多流灌注生物反应器集成了出口分馏功能，用于动态细胞培养
2022年7月20日
本文提出了一种构建和操作低成本、多通道灌注细胞培养系统的方法，用于测量细胞过程中溶质分泌和吸收速率的动态。该系统还可以使细胞暴露于动态刺激曲线中。
这种方法有助于了解分泌速率如何随时间变化以及细胞如何响应时变的固体信号。该技术的主要优点是成本低，需要很少的培训，并且丰富的系统设置可以适应新的实验。首先用背景溶液填充一个注射器，然后将其装入第一个注射泵中。
用示踪剂溶液填充另一个注射器，并将其装入第二个注射器泵中。使用鲁尔连接器将两个注射器连接到四路旋塞阀的三个端口中的两个。将旋塞阀关闭到后台溶液中，并将示踪剂溶液泵入旋塞阀，直到其从打开的端口滴出。
停止泵，不要进一步调整注射器。确保将注射器泵的移动杆向上推到注射器柱塞上，以便在泵启动时立即开始流动。关闭示踪剂溶液的旋塞阀，并将背景溶液泵入旋塞阀，直到所有残留的示踪剂溶液都从打开的端口中冲洗出来。
停止泵，不要进一步调整注射器。设置 RTD 分析所需的流量系统组件。将末端插入移液器吸头分配器中，并将背景溶液泵入组件，直到其完全充满。
将示踪剂溶液的泵设置为所需的流速。将旋塞阀关闭到后台溶液并启动示踪剂溶液的流动。同时，启动分数收集器。
在短时间内继续示踪剂溶液的流动，以近似示踪剂的脉冲输入。对于 RTD，建议以每小时 1 毫升的流速进行脉冲持续时间为 10 分钟。在示踪剂溶液脉冲周期结束时停止示踪剂溶液泵。
快速关闭示踪剂溶液的旋塞阀，并以相同的流速启动背景溶液的流动。允许背景溶液流动并收集馏分，直到所有示踪剂通过系统并进入收集的馏分。在无菌条件下，将带有针头的塞子插入孔板培养物中，并将针头拉起。
塞子就位后，将针头降低到所需的灌注高度，因为出口针的高度决定了稳定的液位。用公头鲁尔帽盖住针头，并将整个孔板保持在37摄氏度的培养箱中直至使用。准备用于灌注的两种培养基，将首先分配的培养基标记为一种，另一种培养基为两种。
对于要灌注的每种培养物，用培养基填充一个注射器，以持续其分配的整个持续时间以及足够的体积以最初填充灌注系统。用中等的两个注射器填充第二个注射器，以持续其分配的整个持续时间。将两个注射器连接到四向旋塞阀的三个端口中的两个。
可能需要一定长度的管子将注射器连接到旋塞阀。通过关闭介质 1 的旋塞阀并将介质 2 分配到旋塞阀中，直到它刚开始从打开的端口滴出来准备旋塞阀。然后关闭介质 2 的旋塞阀，并将介质 1 分配到旋塞阀中，直到所有残留的介质 2 从打开的端口中冲洗出来。
使用母头到倒钩型鲁尔连接器将上游管连接到开放式旋塞阀端口。在管子的另一端插入一个公头到倒钩鲁尔连接器。从注射器中分配介质，直到上游管充满介质，并继续制备下游管，如前所述。
将公头到倒钩鲁尔连接器插入下游管道的一端，并用母头鲁尔帽盖住。小心地将所有准备好的管子，注射器和孔板带到将用于灌注的培养箱中。将注射泵和馏分收集器放置在培养箱附近的所需位置。
将注射泵放在培养箱的顶部或附近，并将馏分收集器放在靠近端口的培养箱旁边。将注射器装入泵中。将所有上游和下游管的封端捆绑在一起，并通过端口将它们从培养箱外部推到内部。
将下游管的开口端插入馏分收集器多头分液器的分液器吸头中。在培养箱内，将尽可能多的上游管的松弛拉入培养箱，以最大限度地延长管道的长度，流动介质可以通过该管道接收热量和二氧化碳。对于每个堵塞的井，快速拔下该井的针头以及上游和下游管的盖子，然后用它们的鲁尔连接器将它们连接在一起。
连接所有部件后，以相对较高的速度短暂运行注射泵，以确保所有流都正常流动。此时，如果需要开始对充满介质的下游管子进行实验，请继续运行泵，直到全部装满，否则，请停止泵。设置介质一的注射器泵流量和馏分收集频率，并同时启动两台机器开始实验。
当需要更换介质源时，请迅速停止注射泵以获得中等源。将旋塞阀关闭至中等温度，然后启动用于中等温度 2 的注射泵。如果以后需要，请以类似的方式将源切换回中等源。
收集所需实验持续时间的分数。测量两个RTD实验的馏分中的示踪剂浓度，并从数据MATLAB脚本输入RTD以产生两个RTD.单管和多块串联的管子通过单个轴向分散模型很好地拟合，并且在线添加灌注的48孔板导致偏差可以忽略不计，允许一米管RTD和整个系统的RTD都适合轴向色散函数。
使用拟合到一米管RTD数据的轴向色散模型演示了模型拟合不良的示例，并与数据一起绘制。更改了初始参数猜测以产生良好的模型拟合，其中tau近似等于灌注系统体积除以其体积流速。90分钟的TNF-α脉冲被定义为系统的输入信号，并与一米管RTD卷积以确定孔板入口处的TNF-α信号。
输入信号还与整个系统的RTD卷积，以确定收集的分数中系统出口处的TNF-alpha信号。HEK 293细胞被设计成由含有NF-kappaB应答元件的启动子驱动的GLuc。实验显示，在TNF-α暴露后，由NF-kappaB驱动的GLuc表达显着增加和缓慢降低。
随附的论文中描述了该系统的变化，包括不需要输入信号和将细胞暴露于pharma-hu连接溶质谱的实验的更简单设置。
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概述
本文介绍了一种构建和操作低成本、多通道灌流细胞培养系统的方法，用于测量细胞过程中溶质分泌和吸收速率的动力学变化。该系统还可使细胞暴露于动态刺激条件下。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞培养
- 分泌动力学
- 吸收速率
背景
- 了解分泌速率对于研究细胞过程至关重要。
- 动态刺激可能影响细胞反应。
- 低成本系统可促进更广泛的研究应用。
- 系统设置和操作所需培训极少。
研究目的
- 开发一种经济高效的细胞培养灌注系统。
- 测量溶质分泌与吸收的动力学过程。
- 使细胞能够暴露于不同的刺激模式中。
使用的方法
- 实验设置包括用背景溶液和示踪剂溶液填充注射器。
- 利用注射泵和四通旋塞阀进行流体控制。
- 泵入示踪剂溶液以观察分泌动力学过程。
- 可适用于多种实验条件。
主要结果
- 该方法可有效测量随时间变化的分泌速率。
- 细胞对随时间变化的固相信号产生响应。
- 展示了灌流系统的多功能性。
- 低成本的实验装置促进了其在科研中的广泛应用。
结论
- 该技术可深入了解细胞动态。
- 它是细胞生物学领域研究人员的有力工具。
- 该系统的可适应性支持多种实验设计。
常见问题
行业应用价值
能够在数分钟至数小时时间尺度上解析分泌与响应动力学的动态细胞培养系统，对于早期发现阶段的可预测靶点验证和机制性风险排除至关重要。这种集成出口分流功能的多通道灌流生物反应器，可实现对细胞响应受控溶质谱的时间分辨定量测量，支持转化研究的连续性以及稳健的检测方法开发。其模块化、低成本的设计有利于并行化操作和结果的可重复性，直接提升项目筛选和早期决策的效率。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可检测细胞对类似药代动力学溶质谱的动力学响应。
- 通过实时定量分泌和信号传导动力学，支持作用机制的去风险化分析。
- 通过精确控制刺激动力学，促进功能靶点的验证。
- 通过解析通路激活的时间特征，提高预测的可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游化合物筛选制备经过验证且可重复的生物系统。
- 通过可控灌注和分级处理标准化检测条件，实现定量输出。
- 支持在多孔板格式中并行开展实验，提高通量和可扩展性。
- 可在动态暴露条件下可靠评估化合物效应。
转化与临床前研究
- 将体外刺激谱与体内药代动力学对齐，用于转化生物标志物研究。
- 通过捕获时间分辨的细胞输出，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过模拟生理相关暴露场景，降低转化风险。
- 提供对分泌及信号通路时间调控机制的深入理解。
流程与工作流整合
该系统通过实现对细胞在受控溶质输入条件下的动态、定量反应分析，连接了早期发现、检测方法开发和转化研究。
- 发现生物学：通过实时测量分泌和响应动力学，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复的定量输出，适用于高内涵筛选工作流程。
- 分析：提供分段的、时间分辨的样品，用于下游定量分析和统计比较。
- 转化研究：模拟类似药代动力学的曲线，使体外研究结果与体内情况相一致。
- 企业级复用：模块化设计支持在多种细胞类型和不同实验需求中广泛采用与适应。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化动态培养工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过提供稳健、时间分辨的数据，支持更优的立项/终止决策和资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的发现项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备基本的细胞培养技术以及对灌流系统的熟悉。
- 需要标准的实验室仪器：注射泵、组分收集器和多孔板。
- 通过使用 commercially available components（商业化组件）可促进跨团队标准化。
- 可适应多种细胞类型和刺激方案，仅需极少修改。
- 实际限制包括溶质扩散效应，可通过停留时间分布分析进行量化。
