利用精密切割的肺切片研究气道和肺内平滑肌的收缩调节

PCLS支持在几乎完整的组织环境中评估气道和血管平滑肌细胞的活性，从而为肺部研究提供了宝贵的离体模型。在平滑肌研究方面，精确切割的肺切片保留了平滑肌细胞的体内表型及其与周围结构的相互作用，同时允许进入平滑肌细胞，这对于细胞水平的机制研究非常重要。首先，将鼠标身体放在仰卧位的解剖板上。

用25G注射器针头固定尾巴，前爪和头部，并用70%乙醇消毒身体。沿着横膈膜上方的胸骨和双侧下肋骨笼小心地打开胸腔。然后，将锋利的剪刀尖端指向远离肺组织的位置，并移除部分双侧腹肋骨笼以暴露心脏。

观察当胸腔打开时肺叶塌陷。用剪刀去除小鼠颈部的软组织，露出气管。在气管的上端形成一个直径为1.2毫米的小孔，应允许20G Y形IV导管尖端通过。

将Y形导管的一个适配器端口与预填充0.5毫升空气的3毫升注射器连接，另一个端口与预填充2毫升1.5%琼脂糖溶液的3毫升注射器连接，该注射器预填充2毫升1.5%琼脂糖溶液，加热至42摄氏度。注射琼脂糖溶液填充导管，然后将导管通过开口推入气管至5至8毫米。以每5秒1毫升的速率缓慢注入琼脂糖溶液。

观察肺沿近端至远端轴扩张。当每个肺叶的边缘充气时停止注射。然后，从另一个注射器注入0.2至0.3毫升的空气，将残留的琼脂糖推入导电气道，到达远端肺泡腔。

夹子用一对弯曲的止血钳关闭气管。要填充肺脉管系统，在 1 毫升注射器中填充温热的 6% 明胶，并将其连接到头皮静脉针刺导管。用明胶溶液填充导管，然后用针刺穿靠近下壁的右心室。

将针头推入右心室 2 至 3 毫米，并将针尖指向肺主动脉。将约0.2毫升明胶溶液缓慢注入右心室和肺动脉血管。注射后将针头保持在原位五分钟，通过将冰冷的HBSS溶液倒在心脏和肺部来冷却肺叶，并将身体放入冰箱中。

完成此步骤后，用剪刀从周围的结缔组织中取出小鼠肺和心脏。然后，分离每个肺叶，并将它们保存在冰上的HBSS溶液中。修剪肺叶并定向，使切割方向垂直于从肺门到肺表面的大多数气道。

用超级胶水将其附着在试样柱的顶部。使用带有新鲜薄剃须刀片的振动仪将肺叶切成150微米的切片。将切片收集在预先填充有冷HBSS溶液的无菌培养皿中。

将切片转移到装有DMEM / F-12培养基的培养皿中。在实验前将培养皿置于37摄氏度的培养箱中过夜。将一个精确切割的肺切片放入装有HBSS的24孔培养板的每个孔中。

将切片放在孔的中间，然后用移液管取出HBSS溶液。在显微镜下，在切片中找到目标气道和血管，然后使用带有预切中心孔的尼龙网覆盖它，以暴露目标气道血管区域。在网眼顶部放置一个空心金属垫圈，以将切片固定到位。

然后，加入600微升HBSS溶液以浸没切片。10 分钟后，记录基线图像。为了诱导气道或血管收缩，请用移液管小心地取出HBSS溶液，并用激动剂加入600微升HBSS。

为了制备钙染料加载缓冲液，首先将50微克染料与10微升DMSO和0.2克普隆F-12粉末溶解在1毫升DMSO中。将10微升的普隆溶液与10微升的钙染料溶液混合。将该混合物加入含有200微摩尔磺基溴他汀的2毫升HBSS溶液中。

然后，将15个精密切割的肺切片放入2毫升钙负荷缓冲液中，并在30摄氏度下孵育一小时，然后在含有100微摩尔磺胺溴他汀的HBSS中孵育30分钟。然后，将装有钙染料的切片放在大盖玻片上。将高真空硅脂填充在连接到18G钝针或200微升移液器尖端的3毫升注射器中，并在盖板玻璃上和切片下方绘制两条平行线。

在两条润滑脂线之间用尼龙网覆盖切片。将第二个盖板玻璃放在网格的顶部以生成一个腔室。用移液管从一端将HBSS或激动剂溶液加入腔室中。

用纸巾从另一端吸出液体，从腔室中取出液体。切片的腔室现在已经准备好使用高速激光扫描共聚焦显微镜进行钙成像。在相差显微镜下，在厚度为150微米的精密切割肺切片中观察肺气道动脉束。

在静息状态下，气道由具有附近肺动脉的长方体上皮细胞识别。暴露于乙酰甲胆碱后，腔面积减少，而肺动脉对刺激没有反应。气道收缩反应通过腔面积减少的百分比进行量化，并在一天和五天的培养中显示出相似的剂量依赖性反应。

到达外周肺野后，传导性气道分支到呼吸道和围绕小脑室内小动脉的囊中。当暴露于内皮时，气道和肺动脉都会收缩，随后是NOC-5诱导的松弛。在静息状态下，在共聚焦荧光显微镜下，加载钙染料的切片在气道和血管系统的平滑肌细胞中显示出低荧光。

暴露于激动剂后，钙荧光强度在细胞中升高并传播到整个细胞，这与振荡信号相关。技术方面，必须均匀地用琼脂糖使肺充气，并避免快速或过量注射琼脂糖。始终将空气推入末端，将琼脂糖从导电气道冲洗到远端肺泡腔。

综上所述，利用精切肺切片培养，可以提供多种特殊的肺平滑肌功能，并在体外模拟平滑肌的失调。它还为筛选新发血管扩张剂或支气管扩张剂药物提供了一个理想的平台。