使用质谱法在单个神经元中表征RNA修饰
2022年4月21日
RNA的转录后修饰是翻译调控中一个尚未被充分研究的层面，最近已被发现与中枢神经系统可塑性相关。本文描述了用于在单个神经元中同时表征多种RNA修饰的样品制备方法以及液相色谱-串联质谱分析技术。
通过本实验方案，我们首次提出了能够在单个神经元中同时分析多种RNA修饰的方法，为研究单细胞水平上的转录后调控开辟了新的领域。通过优化样品制备条件并结合液相色谱-串联质谱技术，可在单个神经元中检测并定量十余种修饰核苷。在功能、形态以及化学特征方面，各个细胞之间均存在差异。
能够测量这些细胞的完整化学图谱（包括其RNA表达谱），并对足够数量的细胞进行分析，以了解它们在健康和疾病状态下的差异，这一点非常重要。在单个神经元分离之前，神经节制备的程度取决于操作者的个人偏好。可尝试较长和较短时间的蛋白酶处理，以确定合适的条件。
首先，将麻醉后的加州海兔（Aplysia californica）腹侧朝上置于解剖盘中。使用一端为钝头的手术剪，将剪刀钝头朝向动物，沿足部小心地进行纵向剪切，开始解剖。将动物身体的头端、尾端及两侧用大头针固定，以暴露体腔内的内脏器官和中枢神经系统神经节。随后，通过手术切断从神经节发出的神经和部分连合纤维，将主要的中枢神经系统神经节从动物体内分离出来。
将神经节浸入来自灰色链霉菌的10毫克/毫升蛋白酶XIV溶液中，在34摄氏度下孵育30分钟至1小时。接着，用人工海水抗生素溶液冲洗神经节六次。然后，使用剪切至5毫米开口的聚丙烯转移移液管，将所有神经节转移至盛有人工海水抗生素溶液的硅聚合物涂层培养皿中。
始终将神经节浸没在人工海水中。接下来，为去除神经节鞘膜，用针固定神经节，并使用显微剪刀和精细镊子进行操作。若酶处理效果充分，可使用玻璃或金属针进行去鞘。
在显微镜下识别出目标神经元。使用集束玻璃毛细管或锋利的钨针，小心地将已识别的细胞从神经节组织中分离出来。用塑料微量移液器吸取约一微升人工海水后，将分离的细胞转移至含有四微升 0.365 摩尔醋酸铵的 PCR 样品管中。
进行空白测定后，从含有神经节的培养皿中收集五微升人工海水抗生素溶液，与消化缓冲液混合。用移液器在0.365摩尔醋酸铵溶液中反复吸打，使分离的神经元裂解。部分细胞可能不会立即破裂。
为了裂解细胞，使用拉制的玻璃毛细管在细胞直径方向施加压力。随后，将样品置于热循环仪中加热，然后向样品中加入 3.375 µL RNA 消化缓冲液。使用微量移液器通过多次吸打溶液来混匀此混合液。
使用微型台式离心机离心，使附着在PCR管管壁上的任何液滴沉降至管底。随后将样品置于热循环仪中，在37摄氏度孵育3小时，接着在10摄氏度条件下保存，同时将加热盖设为开启状态。样品冷却后，立即吸取7微升溶液转移至配备250微升内插管的自动进样瓶中，注意避免自动进样管中产生气泡。为准备液相色谱系统以分离标准核苷与修饰核苷，使用99%流动相A和1%流动相B在36摄氏度条件下以0.2毫升/分钟的流速平衡C18色谱柱，持续12分钟。
以正离子模式运行质谱仪，在分析的前两分钟内将分流阀设置为废液，其余运行时间设置为进入离子源。随后，在 m/z 110 至 600 范围内采集质谱数据。根据数据库构建的优选质量列表，使用 0.5 的隔离窗口，于 35 至 40 电子伏特能量下对离子进行碰撞诱导解离，循环周期为三秒。
在三次谱图后，采用动态排除技术排除离子的碎裂。对强度高于50,000计数的离子以4赫兹、强度低于50,000计数的离子以1赫兹的频率设置动态MS/MS谱图采集，并将离子选择的最低阈值设为1,990计数。
为通过质谱法进行单个神经元RNA修饰的定量分析，需使用修饰核苷标准品在至少五个浓度下获得的提取离子色谱峰面积构建校准曲线，以实现对未知内源性分析物浓度的插值计算。通过质谱法对单个神经元RNA修饰进行分析，涉及将已识别的神经元手动分离至小体积样品中，用于裂解、消化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。利用质谱法对单个神经元RNA修饰的常规分析，已在加州海兔（Aplysia californica）中枢神经系统单个神经元中检测到十余种RNA修饰，覆盖了该动物已知表观转录组近一半的修饰种类。
研究结果首次揭示，同一组织中单个细胞的RNA修饰谱可能与整体细胞群存在差异。在另一组动物队列中，通过对13种在单个神经元和整体组织中均常检测到的RNA修饰进行成对比较，进一步证实了不同修饰核苷酸模式的独特性。功能不同的细胞中的RNA修饰在得分图中形成了独特的聚类，而同源的R2/LPl1神经元则聚集在一起。
载荷图显示，差异主要由甲基腺苷的位置异构体的丰度驱动，包括2'O-甲基腺苷和N1-甲基腺苷。针对N1-甲基腺苷、假尿苷、2'O-甲基鸟苷、2'O-甲基腺苷以及N6-二甲基腺苷建立了外部校准曲线。通过插值法确定了中脑细胞及R2/LPl1细胞对中每种修饰核苷的含量。
确保将最小体积的人工海水与单个分离的神经元一同转移至PCR管中。这可以最大限度地减少样品稀释，从而避免影响分析物的检测。本方案可用于研究RNA修饰在轴突和树突等亚细胞结构中的分布，以加深对活动依赖性局部翻译机制的理解。
概述
本文介绍了一种在单个神经元中分析多种RNA修饰的新方法，强调了其在理解中枢神经系统转录后调控中的重要意义。该方法通过优化的样品制备结合液相色谱-串联质谱技术，用于分析单个神经元的化学谱型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- RNA 修饰
背景
- RNA的转录后修饰对翻译调控至关重要。
- 这些修饰与中枢神经系统的可塑性相关。
- 了解单个神经元的特征对于揭示健康与疾病机制至关重要。
- 现有方法缺乏有效分析单个神经元的能力。
研究目的
- 开发一种在单个神经元中同时分析RNA修饰的方法。
- 探索单个细胞中RNA谱的化学多样性。
- 研究健康状态与疾病状态下RNA修饰的差异。
使用的方法
- 从加州海兔（Aplysia californica）神经节中分离单个神经元。
- 采用蛋白酶处理法进行神经节制备。
- 使用液相色谱-串联质谱法进行分析。
- 建立校准曲线以定量修饰核苷。
主要结果
- 在单个神经元中检测到十余种RNA修饰。
- 单细胞的修饰谱与组织整体分析结果存在差异。
- 在功能不同的细胞中鉴定出独特的修饰核苷酸模式。
- 研究结果支持分析单个神经元修饰谱的重要性。
结论
- 该方法能够对单个神经元中的RNA修饰进行详细分析。
- 研究结果有助于深入理解神经科学中的表观转录组。
- 该方法为转录后调控领域的研究开辟了新的途径。
常见问题
行业重要性概述
基于质谱的单神经元RNA修饰谱分析能够以前所未有的分辨率绘制中枢神经系统内的转录后调控机制图谱。该技术填补了理解细胞特异性表观转录组多样性的关键空白，有助于在神经生物学靶点验证中实现机制层面的风险降低和预测信心提升。该方法使生物制药研发能够以单细胞水平探究与学习、记忆及疾病模型相关的神经元异质性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在单个神经元中直接探究转录后调控机制。
- 通过揭示细胞特异性的RNA修饰模式，支持功能靶点的验证。
- 基于表观转录组学特征区分神经元亚型，有助于阐明作用机制并降低研发风险。
- 提高中枢神经系统药物发现中靶点筛选的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的单细胞分析工作流程，用于下游筛选应用。
- 对分离的神经元中修饰核苷进行定量、可重复的测量。
- 支持对稀有或功能独特的神经元群体进行检测标准化。
- 支持神经药理学中化合物比较评估的平台可扩展性。
转化与临床前研究
- 将单细胞RNA修饰数据与疾病相关的神经元环路进行比对。
- 通过关联分子特征与功能表型，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 基于细胞类型特异性的表观转录组标记，支持风险调整后的研发推进决策。
- 促进中枢神经系统疾病转化生物标志物的鉴定。
流程与工作流整合
该方法通过实现从早期靶点验证到转化研究的RNA修饰高分辨率图谱分析，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- 发现生物学：通过在单个神经元中分析RNA修饰，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：为神经元系统的检测方法开发提供定量、可重复的输出结果。
- 分析：对修饰核苷进行可靠测量，实现不同细胞类型和条件间的统计学比较。
- 转化研究：将单细胞分子特征与疾病相关的神经元网络相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的分析平台，服务于多种中枢神经系统研究和药物发现项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高中枢神经系统靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可扩展且可重复的单细胞分析工作流程。
- 战略价值：支持神经生物学领域内基于充分信息的立项/终止决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持对中枢神经系统发现资产进行风险校准后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备单细胞分离和基于质谱分析的专业技术。
- 需要配备用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和样品制备的专用仪器设备。
- 为确保可重复性和数据可比性，需在不同研究团队间进行严格的标准统一。
- 可能需要针对不同的神经元亚型或模式生物进行方法调整。
- 样品稀释以及分析物检测灵敏度是需要解决的实际限制因素。
