一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

我们的方案将有助于从神经回路到组分尺度的神经元结构研究，这对于深入理解脑功能至关重要。我们的透明化技术 ScaleSF 具有强大的透明能力，同时能高度保持组织结构，从而实现对大尺度和小尺度结构的同时可视化。本方案在神经元细胞具有复杂突起、大量连接并形成特化精细亚细胞结构的脑组织中尤为有效。

实验开始前，按照本表所示配制Sca/eS溶液，并用锡箔纸覆盖样本。取六孔细胞培养板，在两个独立的孔中分别加入8毫升ScaleS0溶液和8毫升ScaleS4溶液，将培养板置于37摄氏度培养箱中预热。用刮勺将脑片转移至预热的ScaleS0溶液中，于37摄氏度、90 RPM条件下在摇床培养箱中孵育2小时。

接下来，将透化的脑切片转移至六孔细胞培养板中，每孔加入8毫升不含添加剂的PBS，置于40至60 RPM的摇床中洗涤15分钟。重复此步骤两次。然后，将脑切片转移至8毫升预热的ScaleS4溶液中，在37摄氏度、90 RPM条件下孵育8至12小时。

进行腔室制备时，使用3D打印技术制作腔室框架和显微镜载物台适配器。利用压敏胶将腔室框架固定在盖玻片上。用ScaleS4D25(0)溶液配制1.5%琼脂糖溶液。

将溶液混合后微波加热，直至琼脂糖完全溶解。随后让溶液冷却至37摄氏度。用刮勺将透明化处理后的脑片转移至成像腔底部的盖玻片上。

使用干净的纸巾去除透明化切片上多余的溶液。用移液枪将 ScaleS4 凝胶加入脑切片中，以填满成像腔。随后用镊子将另一块盖玻片盖在上面，再覆盖一张滤纸和一块载玻片。

将成像腔室转移至4°C的冰箱中。在玻璃载片上放置金属重物，静置30分钟。孵育结束后，从成像腔室中取出材料，并擦去多余的凝胶。

将成像腔室置于60毫米玻璃培养皿中，并使用压敏胶将成像腔室边缘的多个点固定在培养皿上。向培养皿中加入ScaleS4溶液，在20至25摄氏度下以40至60 RPM轻轻振荡一小时。更换新鲜溶液，并用移液器吸头轻轻刮擦凝胶表面以去除表面的气泡。

将成像室安装在显微镜载物台上。准备一台配备多浸润物镜的共聚焦激光扫描显微镜，物镜参数为2.5毫米工作距离、16倍放大倍数和0.60数值孔径。打开所有相关成像设备，例如工作站、显微镜、扫描仪、激光器、汞灯，并启动成像软件。

将多浸液物镜的校正环设置为1.47。将物镜浸入溶液中，并缓慢接近切片。清除物镜尖端附着的所有气泡。

使用落射荧光在透明化组织中寻找感兴趣区域。设置图像采集参数时，首先根据图像大小随位深度增加的特性，确定图像采集的位深度。然后根据发射光谱设置检测波长。

设置XY分辨率、扫描速度和针孔大小。同时调整激光功率、检测器放大器增益和偏移，直至获得合适的图像。根据ROI的大小确定拼接范围，确保完整覆盖ROI的全长和全宽。

在所有平面上浏览组织，并设置图像栈的起始点和终止点。根据所需的Z轴分辨率设置Z步长。采集图像，并使用图像分析软件进行处理。

采用本方案，成功实现了厚度为一毫米的小鼠脑片的光学透明化。PV-FGL小鼠大脑皮层中的EGFP表达显示，组织的荧光信号和结构完整性均得以保留。由折射率不匹配引起的像差导致EGFP阳性神经元的图像亮度和分辨率明显下降。

当校正环调整至与该 ScaleS4 溶液匹配时，共聚焦激光扫描显微镜可清晰地观察到这些神经元。对小鼠初级体感皮层中 EGFP 标记的神经元进行三维重建，样品为一毫米厚的脑切片。在更高放大倍数下，可观察到带有树突棘的单个树突分支。

在切片中还观察到了轴突末端的分支以及轴突上的突起。成像液体与物镜之间的折射率匹配对于透明化组织中的三维成像至关重要。我们的技术将有助于从神经回路到组分尺度整合神经元结构，从而为神经元机制及大脑信息处理提供深入见解。