Name: 开发用于心脏功能成像和光遗传学控制的 黑腹果蝇 模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 了解利用光学相干断层扫描成像和光遗传学控制黑腹果蝇心脏功能的方法。该技术可实现无创心脏成像、精确心率调控及心律失常模拟，为心血管疾病研究提供高效可靠的实验手段。

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作者感谢 Andrey Komarov、Yuxuan Wang 和 Jiantao Zhu 在数据分析方面提供的帮助，并感谢 Zhou 实验室成员的宝贵讨论。Zhou 博士实验室的工作得到了圣路易斯华盛顿大学启动资金、美国国立卫生研究院（NIH）R01-EB025209 和 R01-HL156265 基金以及 Clayco 基金会创新研究奖的支持。

本研究使用了以下转基因果蝇品系：eNpHR2.0 转基因品系 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2、ReaChR 转基因品系 w[*];P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO，以及包含 Hand 基因调控片段的心肌特异性 GAL4 驱动品系 w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] （该驱动品系将简称为 Hand-GAL4）。以 y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 作为 GFP 报告基因品系。上述 Drosophila 品系均来自布卢明顿果蝇品系保藏中心（Bloomington Drosophila Stock Center, BDSC，参见材料表），在室温或 18 °C 条件下，使用标准玉米粉培养基进行保种。本研究中建立的 Drosophila 模型可根据合作研究需求提供使用。
1. Drosophila 遗传杂交与培养基制备
<ol>
	<li>更换第3号染色体平衡染色体 TM3 Sb[1] 到 TM6 Sb Tb,构建 w[1118]；P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb（Hand-GAL4/TM6 Sb Tb）。 参见 补充图1 用于杂交方案。在装有常规玉米粉培养基的小瓶中进行杂交。 
	注意：存在一种 Tb 标记物可使用户区分含有视蛋白转基因和GAL4驱动元件的幼虫和蛹，与仅含视蛋白但无驱动元件的个体。25.</li>
	<li>将遗传杂交样本置于25 °C、70%湿度的培养箱中，放置在特制的全-转&#160;含视黄醛（ATR）的培养基（参见 材料表在黑暗条件下培养5天以收集幼虫，6天以收集蛹。</li>
	<li>混合五种 Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb 每管中放入未交配的雌性个体以及两到三只来自UAS-opsin品系（eNpHR2.0或ReaChR）的雄性个体。参见eNpHR2.0和ReaChR视蛋白的杂交示意图 图 2A 和 图2B分别。</li>
	<li>第二天，准备含有ATR的培养基小瓶。
	<ol>
		<li>根据BDSC的说明制备半定义食物26仅加入蔗糖（5.14 g/100 mL），而不加入蔗糖和葡萄糖。持续搅拌并冷却至约 60 °C。</li>
		<li>准备窄口果蝇小瓶，向每支小瓶中加入50 µL的100 mM ATR-乙醇溶液。</li>
		<li>使用血清移液管将果蝇培养基加入果蝇培养管中，每管5 mL。最大速度涡旋振荡10秒。</li>
		<li>将小瓶塞紧，并用深色织物包裹以避光。让小瓶干燥至少12小时（过夜）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二天，将步骤1.3中稳定产卵的果蝇转移至含有ATR的食物小瓶中（步骤1.4.4）。用遮光材料保护装有小瓶的架子。</li>
	<li>24–48 小时后（根据产卵数量而定），移除亲本以防止试管内种群过密。</li>
	<li>收集非Tb 子代并用于心脏成像。 
	&#8203;注意：幼虫期和蛹期的表型差异如以下所示 图2C样本制备步骤的概要及大致时间线如图所示 图3.</li>
</ol>
2. 光遗传学控制 果蝇 心脏
<ol>
	<li>从试剂瓶中挑选 UAS-opsin/Hand-GAL4 幼虫/蛹（步骤 1.7），置于纸巾上，使用画笔轻轻擦去体表培养基。</li>
	<li>准备显微镜载玻片，并在中央贴一小块双面胶。</li>
	<li>使用画笔或精细镊子，将幼虫/蛹背面向上、垂直于载玻片长边轻轻放置于胶带表面，并施加轻柔压力使其牢固粘附。</li>
	<li>将载玻片置于成像载物台上，使幼虫/蛹朝下。</li>
	<li>通过激光控制软件开启 OCT 光源（参见材料表）。打开自行编写的 SD-OCT 控制软件，然后点击预览窗口。</li>
	<li>在 SD-OCT 软件中设置扫描参数。 
	注意：目标是调整样品位置以实现对跳动心脏的最佳成像，因此应选择 X 范围和 Y 范围覆盖心脏区域。此步骤中，A 扫描和 B 扫描的数量均为 400。x 和 y 方向的范围分别约为 490 µm 和 537 µm，对应显示心脏的两个正交横截面（xz 和 yz）。</li>
	<li>使用微操纵器控制样品台，将果蝇心脏调至焦点。调整焦平面位置以最小化果蝇体壁表面的光反射。可考虑在幼虫/蛹体表涂抹矿物油以减少反射。 
	注意：油可能因削弱胶带粘性而增加动物移动的风险。</li>
	<li>确保果蝇心脏在图像窗口中完整可见，无畸变、无组织遮挡，且无明显阴影或反射；否则返回步骤 2.7 重新调整。</li>
	<li>设置 M 模式 OCT 图像采集的扫描参数。 
	注意：与步骤 2.7 相比，A 扫描数量减少，以提高帧率，从而捕捉果蝇心脏的跳动动态（数 Hz）。B 扫描数量表示 M 模式成像的重复帧数，可根据记录时长和系统可用内存进行调整。本实验中，128 次 A 扫描可实现约 125 帧/秒的速度，记录 4,000 次重复 B 扫描，获得约 32 秒的连续记录。</li>
	<li>在无红光刺激脉冲条件下采集五组对照数据，用于计算&#160;静息心率（RHR）。</li>
	<li>在自定义 OCT 控制软件中设计起搏刺激的光脉冲。在&#34;设置&#34;中，添加设计的光脉冲序列，根据不同的刺激方案控制脉冲频率、脉冲宽度、刺激持续时间和等待时间。 
	注意：静息心率（RHR）来自无光照的对照实验，用于计算心动过速和心动过缓实验中光脉冲的频率&#160;22。</li>
	<li>打开光源控制器软件（参见材料表）以生成红光脉冲。在&#34;模式选择&#34;中选择脉冲模式。双击&#34;脉冲轮廓&#34;设置图形，选择跟随模式。保持关闭强度为 0，并根据实际功率密度计算后设置开启强度百分比。 
	注意：刺激光脉冲由 OCT 控制软件根据步骤 2.12 的设置发出信号触发。</li>
	<li>在 OCT 控制软件中点击采集，获取有光刺激条件下跳动的Drosophila心脏的 M 模式视频。重复测量 5 次。</li>
</ol>
3. 图像分析
<ol>
	<li>打开自主开发的果蝇心脏分割软件。</li>
	<li>点击 选择文件 ，然后在弹出的图形用户界面中选择待分析的文件。</li>
	<li>在顶部的文本框中输入心脏区域的垂直和水平边界（单位：像素）。点击 调整大小。使用底部的滑块，确保在整个图像序列中整个心脏区域均可见，并充满整个显示框。若未满足此条件，请重复此步骤并调整边界。</li>
	<li>点击 预测 以识别心脏区域。程序将自动处理图像序列中的每一帧切片，提取心脏区域，耗时约 3 分钟。</li>
	<li>预测完成后，点击 心率图 。这将打开一个新窗口，显示心脏面积随时间变化的曲线图。请确认已正确选择峰值或谷值区域。依次选择 脉冲 和 心率 以生成最终图表，同时功能参数将被保存至 .csv 文件中。</li>
</ol>

<ol><li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1(2011).</li>
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<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li>
<li>Tsai, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+firing+in+dopaminergic+neurons+is+sufficient+for+behavioral+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning.</a> Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).</li>
<li>Wykes, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+potassium+channel+gene+therapy+in+a+rodent+model+of+focal+neocortical+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy.</a> Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).</li>
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<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cardiac function.</a> Science. 330 (6006), 971-974 (2010).</li>
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<li>Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affecting+rhomboid-3+function+causes+a+dilated+heart+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila.</a> PLOS Genetics. 6 (5), 1000969(2010).</li>
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<li>Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+Drosophila+heart+rate+at+different+temperatures+and+Ca2%2B+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations.</a> Physiological Reports. 4 (3), 12695(2016).</li>
<li>Malloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+assess+neuroendocrine+modulation+of+heart+rate+in+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).</li>
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<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+expression+of+the+Alzheimer%27s+disease-associated+presenilin+gene+in+drosophila+heart+leads+to+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction.</a> Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与我们之前的研究相比，此前研究中视蛋白的表达不仅出现在心脏中，还出现在周围肌肉组织中，而本研究采用心脏特异性驱动子Hand-GAL4。这种用于光遗传学心脏调控的新型Hand&#62; 视蛋白遗传构型进一步验证了先前报道的结果，并建立了一个更优的黑腹果蝇（Drosophila）心血管研究模型。
培养基的制备对实验的成功至关重要。视蛋白需要一种配体——全反式视黄醛（ATR）才能发挥功能28。果蝇自身无法产生足够的ATR，因此必须在果蝇培养基中添加ATR。本研究中，先前报道的即食饲料被替换为半定义培养基29。引入含ATR的新培养基配方，以确保ATR分布均匀。ATR不溶于水；当基于乙醇的100 mM ATR储备液加入水基培养基时，需将含有温热半定义培养基的试管进行涡旋振荡，使ATR分散。此外，先前报道的ATR浓度——eNpHR2.0使用10 mM、ReaChR使用3 mM22——被统一降低至最终浓度均为1 mM。该浓度足以保证eNpHR2.0和ReaChR的正常功能。
实验成功的关键要素之一是利用 FlyNet 2.0 改进的数据处理方法27该实验室持续开发此软件，以提升自动化果蝇心脏分割算法的计算效率和准确性。该软件生成的横截面掩膜被用于推导 果蝇 生理数据，例如缩短分数和心壁运动速度。该方法实现了高效的数据分析且几乎无需人工监督，从而能够更快速、更可靠地对大量果蝇心脏成像数据集的心功能进行表征。
心肌梗死仍是导致死亡的首要原因，而心肌缺血导致了所有心力衰竭病例的三分之二，心力衰竭正迅速成为美国发病率和死亡率的主要原因之一30。开发新的治疗方法和医疗设备需要深入了解心脏疾病在生理学和生物化学层面的机制。这些目标可以通过模式生物来实现。D. melanogaster 已被确立为最可靠且高效的模型之一31,32,33,34,35。本研究建立了通过非侵入性光遗传学方法诱导的模拟 Drosophila 心脏疾病模型。非侵入性光学心脏起搏技术的发展为传统电心脏起搏设备提供了替代方案的基础。利用OCT实时观察心脏功能，可使研究精确表征 Drosophila 模型中的相关心脏生理学特征，用于包括药物候选物筛选在内的深入研究。OCT成像的穿透深度约为1 mm，适用于 Drosophila 心脏研究，但限制了其在较大动物模型中心脏功能表征的应用。此外，将 Drosophila 的研究成果直接转化至哺乳动物模型仍面临挑战。需要开发新的光遗传学工具，以提高视蛋白的敏感性，并将其应用于包括斑马鱼、小鼠、大鼠和人类心脏类器官在内的多种模型系统，以推动心血管研究。

2010 年底，《自然方法》期刊将光遗传学评选为年度方法1。利用光调控的遗传工具（转基因视蛋白）以空前的精度和速度控制特定生物组织，为新应用打开了大门。迄今为止，该技术的大部分成果集中在神经科学领域。该技术最初被引入作为精确控制单个神经元的新方法2，现已发展到推动活体生物认知功能研究的发现3。从一开始，神经科学家就展示了调控整个生物体行为的能力。在小鼠多巴胺能神经元中表达并用光激活 ChR2 视蛋白，可引起这些神经元的激活，并足以驱动行为条件化4。将表达于啮齿类动物脑部癫痫灶中的嗜盐菌视紫红质 NpHR2.0 进行光遗传学抑制，可减轻脑电图记录中的癫痫样发作5。
光遗传学在心脏病学中的应用正在稳步发展6。ChR2 已成功在心肌细胞培养物及小鼠中表达，并通过蓝光闪光实现心脏起搏（在活体动物中使用植入式光纤完成）7。在斑马鱼中，ChR2 被表达并用于识别心脏起搏区域；NpHR 的激活可诱导心脏停搏8。光遗传性心脏起搏具有开发新型起搏和再同步化治疗的独特潜力9。近期也有报道尝试建立一种自体心律失常终止系统10。
广泛的研究及新治疗方法的开发需要应用多种模型系统，从细胞培养到哺乳动物。脊椎动物的心脏是一个非常复杂的器官。心肌细胞（CM）占所有心脏细胞的三分之一；其他细胞包括神经元、血管平滑肌细胞以及非兴奋性细胞（如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞）。仅通过心肌细胞培养进行研究，会限制所获得结果向人类医学应用的转化。哺乳动物模型生物的基因操作手段有限且耗时较长。较小的无脊椎动物模型具有诸多优势；其心血管系统包含了所有基本的组织学结构。Drosophila melanogaster（果蝇）是一种简单而强大的遗传学模型系统，可用于研究与人类疾病（包括心脏疾病）相关基因的功能11,12,13。作为寿命较短的动物，果蝇为模拟年龄或疾病依赖性的心脏功能变化提供了极佳的机会，这些变化可在整个生命周期中被追踪14,15,16,17。果蝇的心管位于其体背侧，距离表皮表面仅约200 µm，使得可见光至近红外光能够到达心管。这一解剖学特征使得利用现有的光遗传学工具对Drosophila心脏进行非侵入性光学起搏成为可能。
为了监测 果蝇 心脏，开发了一种集成了红光LED激发模块的定制谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）成像系统18利用这种非侵入性生物医学成像技术，可轻松分析相对简单的果蝇心脏在形态和节律上的变化12,19,20,21凭借增强的光学切片性能和微米级空间分辨率，OCT 已成功用于研究组织结构并监测其功能 果蝇 不同发育阶段的心脏，包括3龄幼虫和早期蛹18该系统还可实现同步监测与刺激 果蝇完整动物心脏状况的评估。图中展示了OCT系统的示意图 图1该SD-OCT系统采用超发光二极管（SLD）作为光源（中心波长：850 nm ± 10 nm，FWHM：165 nm，参见 材料表使用10倍物镜时，OCT成像系统在空气中的轴向分辨率可达约4.4 µm，在组织中约为3.3 µm，横向分辨率约为2.8 µm，足以分辨果蝇心脏结构的精细细节18,22参考臂和样品臂反射光的干涉信号使用配备2048像素线扫描相机（最大线速率：80 kHz，参见 材料表测得的系统灵敏度约为 95.1 dB。每个B模式OCT扫描在xz图像平面内生成一幅横截面图像。在相同位置重复采集B模式图像以生成M模式图像。&#160;捕捉跳动的心脏&#160;约30秒18,22,23M型成像的帧率约为125帧/秒，足以捕捉果蝇心脏跳动的动力学过程。
为了实现对Drosophila心脏功能的光遗传学调控，将一个配备617 nm LED光源的照明模块与SD-OCT系统的样品臂集成。刺激光聚焦于样本表面直径约2.2 mm的区域，位置与成像聚焦点相同。通过自行编写的软件控制照明模式（光强、脉冲宽度和占空比），调节光脉冲刺激频率，并同步LED模块的照明与M型OCT成像的采集22。
近期发表的文献描述了 果蝇 使用UAS/GAL4遗传系统构建的可时空调控ChR2、ReaChR和eNpHR2.0视蛋白的转基因体系。实验结果表明，通过红光激活eNpHR2.0可诱导心脏停搏和心动过缓，而蓝光激活ChR2则可引起更高频率的心脏起搏。类似的心脏起搏实验也利用另一种可被红光照射诱导的通道视紫红质ReaChR进行。22,23,24所有所述实验中的视蛋白表达均由 24B-GAL4，其中在多种组织中观察到视蛋白的表达，包括心肌细胞及周围的肌肉细胞。在本研究中 24B-GAL4 被替换为一个 Hand-GAL4 驱动心肌特异性表达 eNpHR2.0 和 ReaChR 视蛋白。
总体而言，所展示的实验结果表明，可实现心脏停搏的恢复以及可诱导的心动过缓和心动过速状态。本研究提供了一套详细的实验方案，包含创建转基因动物的逐步操作指南。 果蝇 提供在活体动物中进行模型构建及同步OCT成像与光遗传学起搏实验的方法。

<table><tbody><tr><td>全反式视黄醛</td><td>Cayman Chemicals</td><td>18449</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Gibco</td><td>02-10-2025</td><td></td></tr><tr><td>BioLED 光源控制模块，4通道</td><td>Migtex Systems</td><td>BLS-SA04-US</td><td>光遗传刺激模块的组成部分</td></tr><tr><td>宽带光源模块</td><td>Superlum</td><td>cBLMD-T-850-HP</td><td>SD-OCT 成像系统的组成部分</td></tr><tr><td>Cobra-S 800 OCT 光谱仪</td><td>&amp;nbsp;Wasatch Photonics</td><td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td><td>SD-OCT 成像系统的组成部分</td></tr><tr><td>精密任务擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark Professtional</td><td>34155</td><td>纸巾</td></tr><tr><td>果蝇琼脂</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养瓶</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-131</td><td></td></tr><tr><td>FlyNet 2.0 软件</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>由周实验室开发的用于果蝇心脏分割和心脏功能分析的定制软件</td></tr><tr><td>高功率LED准直光源</td><td>Migtex Systems</td><td>BLS-LCS-0617-03-22</td><td>光遗传刺激模块的组成部分</td></tr><tr><td>失活干酵母</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>AmScope</td><td>BS-72P</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养用窄型塞</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-200</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养用窄型小瓶</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>永久性双面胶带</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养瓶用塞子</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-194</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Sigma</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT 控制软件</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>由周实验室开发的用于图像采集和起搏控制的定制软件</td></tr><tr><td>SD-OCT 成像与光遗传起搏系统</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>由周实验室开发的成像与光遗传起搏系统（物料成本约 50,000 美元）</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carolina</td><td>89-2871</td><td></td></tr><tr><td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 41752</td><td>eNpHR2.0 转基因品系</td></tr><tr><td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 53748</td><td>ReaChR 转基因品系</td></tr><tr><td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 48396</td><td>含有 Hand 基因调控片段的心脏特异性 GAL4 驱动品系</td></tr><tr><td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock #6658</td><td>GFP 报告基因品系</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Lab Scientific bioKEMIX</td><td>978-907-4243</td><td></td></tr></tbody></table>

建立用于心脏功能成像与光遗传学调控的 drosophila melanogaster 模型

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

使用 Drosophila melanogaster果蝇（fruit fly）作为模式生物，已在生物学的诸多领域推动了重大进展，从细胞结构和基因组研究到行为学分析均受益于此。得益于长期积累的科学知识，近年来 果蝇 被引入到包括心脏疾病在内的多种人类疾病建模研究领域。本文所述工作介绍了一种实验系统，可在完整活体生物背景下，利用红光（617 nm）非侵入性地监测和调控心脏功能。心脏功能的控制通过光遗传学工具实现。光遗传学结合了光敏感性转基因视蛋白的表达及其光学激活，以调控特定生物组织。本研究采用了一套定制的集成光学相干断层成像（OCT）与光遗传学刺激系统，用于可视化并调控心脏功能 D. melanogaster 3龄幼虫及早期蛹发育阶段的心脏。采用UAS/GAL4双基因系统在果蝇心脏中特异性表达卤化视紫红质（eNpHR2.0）和红移通道视紫红质（ReaChR）。有关制备的详细信息 D. melanogaster 用于活体OCT成像和光遗传学起搏的方案已提供。由实验室开发的集成软件处理成像数据，以生成可视化图像和定量特征 果蝇 心脏功能。结果表明，通过激活eNpHR2.0可成功诱导心脏停搏和心动过缓，而激活ReaChR可实现心脏起搏。

D. melanogaster 表达红光敏感视蛋白 eNpHR2.0 或 ReaChR 的动物是通过将每种品系杂交并获得后代，在心管中实现表达而产生的 UAS-视蛋白 转基因品系和 Hand-GAL4 驱动基因。通过成像GFP表达来验证GAL4驱动基因的组织特异性（图 4). 果蝇 使用三龄幼虫和早期蛹的发育阶段来演示红光激活eNpHR2.0和ReaChR的效果。通过LED递送设计波长约为617 nm的红光脉冲，照射幼虫或蛹体，从而激活心脏中表达的eNpHR2.0和ReaChR。尽管NpHR的最大响应波长约为580 nm，ReaChR的最大响应波长约为600 nm，但617 nm的红光照射能够实现更深的组织穿透，增强向视蛋白表达心脏组织的光能递送22.
在倒置显微镜装置中，将幼虫/蛹背侧朝下固定于载玻片上，并用LED光束照射A7体节。体横截面图像的示例如图5A和图6A所示。在包含4000帧的视频记录中，心脏表现为收缩与舒张的环形结构（补充视频1-6）。为了模拟不同的心脏状态，设计了四种类型的光脉冲。在等待5秒后施加持续10秒的单次光脉冲，可由eNpHR2.0诱导产生可逆的心脏停搏，如图5B所示。对于通过eNpHR2.0介导的、频率低于静息心率（RHR）的心脏起搏，采用两种光脉冲序列，其起搏频率分别为RHR/2和RHR/4，每次持续8秒，中间间隔6秒等待时间（图5C）。每个光脉冲序列的占空比为90%。该光刺激方案可诱导出类似心动过缓的心脏状态。为通过ReaChR激活提高心率，采用三种光脉冲序列，其频率分别为RHR + 0.5 Hz、RHR + 1 Hz和RHR + 1.5 Hz，脉冲宽度为20 ms（图5D）。该脉冲方案旨在诱导心动过速的心脏状态。所有实验中的光功率密度均为7.49 mW/mm2。对照实验中不施加光照。
每种实验变体均记录五次。利用 FlyNet 2.027 将果蝇心脏的 M 型超声视频处理为二维掩膜。该软件可自动分割心脏区域，生成心脏功能数据集。程序为每一帧提供心脏掩膜，必要时可进行手动校正，以精确量化心脏搏动的功能参数，例如心率（HR）、舒张末期直径（EDD）、收缩末期直径（ESD）、缩短分数（FR）、舒张末期面积（EDA）、收缩末期面积（ESA）等。心率通过分析随时间变化的心脏面积来测定。无光脉冲的对照视频用于建立每只动物的基础心率（例如 RHR）。
图5B 和 图6B 分别显示了在幼虫和蛹中使用红光（617 nm）激活 Hand&gt;eNpHR2.0 所引起的持续10秒的心脏停搏。当红光开启时，Drosophila 的心脏停止跳动，并维持该状态直至光照结束。红光关闭后，心脏功能恢复正常。未表达视蛋白的动物（“无视蛋白”对照）对红光照射无反应（补充图2A 和 补充图3A）。在 Hand&gt;eNpHR2.0 动物中进行的对照实验中，若未开启10秒红光照射（“无光照”对照），则心脏正常跳动（补充图4A 和 补充图4C）。
使用 Hand&gt;eNpHR2.0 动物，施加频率低于RHR的红光脉冲。心脏收缩频率随光信号而降低；这种较慢的心率模拟了一种类型的心律失常，即心动过缓（幼虫和蛹分别见图5C和图6C）。在“无视蛋白”（补充图2B和补充图3B）以及“无光照”（补充图4A和补充图4C）的对照实验中，未观察到心率减慢现象。
提高心率可以通过激活实现 手&gt;ReaChR 以高于该动物RHR的频率，使用红光脉冲序列刺激视蛋白。在不同刺激频率（例如，RHR + 0.5 Hz、RHR + 1 Hz、RHR + 1.5 Hz）下施加一系列三个光脉冲序列 手&gt;ReaChR 幼虫和蛹的心脏。获得的数据清晰显示，光脉冲后心率增加（图 5D 和 图6D 分别用于幼虫和蛹）。这些实验中展示的心脏状况模拟了心动过速。阴性对照实验结果如图所示。 补充图2C，补充图3C，以及 补充图 4B、D.
总体而言，结果表明在转基因动物模型黑腹果蝇（D. melanogaster）的不同发育阶段，实现对心脏节律的无创且特异性的光遗传学控制是可行的。
<img alt="光学相干断层扫描示意图；包含光谱仪、光纤耦合器、样品臂和参考臂的激光装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：集成617 nm LED模块用于光遗传学调控的OCT成像系统 果蝇 心脏功能 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="带有 P{w[+mC]} 的遗传杂交图解及黑腹果蝇蛹表型结果；实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：生成在心脏中表达视蛋白的D. melanogaster个体。（A）遗传杂交图解。将Hand-GAL4/TM6 SbTb雌性与携带eNpHR2.0的雄性杂交。收集后代中Hand-GAL4/eNpHR2.0个体（以红星标记）用于OCT成像，而根据表型特征丢弃Hand-GAL4/TM6 Sb Tb个体。（B）遗传杂交图解。将Hand-GAL4/TM6 SbTb雌性与携带ReaChR的雄性杂交。收集后代中Hand-GAL4/ReaChR个体（以红星标记）用于OCT成像，而根据表型特征丢弃Hand-GAL4/TM6 Sb Tb个体。（C）Hand-GAL4/视蛋白（红星标记）与Hand-GAL4/TM6 Tb后代之间的表型差异。TM6染色体上携带Tb基因突变的个体相较于正常的非Tb幼虫或蛹具有“粗短”的体型。左图显示幼虫；右图显示早期蛹。图像中还包括带有1 mm刻度的标尺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示 Hand-GAL4/UAS-opin 杂交、48小时孵育及避光处理的果蝇繁育示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：成像样品制备流程的示意图与时间线。 亲本品系保种于果蝇培养瓶中； virgin 雌蝇与雄蝇在装有普通培养基（以黄色表示）的窄瓶中进行杂交。将正在产卵的果蝇转移至含ATR培养基（以棕色表示）的培养瓶中。自此步骤起，含有发育后代的培养瓶需避光保存。用于成像的三龄幼虫和早期蛹从培养瓶壁上收集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物维管组织的荧光显微镜图像；突出显示结构模式，比例尺为1 mm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：D. melanogaster 早期蛹在Hand-GAL4（BDSC 48396）驱动下表达UAS-GFP（BDSC 6658）。 荧光模式证实了Hand-GAL4驱动子的心脏特异性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏反应分析；光脉冲对心率和心面积影响的显微图像与图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：D. melanogaster 幼虫中心脏停搏、心动过缓和心动过速的模拟。（A）幼虫体横截面的OCT图像。心脏表现为体表下方的一个圆形结构。（B）可恢复性心脏停搏的图示。上图显示红光照射的时间（X轴）与光源功率水平百分比（Y轴）的关系。中图显示随时间（X轴）变化的心脏面积（Y轴，平方微米）。下图显示随时间（X轴）变化的心率（Y轴，赫兹）。（C）eNpHR2.0介导的可恢复性心动过缓的图示。上图显示红光照射的脉冲序列，诱导出两个心动过缓阶段：分别为静息心率（RHR）的50%和25%。心脏面积和心率的变化分别显示于中图和下图。（D）ReaChR激活介导的心脏起搏图示。上图显示一系列20 ms红光脉冲，其频率分别为RHR + 0.5 Hz、RHR + 1 Hz和RHR + 1.5 Hz。心脏收缩跟随光脉冲频率，如中图和下图所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig05largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光脉冲调制下心率的超声图像和图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：D. melanogaster 蛹中心脏停搏、心动过缓和心动过速的模拟。（A）蛹体横截面的OCT图像。心脏表现为体表下方的一个圆形结构。（B）可恢复性心脏停搏的图示。上图显示红光照射的时间（X轴）（Y轴，光源功率百分比）。中图显示随时间（X轴）变化的心脏面积（Y轴，平方微米）。下图显示随时间（X轴）变化的心率（Y轴，赫兹）。（C）eNpHR2.0介导的可恢复性心动过缓的图示。上图显示红光照射的脉冲序列，诱导出两个心动过缓阶段：分别为静息心率（RHR）的50%和25%。中图和下图分别显示心脏面积和心率的变化。（D）ReaChR激活介导的心脏起搏图示。上图显示一系列20 ms红光脉冲，频率分别为RHR + 0.5 Hz、RHR + 1 Hz和RHR + 1.5 Hz。中图和下图显示心脏收缩跟随光脉冲频率的变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：通过遗传杂交将TM3 Sb平衡染色体替换为TM6 Sb Tb。 将雌性处女蝇Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb与雄性nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w+/ TM6 Sb Tb杂交。Hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb子代（包括雌性处女蝇和雄性）被筛选出来（通过筛选有色眼睛与粗短体型的组合性状）。选出的果蝇进行自交以建立稳定的品系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：在对照实验中，野生型（wt）幼虫的心率在红光照射下不发生变化。（A）在红光照射期间，未观察到野生型幼虫出现心脏停搏。上图显示M型心脏图像，红线表示光照时间点；中图和下图显示在32秒成像时间内的心脏面积及心率变化。（B,C）红光脉冲对野生型幼虫的心率无影响。上图显示M型心脏图像，红线表示光照时间点；中图和下图显示在32秒成像时间内的心脏面积及心率变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：在对照实验中，野生型（wt）蛹的心率在红光照射下不发生变化。（A）在红光照射期间，野生型幼虫未出现心脏停搏。上图显示M型心脏图像，红线表示光照时间点；中图和下图显示32秒成像期间的心脏面积和心率。（B,C）红光脉冲对野生型蛹的心率无影响。上图显示M型心脏图像，红线表示光照时间点；中图和下图显示32秒成像期间的心脏面积和心率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure3.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：D. melanogaster 幼虫和蛹在未进行红光照射的OCT成像过程中，表达Hand&gt;eNpHR2.0或Hand&gt;ReaChR均未表现出显著的心率变化。（A）表达Hand&gt;eNpHR2.0的幼虫的心率。（B）表达Hand&gt;ReaChR的幼虫的心率。（C）表达Hand&gt;eNpHR2.0的蛹的心率。（D）表达Hand&gt;ReaChR的蛹的心率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure4.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频1：激活的eNpHR2.0导致黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫心脏停搏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo1.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 2：激活的 eNpHR2.0 导致黑腹果蝇（D. melanogaster）蛹心脏停搏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo2.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 3：eNpHR2.0 介导的黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫可恢复性心动过缓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo3.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 4：eNpHR2.0 介导的可恢复性心动过缓 D. melanogaster 蛹 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo4.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 5：在黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫中通过激活 ReaChR 实现心脏起搏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo5.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频6：在黑腹果蝇（D. melanogaster）蛹中通过激活ReaChR实现心脏起搏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo6.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本方案描述了在果蝇（Drosophila melanogaster）心脏中表达eNpHR2.0或ReaChR视蛋白以进行光学相干断层成像（OCT）及光遗传学心脏起搏的方法。文中报道了针对果蝇（Drosophila）进行OCT成像和心脏搏动调控的详细操作步骤，包括在不同发育阶段的活体动物中模拟可恢复的心脏停搏、心动过缓和心动过速。

建立用于心脏功能成像与光遗传学调控的 Drosophila melanogaster 模型

以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为模式生物，已在生物学多个领域取得重大进展，从细胞……

该方案介绍了利用光来表征和控制果蝇心脏功能的果蝇模型。这使得研究人员能够在完整动物体内研究人类心脏疾病。该方法可稳定实现对果蝇心脏功能的非侵入性光学相干断层成像（OCT）及光遗传学控制。它具有高效率和高质量。光遗传学起搏有望作为治疗心律失常疾病的电起搏替代疗法。OCT成像和光遗传学起搏可拓展至其他模型系统，如心脏类器官、斑马鱼以及胚胎期咽喉和心脏。首先，将五只携带 GAL4 和 TM6 双标记的处女雌蝇与两到三只来自 UAS Ops 和 Stocks 的雄蝇每管进行杂交。第二天，根据布卢明顿果蝇资源中心的说明配制半定义培养基：将 5.14 克/100 毫升蔗糖加入烧杯中，在加热板上加热溶解，并持续搅拌，冷却至 60 摄氏度。接下来，通过向每个窄口果蝇培养瓶中加入 50 µL 的 100 mmol/L 全反式视黄醛乙醇溶液来制备培养瓶。使用刻度移液管将每支窄口果蝇培养瓶中的果蝇培养基移除 5 mL。在最大速度下涡旋振荡 10 秒后，塞住这些培养瓶，并用遮光布包裹，以避免光照。第二天，将稳定产卵的果蝇转移至含有全反式视黄醛乙醇溶液处理食物的试剂瓶中。用遮光材料保护装有试剂瓶的架子。根据产卵数量，24至48小时后，丢弃亲代果蝇，以防止试剂瓶内果蝇过度繁殖。接下来，收集非肥胖型后代用于心脏成像。从试剂瓶中挑选带有UAS选项的hand GAL4幼虫或蛹，将其放置在组织上，并使用画笔轻轻擦去体表的培养基。在载玻片中央贴上一小段双面胶，以备使用。接下来，使用毛刷或精细镊子将幼虫或蛹轻轻放置在胶带表面，使其背面向上，并与载玻片的长边垂直。施加轻柔压力，使幼虫或蛹附着在胶带表面。然后，将载玻片放置于成像台上，使幼虫或蛹朝下，并通过激光控制软件开启光学相干断层扫描（OCT）光源。打开自行编写的频域OCT控制软件，然后点击预览窗口，接着在频域OCT软件中设置扫描参数。使用显微操作仪控制样品台，使果蝇心脏进入焦点。调整焦平面位置，以最小化果蝇体壁表面的光反射。此外，可考虑在幼虫或蛹的表面涂抹矿物油，以减少反射。接下来，设置M模式OCT图像采集的扫描参数，并采集五组无红光刺激脉冲的对照数据，以计算静息心率。在自定义OCT控制软件中设计用于起搏刺激的光脉冲。具体操作为：点击设置选项卡，根据不同的刺激方案，将设计好的光脉冲序列添加至控制参数中，以调节脉冲频率、脉冲宽度、刺激持续时间和等待时间。然后打开光控制器软件以生成红光脉冲。在模式选择中选择脉冲模式。双击脉冲轮廓设置的图形，并选择跟随模式。保持关闭强度为零，并在计算实际功率密度后设置开启强度百分比。在OCT控制软件中点击“Acquire”，获取光刺激下果蝇心脏跳动的M模式视频。在成像采集过程中，记录红光脉冲照射果蝇心脏的情况。请注意，使用红移型通道视紫红质和NPHR果蝇模型控制果蝇心脏功能时，需要不同的起搏设置。打开自主开发的果蝇心脏分割软件，点击“选择文件”，然后在图形用户界面中选择待分析的文件。在顶部的文本框中输入心脏区域的垂直和水平边界（单位：像素）。点击“resize”按钮。使用底部的滑块，确保整个心脏区域可见，并在整个采集过程中充满整个框。单击“预测”标签后，程序将遍历集合中的每个切片，并在大约三分钟内自动选定心脏区域。预测完成后，单击心率（HR）图，将在新窗口中显示随时间变化的心脏区域曲线图。选择正确的峰值或谷值区域，然后依次选择脉冲和心率（HR）标签，以生成最终图像。功能参数将同时保存在CSV文件中。通过成像绿色荧光蛋白表达验证了手部GAL4驱动器的组织特异性。此处展示了幼虫和蛹体横截面的典型OCT图像。为了模拟不同的心脏状态，设计了四种类型的光脉冲。一种是在等待5秒后持续10秒的单次脉冲，可诱导可逆的心脏停搏。对于起搏频率低于静息心率的心脏起搏，采用两种光脉冲序列，其起搏频率分别等于静息心率的一半和四分之一，每次序列持续8秒，间隔6秒等待时间。通过红移通道视紫红质激活来提高心率的刺激模式由三组光脉冲序列组成。光信号引起的心脏收缩频率降低，导致心率减慢，该现象在幼虫和蛹中均能观察到。在幼虫和蛹的心脏上施加一系列不同刺激频率的三组光脉冲串，可明显观察到光脉冲后心率增加。正确选择子代、标本的制备与固定，以及成像步骤至关重要。我们希望将光遗传起搏技术应用于更大的动物模型，以研究哺乳动物的心脏疾病，并探索治疗心律失常的新疗法。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

开发用于心脏功能成像和光遗传学控制的 黑腹果蝇 模型

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监测果蝇幼虫 Drosophila melanogaster 的心脏功能以用于生理学研究

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建立用于心脏功能成像与光遗传学调控的 Drosophila melanogaster 模型

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