

若需对同一队列的不同样本进行比较，可将多个样本的切片置于同一张载玻片上，以便同时分析，从而最大限度地减少变异。如有必要，可分置于两张载玻片上，因为 Maldi 目标板架可在单次运行中容纳两张载玻片。将载玻片放入真空盒中运输，并置于装有干燥剂（作为底层）的干燥器中。

将载玻片置于真空条件下驱动30至60分钟，然后进行基质沉积。使用两种五羟基苯甲酸（即DHB）溶于甲醇-水的溶液作为基质。将载玻片放入载玻片转运器中，并用石蜡膜严密封住开口。

用密封袋封好，放入另一个含有干燥剂的密封袋中。标记外部，并将样本连同充足的干燥剂一起运送至MALDI核心实验室。

进行基质沉积时，使用40毫克/毫升的DHB溶于甲醇-水作为基质，采用HTX M5自动基质喷涂仪进行喷涂。氮气压力设置为10 PSI。使用MALDI飞行时间质谱仪（MS）在正离子模式下采集质谱图。

通过在ITO载玻片上点样0.5微升乙酸硝酸中的红磷乳液来校准仪器。应用二次校准曲线，利用其光谱在100至1000兆质荷比（MZ）质量范围内校准仪器。将激光光斑直径设为中等，以匹配40微米光栅宽度的调制光束轮廓，并在每个阵列位置以每秒1000次的激光重复频率累积500次激光脉冲来采集成像数据。

然后记录光谱数据。使用均方根归一化方法进行成像数据分析，以生成带宽为±0.10道尔顿的离子图像。利用软件对同一实验中的OCT和脑组织光谱进行比对，评估OCT在离子抑制干扰中重叠峰的情况。

最后，对含有组织样本的MALDI载玻片进行苏木精-伊红（H&E）染色。MALDI质谱分析结果显示，LPR1基因敲除突变体脑组织中的脂质含量普遍下降。此处展示的是代表性成年果蝇脑切片的H&E染色结果。

该图像中还标明了脂质种类、相应的质荷比（MZ）值以及热图的刻度。与对照组相比，LPR1基因敲除突变体中脂质减少的平均倍数（基于至少四个生物学重复实验）以箭头旁的数字表示。对照组和突变体果蝇脑组织区域中选定空白OCT区域的质谱图显示在MZ1至1000以及MZ520至900范围内。

OCT的干扰与离子抑制现象以及信号重叠问题均有关。为保持脂质组学数据的准确性，适当的样品制备、解剖和冷冻切片至关重要。在完成MALDI实验后，可通过LCMS（即基于液相色谱-质谱的脂质组学）对脂质的种类进行验证。

该技术利用强大的软模式系统研究脑脂质稳态的分子机制，为理解人类脑部疾病相关的代谢变化开辟了道路。