一种从介观尺度到微观尺度的神经元成像组织清除方法
2022年5月10日
该协议提供了使用组织清除方法ScaleSF在脑切片中进行神经元成像的详细方法。该方案包括脑组织制备，组织澄清，清除切片的处理以及从介观到微观水平的神经元结构的共聚焦激光扫描显微镜成像。
我们的协议将促进从电路到组件尺度的神经元结构的研究，这对于更好地理解大脑功能至关重要。我们的清除技术，ScaleSF发挥了强大的清除能力，以及同时可视化大型和小型结构所需的高水平组织保存。我们的方案在大脑中特别有效，其中神经元细胞表现出复杂的过程，巨大的联系，并安排专门的精细亚细胞结构。
在开始实验之前，如本表所示，制备Sca / eS溶液并用箔覆盖样品。通过将ScaleS0和ScaleS4溶液各八毫升添加到六孔细胞培养板的两个独立孔中，并在培养箱中将板预热至37摄氏度来开始该过程。用刮刀将脑切片转移到预热的ScaleS0溶液中，并在37摄氏度下以90 RPM的振荡培养箱中将切片孵育两小时。
接下来，将透化的脑切片转移到八毫升PBS减去六孔细胞培养板中，并通过保持在40至60 RPM的轨道振荡器中洗涤15分钟。重复此步骤两次。然后，将脑切片转移到8毫升预热的ScaleS4溶液中，并在37摄氏度下以90 RPM孵育8至12小时。
对于腔室制备，3D打印腔室框架和显微镜载物台适配器。使用压敏粘合剂将腔室框架连接到盖玻片上。在ScaleS4D25（0）溶液中制备1.5%琼脂糖。
混合溶液并用微波炉加热，直到琼脂糖完全溶解。然后让溶液冷却至37摄氏度。用刮刀将清除的脑切片安装到成像室的底部盖玻片上。
使用干净的组织从清除的切片中取出多余的溶液。使用微量移液管将ScaleS4凝胶添加到脑切片中以填充成像室。用镊子在上面放另一个盖玻片，然后用一张纸巾和一张载玻片。
将成像室转移到四摄氏度的冰箱中。将金属砝码放在载玻片上，静置 30 分钟。孵育后，从成像室中取出材料并擦去多余的凝胶。
将成像室置于60毫米玻璃培养皿中，并用压敏粘合剂将成像室的边缘在多个点上连接到培养皿上。将ScaleS4溶液倒入培养皿中，在20至25摄氏度下以40至60 RPM温和摇动一小时。用新鲜溶液代替，并使用移液器吸头轻轻刮擦表面以去除凝胶表面上的气泡。
将成像室安装在显微镜载物台上。准备一台共聚焦激光扫描显微镜，配备工作距离为2.5毫米，放大倍率为16倍，数值孔径为0.60的多浸入物镜。打开所有相关的成像设备，如工作站、显微镜、扫描仪、激光器、汞灯，然后启动成像软件。
将多浸入式物镜的校正环设置为1.47。将物镜浸入溶液中，让它慢慢接近切片。清除物镜尖端的所有气泡。
使用落射荧光在清除的组织中查找感兴趣的区域。要设置图像采集参数，首先，确定图像采集的位深度，因为图像的大小随着位的增加而增加。然后根据发射光谱设置检测波长。
设置 XY 分辨率、扫描速度和针孔大小。还要调整激光功率、检测器放大器增益和偏移，直到获得合适的图像。根据 ROI 的大小确定平铺大小，确保捕获 ROI 的整个长度和宽度。
在所有平面中的组织中导航，并设置堆栈的起点和终点。根据所需的 Z 分辨率设置 Z 步长。收集图像并使用图像分析软件进行处理。
使用该协议，实现了一毫米厚度的小鼠脑切片的光学清除。EGFP在PV-FGL小鼠大脑皮层中的表达表明，组织的荧光和结构完整性得以保留。折射率失配引起的像差导致EGFP阳性神经元的图像亮度和分辨率的明显损失。
当调整校正环以匹配此ScaleS4溶液时，用共聚焦激光扫描显微镜清楚地观察这些神经元。在一毫米厚的脑切片中完成小鼠初级躯体感觉皮层中EGFP标记神经元的3D重建。在更高的放大倍率下可以看到装饰有树突状棘的单个树突状乔木。
在切片中还观察到轴突末端树艺化和轴突柱突。成像流体和物体透镜之间的反射指数匹配对于清除组织中的3D成像至关重要。我们的技术将有助于将神经元结构从电路整合到组件尺度，提供对神经元机制的见解，大脑中的处理信息。
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概述
本研究提出了一种使用名为ScaleSF的新型组织透明化方法进行脑切片神经元成像的详细协议。该技术允许高分辨率可视化神经元结构，促进从电路到组件尺度的研究，对于理解大脑功能至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 神经元细胞显示复杂的过程和特殊的结构。
- 组织透明化技术增强了神经科学的成像能力。
- ScaleSF提供有效的透明化而不损害组织完整性。
- 详细的成像方法对于阐明神经元机制至关重要。
研究目的
- 开发一个可靠的脑切片神经元结构成像协议。
- 利用ScaleSF技术同时可视化各种神经元尺度。
- 增强对大脑神经元机制和信息处理的理解。
使用的方法
- 利用体外脑切片进行成像研究。
- 生物模型涉及小鼠脑组织，特别是PV-FGL小鼠。
- 未提及多组学工作流程。
- 关键步骤包括溶液准备、孵化和共聚焦显微镜设置。
- 使用共聚焦激光扫描显微镜对神经元结构进行3D重建。
主要结果
- ScaleSF方法保留了脑组织的荧光和结构完整性。
- 清晰可视化的EGFP阳性神经元允许对树突和轴突结构进行详细成像。
- 发现强调了折射率匹配对有效成像的重要性。
- 3D成像成功捕捉了神经元形态的复杂性。
结论
- 本研究证明了ScaleSF在神经元成像中的有效性。
- 增强的成像技术将能够更好地理解神经元电路和机制。
- 该协议为详细探索健康和疾病中的神经元过程开辟了途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution neuronal imaging across mesoscopic to microscopic scales is critical for target validation and mechanistic de-risking in CNS drug discovery. The ScaleSF tissue clearing protocol enables robust visualization of neuronal circuits and subcellular structures, supporting predictive confidence in early discovery and translational neuroscience pipelines. This capability enhances portfolio decision-making by providing detailed structural insights essential for hypothesis-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal connectivity and circuit architecture for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by preserving fine subcellular features during imaging.
- Facilitates predictive confidence in CNS target selection through comprehensive structural mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares optically cleared, structurally intact brain slices for quantitative imaging assays.
- Standardizes imaging conditions to ensure reproducibility and comparability across experiments.
- Delivers high-content, scalable imaging outputs suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural imaging with disease-relevant neuronal models for translational continuity.
- Enables 3D reconstruction of neuronal morphologies to inform preclinical validation.
- Supports risk-adjusted advancement by providing detailed anatomical context for biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
This tissue clearing and imaging protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research in neuroscience portfolios.
- Discovery Biology: Provides high-resolution visualization for hypothesis testing and pathway clarification in neural circuits.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables 3D image acquisition and analysis of neuronal structures for robust data comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by supporting disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable protocol for diverse CNS imaging applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neuronal imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing detailed structural data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis.
- Demands access to multi-immersion objective lenses and compatible imaging chambers.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and sample preparation.
- Adaptation may be needed for different tissue types or disease models.
- Precise refractive index matching is critical for optimal imaging quality.
