Name: 使用质谱法表征单个神经元中的RNA修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习使用液相色谱串联质谱法分析单个神经元中的多种RNA修饰。该方法可检测超过十种的修饰核苷，揭示单细胞与整体组织的化学差异，为研究中枢神经系统转录后调控提供新途径。

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本研究由美国国家药物滥用研究所（资助号：P30DA018310）和国家人类基因组研究所（资助号：RM1HG010023）资助。K.D.C. 感谢贝克曼研究所博士后奖学金的支持。本内容仅由作者负责，不代表资助机构的官方观点。

1. 材料与溶液的准备
<ol>
	<li>使用严格纯化系统获得的水配制人工海水（ASW），其中含 460 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM CaCl2、22 mM MgCl2、26 mM MgSO4 和 10 mM HEPES。用 1 M NaOH 或 HCl 将 pH 调至 7.8。通常配制 1 L ASW，并于 14 °C 保存至使用。</li>
	<li>配制含青霉素 G（10,000 U/mL）、链霉素（10 µg/µL）和庆大霉素（10 µg/µL）的 ASW-抗生素溶液，并于 -20 °C 保存。实验前立即取出解冻，并将冷冻的抗生素储备液用 20–40 mL ASW 按 1:100 稀释。工作用 ASW 溶液中抗生素的终浓度为青霉素 G 100 U/mL、链霉素 100 µg/mL 和庆大霉素 100 µg/mL。</li>
	<li>通过将以下试剂按每份样品混合来配制 RNA 消化缓冲液：1 µL 10 µg/µL 牛血清白蛋白、0.5 µL 0.5 µg/µL 喷司他丁、0.495 µL 2 U/µL 碱性磷酸酶、1 µL 0.1 U 磷酸二酯酶 I（溶于 10 mM MgCl2 中）以及 0.38 µL 来自Serratia marcescens的核酸内切酶（25 U）。若需分析多个样品，可在另一管中配制主混合液，其中各试剂体积为待分析样品数加一（以补偿移液过程中的试剂损耗）乘以单个样品所需体积。</li>
	<li>准备若干锋利的针具（玻璃或金属材质），用于手动分离神经元。可通过电化学蚀刻钨丝自制金属针具30，或直接购买。使用拉针仪从厚壁或标准壁硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1 mm）制备玻璃针。本方法中，针尖直径应保持在 1–5 µm，颈部长度为 100–150 µm。 
	&#8203;注意：金属针和玻璃针的制备均可优化，以获得适合研究人员个体需求及特定生物模型的工具。</li>
</ol>
2. 单个神经元的分离
<ol>
	<li>将0.33 M的MgCl2溶液冷却至14 °C。使用50 mL注射器，通过将MgCl2溶液注入动物体腔来麻醉A. californica（150–250 g）。最佳效果可通过溶液体积（mL）与动物体重（g）以1:3的比例实现。等待约3分钟，直至动物完全放松，确保其在触觉刺激下不再出现身体收缩。</li>
	<li>将动物腹面（足部）朝上放置于解剖盘中。使用一端为钝头的手术剪，朝向动物方向小心地沿足部做纵向切口进行解剖。</li>
	<li>用大头针固定动物身体的头端、尾端及两侧，以暴露位于体腔内的内脏器官和中枢神经系统（CNS）神经节。通过手术切断起源于神经节的神经和部分连合纤维，将主要的CNS神经节从动物体内分离出来。</li>
	<li>将神经节浸入含有来自Streptomyces griseus的蛋白酶XIV型（10 mg/mL，溶于含抗生素的人工海水ASW溶液）的溶液中，在34 °C下孵育30分钟或1小时（脑神经节需1小时）。 
	注：孵育时间取决于季节、动物大小与状态以及目标神经元。某些神经元的分离需要更长的孵育时间，应通过实验确定。</li>
	<li>用含抗生素的人工海水（ASW-antibiotics）溶液将神经节冲洗6次，并使用开口约为5 mm的聚丙烯转移移液管将所有神经节转移至涂有硅胶聚合物的培养皿中，该培养皿内已盛有ASW-antibiotics溶液。可选步骤：将移液管用含1 mg/mL牛血清白蛋白的ASW溶液处理，以减少神经节黏附于移液管壁。始终确保神经节完全浸没在ASW溶液中。 
	&#8203;注：酶处理会降低神经元及其周围结缔组织的机械稳定性，因此在转移神经节过程中若暴露于空气中，可能导致神经元膜受损。</li>
	<li>用大头针固定神经节，使用显微剪刀和精细镊子去除神经节被膜。在酶处理充分的情况下，可使用玻璃或金属针进行去膜操作。</li>
	<li>在显微镜下识别A. californica中感兴趣的目标神经元。本研究中涉及以下细胞：腹神经节中的R2细胞、侧神经节中的LPl1细胞、脑神经节中的大细胞（MCCs）以及口神经节中的B2细胞。使用经校准的显微镜（总放大倍数20倍）拍摄所有神经元及神经节样本的光学图像，以测定各类细胞的大小和体积。</li>
	<li>使用拉制的玻璃毛细管或锋利的钨针，小心地将已识别的细胞从神经节主体中分离出来。</li>
	<li>用塑料微量移液器吸取少量（1 µL）ASW溶液，然后将分离的单个细胞转移至含有4 µL 0.365 M乙酸铵（pH 9.2）的PCR样品管中。对于空白对照测量，从盛有神经节的培养皿中吸取5 µL ASW-antibiotics溶液，与消化缓冲液（如下所述）混合。</li>
</ol>
3. 用于 SNRMA-MS 的细胞裂解和 RNA 消化
<ol>
	<li>在0.365 M醋酸铵溶液中，使用显微移液器（内径约100 µm）反复吸打以裂解分离的神经元。一些较小的细胞可能不会立即破裂；为裂解这些细胞，可用拉制的玻璃毛细管在细胞直径方向施加压力。</li>
	<li>使用PCR仪按照以下程序加热样品：95 °C 3分钟，10 °C 3分钟，然后保持在10 °C。从PCR仪中取出样品管。</li>
	<li>向每个样品中加入3.375 µL RNA消化缓冲液，用移液器反复吸打数次以混匀溶液。使用微型台式离心机在2700 x g 条件下离心30秒，使附着在PCR管壁上的液滴沉至管底。</li>
	<li>将样品在PCR仪中于37 °C孵育3小时，随后保持在10 °C（加热盖设为开启状态）。样品冷却至10 °C后立即取出7 µL溶液，转移至配有250 µL内插管的自动进样瓶中，注意避免在自动进样瓶中产生气泡。</li>
</ol>
4. 液相色谱-串联质谱法
注意：使用配备电喷雾离子化源和六通分流阀的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统，分析单神经元消化产物和真实修饰核苷标准品。
<ol>
	<li>为分离标准核苷与修饰核苷，将C18色谱柱（150 mm × 2.1 mm，2.2 µm粒径，120 Å孔径）用99%流动相A（5 mM乙酸铵，pH 5.6）和1%流动相B（60/40流动相A/乙腈（ACN））在36 °C条件下以0.2 mL/min流速平衡12 min。配制流动相时应使用LC-MS级溶剂。</li>
	<li>当液相色谱系统平衡时，通过向质谱仪引入50/50乙腈/水中的1 mM醋酸钠溶液来校准质谱仪 通过 以5 µL/min的流速使用注射泵。校准后，将液相色谱流路重新连接至质谱仪。</li>
	<li>设置以下线性梯度参数：0–5 分钟为 1% B，9 分钟时为 5% B，11 分钟时为 7% B，13 分钟时为 10% B，32 分钟时为 15% B，38 分钟时为 40% B，43 分钟时为 50% B，50 分钟时为 100% B，60 分钟时为 100% B，61 分钟时为 1% B，随后在 1% B 条件下重新平衡 12 分钟，再进行下一次进样。</li>
	<li>在正离子模式下运行质谱仪，参数设置如下：毛细管电压设为 4,500 V，干燥温度 275 °C，N2 干燥气体 5 L/min，雾化气体 1 bar。将分流阀在分析的前 2 分钟设置为废液，其余运行时间设置为进入源。</li>
	<li>在一定范围内采集质谱数据 m/z 110-600 范围内选择离子，在 3 秒的循环时间内以 35-40 eV 进行碰撞诱导解离，质谱选择依据基于数据库构建的优选质量列表2 隔离窗口为 ± 0.5，使用动态排阻，在获得三个质谱后排除离子的碎裂。</li>
	<li>将动态MS/MS谱图采集设置为：离子强度高于50,000计数时以4 Hz进行，低于50,000计数时以1 Hz进行，离子选择的最低阈值为1,990计数。</li>
	<li>对于定量SNRMA-MS，应使用修饰核苷标准品在至少五个浓度下获得的提取离子色谱峰面积构建校准曲线，以实现对未知内源性分析物浓度的插值。 
	&#8203;注意：通常情况下，从体重为150–250 g的动物获取的神经元，其修饰核苷的校准曲线范围为0.02 pmol至2 pmol，但具体数值可能因仪器灵敏度而异。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>生成修饰核苷的提取离子色谱图（EICs）m/z 来自数据库数值2通过将MS2谱图和LC保留特征与数据库中的数值进行比对，验证假定修饰核苷的身份2参见 表1 在单个神经元中检测到的典型RNA修饰列表 A. californica.</li>
	<li>手动积分对应于修饰核苷和标准核苷的峰，并将这些数值记录在电子表格中。以样品中检测到的标准胞苷、尿苷和鸟苷峰面积之和为基准，对每种修饰核苷的峰面积进行归一化处理。 
	注意：由于腺苷在中枢神经系统中作为动态神经调节剂发挥作用，因此未将其纳入标准化处理31.</li>
	<li>构建一个数据矩阵，包含每个单神经元样本及信噪比达到要求的修饰核苷对应的归一化峰面积 &#62;10. 进行主成分分析（PCA），并在得分图中展示前两个主成分。根据核苷标准品系列稀释后获得的提取离子色谱峰面积构建线性校准曲线，并计算所检测分析物的浓度。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

SNRMA-MS 采用优化的样品制备方法，可获得体积小且适用于质谱分析的样品，并将其递送至液相色谱-质谱（LC-MS）平台。中枢神经系统神经节的初始酶预处理步骤决定了其去鞘的难易程度以及单个神经元在分离过程中的耐受性。由于脑神经节的鞘膜相对较厚，通常需要比口神经节、足神经节和腹神经节更长的酶处理时间。不同研究人员在使用显微剪刀和精细镊子进行单神经元分离时，对鞘膜应保留的坚韧程度可能有不同的偏好。然而，必须避免神经节过度消化，否则可能导致其结构完整性丧失、用于识别目标细胞的关键位置信息丢失，和/或细胞裂解。在将神经元从神经节中分离后，转移至样品管时应确保尽可能减少分离介质的吸取体积。人工海水（ASW）培养基含有高浓度盐分，可能干扰RNA水解过程中的消化酶活性，同时也会稀释样品。
在机械裂解步骤中，较大的神经元（&#62;250 µm 直径）在反复通过微量移液器时容易破裂。较小的神经元可能需要额外操作以确保细胞充分裂解，通常包括用玻璃毛细管轻压细胞。此时，由于毛细作用，部分样本缓冲液可能被吸入毛细管内。可通过向玻璃毛细管末端施加压力，将该部分液体重新排回样本管中，以确保无样本损失。
在添加用于RNA消化的酶之前，包含加热步骤可获得最佳结果。这可能是因为在95 °C加热能够使可能阻碍核糖核酸酶（RNases）活性的RNA二级结构变性35，并增加从RNA生物大分子中释放的核苷数量。先前已通过向样品中添加稳定同位素标记的甲硫氨酸进行对照实验，以探究热诱导的RNA修饰伪影是否导致相对于无加热SNRMA-MS方案观察到的RNA修饰峰面积升高29。实验未发现此类标记，表明采用优化后的SNRMA-MS方法所获得的RNA修饰信号增强是由于RNA消化效率更高所致。
从细胞中分离总RNA的传统方法涉及使用苯酚-氯仿进行液-液萃取（LLE），随后进行RNA沉淀、洗涤和重悬。这些方法已被证明在逆转录聚合酶链反应实验中具有实用性，可用于监测已鉴定的A. californica神经元中特定基因的表达36,37。然而，LLE方法无法回收足够量的RNA以通过液相色谱-质谱法（LC-MS）检测修饰核糖核苷，而本文所述的SNRMA-MS方法则能够检测多种RNA修饰29。为了评估大量组织/细胞样本中特定RNA类型（如rRNA、tRNA、mRNA）的修饰谱型，已应用阴离子交换固相萃取24、基于杂交探针的富集38和色谱分离39等方法，但类似的方法目前尚不可用于单细胞RNA纯化。开发能够从单个细胞中分离特定RNA类型的RNA分馏技术，将有助于进一步理解RNA修饰的功能。
A. californica 单个神经元的RNA修饰图谱中存在先前未被表征的异质性，而类似独特的翻译后修饰谱型也可能存在于哺乳动物细胞中。由于哺乳动物细胞相对于本方案中分析的大型 A. californica 神经元而言尺寸较小，因此需要改进微量样品处理技术以实现更低的检测限。尽管目前SNRMA-MS仅适用于约5 µL的样品体积，但通过将微流控液体处理装置整合到工作流程中，有望实现显著的技术提升。此外，采用自动化或半自动化的细胞分离方法将提高样本通量，使得对更大细胞群体进行单细胞RNA修饰分析成为可能。通过与纳流液相色谱分离技术联用27，将有望实现对更小细胞中表观转录组修饰的鉴定。

RNA经典核苷的修饰 increasingly 被认识到在调控蛋白质翻译中具有多种作用。迄今为止已报道了150多种独特的RNA修饰，其复杂性从甲基化、杂原子添加到与细胞代谢物的偶联不等1,2。这种扩展的RNA字母表，也称为表观转录组，由酶促“书写”蛋白催化生成，可调控RNA的稳定性3，折叠4，以及翻译效率5,6 细胞RNA的修饰。某些特定的RNA修饰也可能被逆转 通过 酶促擦除因子7,8而另一些则以亚化学计量比的方式附加到RNA上9,10，从而在生物系统中形成修饰与未修饰RNA序列共存的复杂图景。
RNA修饰在生物学功能中的重要性体现在其在不同器官和组织（包括中枢神经系统（CNS）的各个亚区）中分布不均11。这种化学异质性已被证实与CNS发育12、应激反应13以及活动依赖性可塑性14相关。CNS的亚区进一步包含多种异质性的细胞群体，其中单个细胞表现出不同的化学图谱15,16,17,18。即使是同类型的单个细胞，也可能展现出独特的转录组，部分原因在于组织微环境19和基因表达的随机性20。然而，尽管单细胞转录组的表征已相对常规，目前仍缺乏可用于建立多种RNA修饰的单细胞表观转录组的类似方法。为了全面分析中枢神经系统及其他生物系统中细胞异质性以及转录后修饰（PTMs）的调控作用，亟需开发能够描绘单个细胞中RNA修饰分布的新技术。
利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）可轻松实现对大量细胞/组织中多种RNA修饰的同时检测。在对修饰核糖核苷进行LC-MS/MS分析时，首先从细胞（通常为103-106个细胞）中提取RNA，通过沉淀和重悬纯化，随后将其消化为核苷。由标准核苷和修饰核苷组成的样品混合物被注入LC-MS系统，进行分析物的分离与检测，从而确定生物体中完整的RNA修饰谱21,22,23。最近，LC-MS/MS被用于测定神经生物学模型生物——加州海兔（Aplysia californica (A. californica)）中枢神经系统（CNS）中的26种RNA修饰。其中一些表观转录组标记物的丰度表现出时间和区域依赖性的动态变化，并与动物的行为改变相关联24。然而，由于该方法的灵敏度有限，仅能在包含&#62;103个细胞的大量样本中检测到RNA修饰。这种较大规模的样本可能掩盖了单个细胞独特的、具有重要功能的RNA修饰特征，而仅反映出群体平均值。尽管通过严格控制样品制备条件已提高了小体积样品中RNA修饰的检测灵敏度25,26,27,28，但仍亟需发展能够在单细胞水平上检测并定量多种修饰核糖核苷的分析方法。
本方案介绍了通过质谱法进行单神经元RNA修饰分析的技术（SNRMA-MS），该技术可实现对加州海兔（A. californica）中枢神经系统（CNS）中单个神经元内十余种RNA修饰的检测29。该方法包括从主要的中枢神经系统神经节中手术分离出单个已鉴定的神经元，随后采用优化的样品制备流程，该流程包含在质谱兼容缓冲液中进行机械性细胞裂解、RNA变性及酶解消化。随后利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）实现对转录后修饰核苷的鉴定与定量。SNRMA-MS填补了RNA修饰分析领域的一项空白，使获取单个神经元的转录后RNA修饰谱成为可能，并具备未来应用于其他细胞类型的潜力。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aplysia californica&lt;/em&gt;</td><td>中国台湾 Aplysia 资源中心（佛罗里达州迈阿密）</td><td></td><td>150&amp;ndash;250 g（成体）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;台式设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 管用小型离心机</td><td>LW Scientific</td><td>ZS-1</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000C</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Techne</td><td>EW-93945-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HPLC 色谱柱及耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acclaim RSLC 120 C18 色谱柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>71399</td><td></td></tr><tr><td>自动进样瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;液相色谱与质谱仪器及软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DataAnalysis 4.4 软件</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000 nanoLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>配备在线脱气装置、自动进样器和温控柱温箱</td></tr><tr><td>Impact HD UHR QqTOF 质谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td>配备电喷雾电离源（ESI source）</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>RStudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微解剖工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超细显微剪刀 Vannas 3.5&amp;rdquo;</td><td>Roboz</td><td>RS-5640</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td>Roboz</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004081</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Honeywell</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶（来自 &lt;em&gt;S. marcescens&lt;/em&gt; 的内切核酸酶）</td><td>EMD Millipore</td><td>70746-4</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>核苷测试混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47310-U</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7794</td><td></td></tr><tr><td>喷司他丁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0508</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二酯酶 I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS003926</td><td></td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt; 的蛋白酶 XIV 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>标准玻璃毛细管</td><td>A-M Systems</td><td>626000</td><td>外径 1 mm，内径 0.5 mm，长度 4 英寸</td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr></tbody></table>

使用质谱法在单个神经元中表征rna修饰

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

RNA的转录后修饰（PTMs）是中枢神经系统（CNS）中翻译调控过程中的一个尚未被充分研究的机制。最近的研究证据已将特定的神经元RNA修饰与学习和记忆范式联系起来。然而，传统的检测这些表观转录组特征的方法仅能对大量组织中丰度较高的RNA修饰进行表征，因而无法评估在行为激活的神经环路中单个神经元可能具有的独特PTM谱型。本实验方案描述了一种方法——基于质谱的单神经元RNA修饰分析（SNRMA-MS）—可同时检测并定量单个神经元中的多种修饰核糖核苷。该方法以海洋软体动物Aplysia californica的单个神经元为研究对象进行验证，首先通过手术分离其主要的中枢神经系统神经节，并进行酶处理以暴露神经元胞体，随后使用锋利的针头和微量移液器进行手动单神经元分离。接着，在少量缓冲液中对样本进行机械和热处理，以从单个细胞中释放RNA，进而进行RNA消化。随后采用优化的液相色谱-质谱联用方法对修饰核苷进行鉴定和定量。SNRMA-MS被用于建立来自A. californica的单个已鉴定神经元的RNA修饰模式，这些神经元具有明确的形态和功能。本文展示了SNRMA-MS在定性和定量分析中的应用实例，突显了RNA修饰在神经网络中不同单个神经元之间的异质性分布特征。

SNRMA-MS 包括手动分离已鉴定的神经元，将其置于小体积样品中进行裂解、消化以及 LC-MS/MS 分析（图 1A）。该流程常规可在来自加州海兔（A. californica）中枢神经系统（CNS）的单个神经元中检测到十余种 RNA 修饰（图 1B），相当于在单细胞水平上覆盖了该动物已知表观转录组近一半的内容24。例如，对 LPl1 神经元（直径约 500 µm）进行 SNRMA-MS 分析，共检测到 15 ± 1 种 RNA 修饰（n = 3）。修饰核苷的鉴定基于三个特征：液相色谱保留特性、精确质量以及与数据库提供的参考值相比的 MS2 碎裂谱图2。表 1 列出了在 LPl1 神经元中检测到的所有 RNA 修饰。本实验所用的高分辨率四极杆飞行时间质谱仪可实现 4 ppm 的质量精度，并能检测到修饰核苷 N6,6-二甲基腺苷（m66A）在 m/z 164 处的特征性 MS2 碎片离子（图 1B）。结合液相色谱分离数据（该数据与数据库中记录一致，显示 m66A 的洗脱时间晚于 N6-甲基腺苷（m6A）），SNRMA-MS 方法证明了其对修饰核苷身份的正确指认能力。
SNRMA-MS 平台可用于建立单个神经元的 RNA 修饰谱，并研究其与整体组织之间的关系。R2 神经元是位于腹神经节中的大型（直径约 500 µm）胆碱能细胞。SNRMA-MS 被用于分析 R2 神经元以及周围整体腹神经节的 RNA 修饰（图 2A）。将每个神经元/神经节样本（n = 7）中 RNA 修饰的归一化峰面积作为主成分分析（PCA）的输入，结果显示 R2 神经元的 RNA 修饰谱与其所处的神经节存在明显差异（图 2B）。这一点在 PCA 得分图中表现为 R2 神经元与腹神经节的数据点分布在不同的区域。另一组独立的动物样本（n = 7）进一步支持了修饰核苷模式的独特性，该实验对在单个神经元和整体组织中均常见检测到的 13 种 RNA 修饰进行了成对比较（图 2C）。其中两种修饰核苷——假尿苷（Ψ）和 2'-O-甲基鸟苷（Gm）——在腹神经节中的丰度显著高于 R2 神经元。当观察一组标示出 R2 神经元-神经节配对关系的 RNA 修饰子集时，所有腹神经节中 Ψ 和 Gm 的水平均更高，而除一个样本外，所有 R2 神经元中 2'-O-甲基腺苷（Am）的丰度均高于其对应的神经节（图 2D）。总体而言，SNRMA-MS 的结果首次揭示了在同一组织中，单个细胞的 RNA 修饰谱可与整体细胞群体产生差异。
使用SNRMA-MS研究模式动物 A. californica 为在已鉴定的、功能不同的神经元中表征RNA修饰谱提供了独特的机会。通过SNRMA-MS在四种已鉴定的细胞中评估了RNA修饰：R2和LPl1（同源的、胆碱能性细胞，参与防御性黏液释放）32，MCCs（参与摄食的5-羟色胺能调节神经元）33以及B2细胞（参与肠道运动的肽能神经元）34对这些已鉴定神经元中六种RNA修饰进行主成分分析（PCA），这些神经元或在酶处理后立即分离，或在神经节制备物中培养48小时，结果揭示了单细胞表观转录组的稳定性与动态变化。功能不同的细胞中RNA修饰在得分图中形成独特的聚类，而同源的R2/LPl1神经元则共同聚类（图 3A）。载荷图显示，差异主要由甲基腺苷的位置异构体丰度驱动，包括2'-O-甲基腺苷（Am）和N1-甲基腺苷（m1A) (图 3B）。在同一项分析中，对新鲜分离的细胞与培养后的细胞进行了比较 原位 （即在各自神经节内）孵育48小时。如主成分分析得分图所示，功能不同的细胞仍可通过其RNA修饰谱加以区分。
当存在真实标准品时，定量SNRMA-MS可用于测定特定RNA修饰的绝对含量。本研究针对m1A、Ψ、2'-O-甲基胞苷（Cm）、Am和m6A建立了外标标准曲线，并通过插值法确定MCC和R2/LPl1细胞对中每种修饰核苷的含量（图4A–E）。在两对对称的MCC细胞中，m1A和Ψ的细胞内含量相似，而在三对R2/LPl1细胞中，这些修饰的含量差异较大。为消除因细胞物理尺寸不同带来的影响，将RNA修饰含量根据细胞直径的光学测量值计算出的细胞体积进行归一化处理，从而获得修饰核苷的细胞内浓度。MCC与R2/LPl1神经元之间在Cm和Am的细胞内浓度上表现出显著差异。总体而言，SNRMA-MS技术可实现单个神经元中RNA修饰的定性与定量分析。
<img alt="神经元分离与酶消化方法，显示LC-MS分析与色谱图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：SNRMA-MS工作流程及通过LC-MS/MS在单个神经元中检测多种RNA修饰。（A）去被膜的口神经节照片及单个神经元分离至样品管的操作。比例尺 = 200 µm，箭头指示已鉴定的B1细胞。图中还展示了用于LC-MS/MS分析的样品制备流程示意图。（B）单个LPl1神经元中RNA修饰的叠加提取离子色谱图（EIC），插图显示N6, N6-二甲基腺苷（m66A）的MS1与MS2质谱图。有关生成修饰核苷EIC所用的m/z值，请参见表1。本图已根据文献29修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="海兔中枢神经系统研究；液相色谱-质谱分析；R2神经元分离；RNA修饰；示意图；数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：SNRMA-MS 可区分单个神经元与组织样本的 RNA 修饰谱。（A）A. californica 中枢神经系统示意图及分析 R2 神经元和周围腹神经节的工作流程。照片显示腹神经节及 R2 神经元（已注射快绿染料以增强可见性）。（B）基于 13 种 RNA 修饰的相对峰面积生成主成分分析（PCA）得分图（上）和载荷图（下）。（C）腹神经节与 R2 神经元中 RNA 修饰的成对比较。误差条表示 ±1 标准差（SD），*p &lt; 0.05，***p &lt; 5 × 10−4，经 Bonferroni−Holm 校正的配对 t 检验。（D）来自 C 图中部分 RNA 修饰的比较，其中每只动物的 R2 与腹神经节配对数据以连线表示。本图经修改自29。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="主成分分析（PCA）图；PC1 与 PC2；数据聚类；标注类别" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3在已鉴定的功能不同神经元中分析RNA修饰 A. californica 中枢神经系统 (A) 新鲜分离或分离后培养的MCCs、B2、R2和LPl1细胞的PCA得分图 原位 培养48小时（分别记为cMCC、cB2、cR2、cLPl1），以及（B) 这些细胞中常见六种RNA修饰的载荷图。该图已根据29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养比较；A) LMCC、RMCC细胞；B) R2、LPI1细胞；C-D) 细胞内pmol图；E) RNA修饰浓度；科学数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63940/63940fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：在 A. californica 神经元中进行的定量SNRMA-MS分析。 定量SNRMA-MS可提供单个已鉴定的 A. californica 神经元中多种修饰核苷的绝对含量及细胞内浓度。图示为（A）脑神经节中的左侧和右侧MCC（分别为LMCC和RMCC）以及（B）腹神经节中的R2和侧神经节中的LPl1。细胞以圆圈标出以增强可见性。（C）m1A 和（D）Ψ（三角形）的线性校准曲线，用于插值单个细胞中修饰核苷的含量（彩色圆点）。每只动物的成对细胞标记为1-3。（E）MCC及R2/LPl1成对细胞中五种修饰核苷的细胞内浓度。粗线连接成对细胞。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.005，采用Bonferroni−Holm校正的配对t检验；MCC组n = 2只动物（共4个细胞），R2/LPl1组n = 3只动物（共6个细胞）。本图经修改自29。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63940/63940fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNA修饰</td>
			<td>缩写</td>
			<td>洗脱顺序（C18）</td>
			<td>m/z EIC检测值</td>
			<td>m/z MS2检测值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二氢尿苷</td>
			<td>D</td>
			<td>1</td>
			<td>247.09</td>
			<td>115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>假尿苷</td>
			<td>Y</td>
			<td>2</td>
			<td>245.08</td>
			<td>209/179/155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-甲基胞苷</td>
			<td>m3C</td>
			<td>3</td>
			<td>258.11</td>
			<td>126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-甲基腺苷</td>
			<td>m1A</td>
			<td>4</td>
			<td>282.12</td>
			<td>150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-甲基胞苷</td>
			<td>m5C</td>
			<td>5</td>
			<td>258.11</td>
			<td>126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N7-甲基鸟苷</td>
			<td>m7G</td>
			<td>6</td>
			<td>298.12</td>
			<td>166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-O-甲基胞苷</td>
			<td>Cm</td>
			<td>7</td>
			<td>258.11</td>
			<td>112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肌苷</td>
			<td>I6A</td>
			<td>8</td>
			<td>269.09</td>
			<td>137</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-O-甲基鸟苷</td>
			<td>Gm</td>
			<td>9</td>
			<td>298.12</td>
			<td>152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2-甲基鸟苷</td>
			<td>m2G</td>
			<td>10</td>
			<td>298.12</td>
			<td>166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2,N2,N7-三甲基鸟苷</td>
			<td>m227G</td>
			<td>11</td>
			<td>326.15</td>
			<td>194</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2,N2-二甲基鸟苷</td>
			<td>m22G</td>
			<td>12</td>
			<td>312.13</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-O-甲基腺苷</td>
			<td>Am</td>
			<td>13</td>
			<td>282.12</td>
			<td>136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-甲基腺苷</td>
			<td>m6A</td>
			<td>14</td>
			<td>282.12</td>
			<td>150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,N6-二甲基腺苷</td>
			<td>m66A</td>
			<td>15</td>
			<td>296.14</td>
			<td>164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-异戊烯基腺苷</td>
			<td>i6A</td>
			<td>16</td>
			<td>336.17</td>
			<td>204/136/148</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：在加州海兔（A. californica）单个神经元中检测到的RNA修饰。 提供了用于表征修饰核苷的属性，包括液相色谱保留顺序、用于生成提取离子流图（EIC）的m/z值，以及相应的碰撞诱导解离（CID）碎片。

RNA的转录后修饰是翻译调控中一个尚未被充分研究的层面，最近已被发现与中枢神经系统可塑性相关。本文描述了用于在单个神经元中同时表征多种RNA修饰的样品制备方法以及液相色谱-串联质谱分析技术。

使用质谱法在单个神经元中表征RNA修饰

RNA转录后修饰（PTMs）是一种在中枢神经系统翻译调控中起作用但尚未被充分研究的机制……

通过本实验方案，我们首次提出了能够在单个神经元中同时分析多种RNA修饰的方法，为研究单细胞水平上的转录后调控开辟了新的领域。通过优化样品制备条件并结合液相色谱-串联质谱技术，可在单个神经元中检测并定量十余种修饰核苷。在功能、形态以及化学特征方面，各个细胞之间均存在差异。能够测量这些细胞的完整化学图谱（包括其RNA表达谱），并对足够数量的细胞进行分析，以了解它们在健康和疾病状态下的差异，这一点非常重要。在单个神经元分离之前，神经节制备的程度取决于操作者的个人偏好。可尝试较长和较短时间的蛋白酶处理，以确定合适的条件。首先，将麻醉后的加州海兔（Aplysia californica）腹侧朝上置于解剖盘中。使用一端为钝头的手术剪，将剪刀钝头朝向动物，沿足部小心地进行纵向剪切，开始解剖。将动物身体的头端、尾端及两侧用大头针固定，以暴露体腔内的内脏器官和中枢神经系统神经节。随后，通过手术切断从神经节发出的神经和部分连合纤维，将主要的中枢神经系统神经节从动物体内分离出来。将神经节浸入来自灰色链霉菌的10毫克/毫升蛋白酶XIV溶液中，在34摄氏度下孵育30分钟至1小时。接着，用人工海水抗生素溶液冲洗神经节六次。然后，使用剪切至5毫米开口的聚丙烯转移移液管，将所有神经节转移至盛有人工海水抗生素溶液的硅聚合物涂层培养皿中。始终将神经节浸没在人工海水中。接下来，为去除神经节鞘膜，用针固定神经节，并使用显微剪刀和精细镊子进行操作。若酶处理效果充分，可使用玻璃或金属针进行去鞘。在显微镜下识别出目标神经元。使用集束玻璃毛细管或锋利的钨针，小心地将已识别的细胞从神经节组织中分离出来。用塑料微量移液器吸取约一微升人工海水后，将分离的细胞转移至含有四微升 0.365 摩尔醋酸铵的 PCR 样品管中。进行空白测定后，从含有神经节的培养皿中收集五微升人工海水抗生素溶液，与消化缓冲液混合。用移液器在0.365摩尔醋酸铵溶液中反复吸打，使分离的神经元裂解。部分细胞可能不会立即破裂。为了裂解细胞，使用拉制的玻璃毛细管在细胞直径方向施加压力。随后，将样品置于热循环仪中加热，然后向样品中加入 3.375 µL RNA 消化缓冲液。使用微量移液器通过多次吸打溶液来混匀此混合液。使用微型台式离心机离心，使附着在PCR管管壁上的任何液滴沉降至管底。随后将样品置于热循环仪中，在37摄氏度孵育3小时，接着在10摄氏度条件下保存，同时将加热盖设为开启状态。样品冷却后，立即吸取7微升溶液转移至配备250微升内插管的自动进样瓶中，注意避免自动进样管中产生气泡。为准备液相色谱系统以分离标准核苷与修饰核苷，使用99%流动相A和1%流动相B在36摄氏度条件下以0.2毫升/分钟的流速平衡C18色谱柱，持续12分钟。以正离子模式运行质谱仪，在分析的前两分钟内将分流阀设置为废液，其余运行时间设置为进入离子源。随后，在 m/z 110 至 600 范围内采集质谱数据。根据数据库构建的优选质量列表，使用 0.5 的隔离窗口，于 35 至 40 电子伏特能量下对离子进行碰撞诱导解离，循环周期为三秒。在三次谱图后，采用动态排除技术排除离子的碎裂。对强度高于50,000计数的离子以4赫兹、强度低于50,000计数的离子以1赫兹的频率设置动态MS/MS谱图采集，并将离子选择的最低阈值设为1,990计数。为通过质谱法进行单个神经元RNA修饰的定量分析，需使用修饰核苷标准品在至少五个浓度下获得的提取离子色谱峰面积构建校准曲线，以实现对未知内源性分析物浓度的插值计算。通过质谱法对单个神经元RNA修饰进行分析，涉及将已识别的神经元手动分离至小体积样品中，用于裂解、消化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。利用质谱法对单个神经元RNA修饰的常规分析，已在加州海兔（Aplysia californica）中枢神经系统单个神经元中检测到十余种RNA修饰，覆盖了该动物已知表观转录组近一半的修饰种类。研究结果首次揭示，同一组织中单个细胞的RNA修饰谱可能与整体细胞群存在差异。在另一组动物队列中，通过对13种在单个神经元和整体组织中均常检测到的RNA修饰进行成对比较，进一步证实了不同修饰核苷酸模式的独特性。功能不同的细胞中的RNA修饰在得分图中形成了独特的聚类，而同源的R2/LPl1神经元则聚集在一起。载荷图显示，差异主要由甲基腺苷的位置异构体的丰度驱动，包括2'O-甲基腺苷和N1-甲基腺苷。针对N1-甲基腺苷、假尿苷、2'O-甲基鸟苷、2'O-甲基腺苷以及N6-二甲基腺苷建立了外部校准曲线。通过插值法确定了中脑细胞及R2/LPl1细胞对中每种修饰核苷的含量。确保将最小体积的人工海水与单个分离的神经元一同转移至PCR管中。这可以最大限度地减少样品稀释，从而避免影响分析物的检测。本方案可用于研究RNA修饰在轴突和树突等亚细胞结构中的分布，以加深对活动依赖性局部翻译机制的理解。

characterizing-rna-modifications-single-neurons-using-mass

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科研

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化学

使用质谱法表征单个神经元中的RNA修饰

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MeRIP-qPCR 检测骨肉瘤细胞中特定 RNA 的 m6A 修饰水平

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使用质谱法在单个神经元中表征RNA修饰

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