Name: 一种从介观尺度到微观尺度的神经元成像组织清除方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 了解ScaleSF组织透明化技术用于小鼠脑片神经元成像的方法。该技术可在保持荧光信号的同时实现高分辨率三维成像，帮助研究者从神经环路到亚细胞结构深入解析大脑功能机制。

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作者感谢顺天堂大学的 Yoko Ishida 提供腺相关病毒载体的制备，以及顺天堂大学的 Kisara Hoshino 提供的技术支持。本研究得到了日本学术振兴会科研费（JSPS KAKENHI，项目号 JP20K07231 至 K.Y.；JP21H03529 至 T.F.；JP20K07743 至 M.K.；JP21H02592 至 H.H.）以及创新领域研究“共振生物”（JP18H04743 至 H.H.）的资助。本研究还获得了日本医学研究开发机构（AMED）（项目号 JP21dm0207112 至 T.F. 和 H.H.）、日本科学技术振兴机构（JST）的登月型研发计划（Moonshot R&amp;#38;D，项目号 JPMJMS2024 至 H.H.）、JST 融合导向颠覆性科学技术研究计划（FOREST，项目号 JPMJFR204D 至 H.H.）、顺天堂大学医学院老年病研究所研究助成金（X2016 至 K.Y.；X2001 至 H.H.）以及私立大学品牌化项目的支持。

所有实验均经顺天堂大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：2021245、2021246），并依照日本科学理事会《动物实验正确实施的基本指南》（2006年）进行。本研究使用了雄性C57BL/6J小鼠，该小鼠注射了携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的AAV载体，以及副肌球蛋白（PV）/肉豆蔻酰化-EGFP-低密度脂蛋白受体C末端细菌人工染色体（BAC）转基因小鼠（PV-FGL小鼠）9。PV-FGL小鼠维持在C57BL/6J遗传背景中。本研究未发现与性别相关的差异。
1. 组织准备
<ol>
	<li>灌注固定 
	注意：步骤 1.1.1 至 1.1.3 需在通风橱中进行，以减少接触多聚甲醛（PFA）。
	<ol>
		<li>通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（200 mg/kg）对成年雄性小鼠（8–16 周龄）进行麻醉。通过脚趾夹捏回缩反射和眨眼反射消失确认麻醉充分。</li>
		<li>打开胸腔，用手术剪剪开右心耳。使用连接 20 mL 注射器的 23 G 针头，先以 20 mL 冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）对小鼠进行灌注，随后使用另一支 20 mL 注射器灌注 20 mL 冰冷的含 4% PFA 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）。 
		警告：PFA 具有毒性和致畸性。避免吸入或接触皮肤、眼睛及黏膜。</li>
		<li>用镊子将脑组织从颅骨中取出。将脑组织转移至含有 0.1 M PB 中 4% PFA 的 15 mL 离心管中，避光保存，并在 4 °C 下以 50–100 rpm 轻柔振荡过夜。</li>
		<li>注意：收获的脑组织可在含 0.02% 叠氮化钠（NaN3）的 PBS 中于 4 °C 保存数周。 
		警告：NaN3 具有毒性。避免吸入或接触皮肤、眼睛及黏膜。操作时应在通风橱内进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑切片制备
	<ol>
		<li>通过将 2 g 琼脂加入 50 mL PBS 中配制 4% 琼脂溶液。微波加热至琼脂完全溶解。让溶液冷却至 40–45 °C。 
		注意：琼脂中的主要成分琼脂糖胶赋予溶液黏性，有助于组织切片的切割。</li>
		<li>将 10 mL 琼脂溶液加入 6 孔细胞培养板中。用镊子将脑组织浸入琼脂溶液中。置于冰上使琼脂凝固。</li>
		<li>从孔板中取出包埋好的脑组织，用剃刀片修整琼脂块。用速干胶将琼脂块固定在振动切片机浴槽底部，并在缓冲液槽中加入 0.1 M PB。</li>
		<li>使用浸有乙醇的无绒纸巾清洁另一片剃刀片，并将其安装至振动切片机的刀片夹持器上。</li>
		<li>设置切片速度为 0.14 mm/s，振幅为 1.4 mm，频率为 75–77 Hz。将脑组织切成 1 mm 厚的切片，并将切片收集至含有 PBS 的 6 孔细胞培养板中。 
		注意：脑切片可在含 0.02% NaN3 的 PBS 中于 4 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织透明化
注意：Sca的组成l所使用的 eS 溶液列于下文 表1样品应用锡箔包裹以避免光照。透明化步骤如图所示。 图1A.
<ol>
	<li>向6孔细胞培养板的一个孔中加入8 mL ScaleS0溶液，向另一孔中加入8 mL ScaleS4溶液，并在培养箱中预热至37 °C。</li>
	<li>用刮勺将脑片转移至预热的ScaleS0溶液中，在37 °C、90 rpm的振荡培养箱中孵育2小时。</li>
	<li>用刮勺将通透处理后的脑片转移至含有8 mL PBS(–)的6孔细胞培养板中，在40–60 rpm的水平摇床中洗涤15分钟，重复此步骤两次。</li>
	<li>用刮勺将脑片转移至预热的8 mL ScaleS4溶液中，在37 °C、90 rpm的振荡培养箱中孵育8–12小时以实现透明化。透明化后的脑片如图1所示。</li>
</ol>
3. 脑切片的制备
注意：使用可定制的成像腔室以稳定固定透明化脑切片（图2）6。该腔室由腔室框架和底部盖玻片组成。显微镜载物台适配器也经过设计，可将成像腔室直接安装在显微镜载物台上（图2A、B）。腔室框架和显微镜载物台适配器可通过内部或外包的3D打印服务进行3D打印。成像腔室的3D计算机辅助设计（CAD）数据已在Furuta等2022年研究中提供6。
<ol>
	<li>进行腔室准备时，使用压敏胶将腔室框架固定在盖玻片上。</li>
	<li>通过将1.5 g琼脂糖加入100 mL ScaleS4D25(0)溶液（ScaleS4凝胶）中，制备1.5%琼脂糖溶液。充分搅拌混合后，微波加热至琼脂糖完全溶解。完成后，使溶液冷却至37 °C。</li>
	<li>用刮铲将透明化处理后的脑片转移至成像腔室的底部盖玻片上，并用洁净无绒纸巾擦去脑片表面多余的溶液。</li>
	<li>使用移液器将ScaleS4凝胶滴加至脑片上，填充成像腔室。用镊子将另一片盖玻片覆盖在上方，随后依次放置一片无绒纸巾和一块载玻片。</li>
	<li>将成像腔室转移至4 °C冰箱中，在载玻片上放置金属重物，静置30分钟。</li>
	<li>从成像腔室上移除金属重物、载玻片、无绒纸巾和顶部盖玻片，并擦去多余的凝胶（图2A,B）。</li>
	<li>将成像腔室放入60 mm玻璃培养皿中，并使用类似橡皮泥的压敏胶将腔室边缘固定在培养皿上，需在多个位置进行固定。</li>
	<li>向培养皿中加入ScaleS4溶液，在20–25 °C下以40–60 rpm在旋转摇床上轻轻振荡1小时。更换新鲜溶液，并用200 µL移液器吸头轻轻刮除凝胶表面的气泡。将浸没在溶液中的成像腔室安装至显微镜载物台上（图2C）。</li>
</ol>
4. 共聚焦激光扫描显微成像
<ol>
	<li>使用配备长工作距离（WD）多介质物镜（16倍/0.60 数值孔径 [NA]，WD = 2.5 mm）的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）采集图像。 
	注意：高数值孔径（NA）物镜可提供高衍射极限分辨率。</li>
	<li>开启所有相关成像设备（工作站、显微镜、扫描仪、激光器和汞灯），并启动CLSM成像软件。</li>
	<li>将多介质物镜的校正环设置为1.47。ScaleS4溶液的折射率（RI）约为1.475,7。折射率不匹配引起的像差会影响图像形成（图3）。</li>
	<li>将物镜浸入溶液中，并缓慢接近组织切片。清除物镜前端附着的任何气泡。使用落射荧光在透明化组织中寻找感兴趣区域（ROIs）。</li>
	<li>通过测试合适的设置来确定图像采集参数。
	<ol>
		<li>确定图像采集的位深。图像的数据量随位深增加而增大。</li>
		<li>设置&#160;检测波长。根据发射光谱调整探测器的合适门控范围。确保检测波长不包含任何激光谱线。</li>
		<li>设置xy分辨率。较大的图像格式可提供更优的xy分辨率，但采集图像所需时间更长。</li>
		<li>设置扫描速度。较慢的扫描速度可提供较高的信噪比，但也会增加像素驻留时间及光漂白风险。应根据需要进行选择。</li>
		<li>调节针孔大小。针孔大小控制光学切片厚度。较小的针孔产生更薄的光学切片，从而获得更优的z分辨率，但会降低荧光信号强度；增大针孔可获得更厚的光学切片和更强的荧光信号。</li>
		<li>设置激光功率、探测器/放大器增益和偏移量。逐步增加激光功率和探测器/放大器增益，直至获得合适的图像。过高的激光功率可能导致光漂白。适当调节偏移量（对比度），以获得高信噪比。</li>
		<li>根据感兴趣区域（ROI）的大小确定所需的拼接范围。确保完整覆盖ROI的全长和全宽。</li>
		<li>在各个平面上导航透明化组织，设定图像堆栈的起始点和终止点。根据所需的z分辨率设置z轴步进大小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在对图像采集参数满意后开始采集图像，并保存所获取的图像。使用图像分析软件对图像进行处理。</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+light+microscopy%2Felectron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method%2C+ScaleSF%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601(2022).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li>
<li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre%2Flox+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230(2021).</li>
<li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li>
<li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons%3A+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611(2017).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li>
<li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat%3A+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).</li>
<li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li>
<li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li>
<li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+1%2C000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实验方案中的关键步骤 
本实验方案中有若干关键步骤必须格外谨慎地操作，以获得有意义的结果。在大规模组织中进行三维成像时，样本的均匀固定至关重要。物镜、样本和浸没液的折射率（RI）必须匹配。若三者之间存在折射率不匹配，将导致在透明化脑切片中对表达EGFP的细胞成像时出现严重干扰（图3）。通过调节物镜的校正环以匹配浸没液的折射率，可最大限度减少由深度引起的球面像差，从而在三维成像中提升信号强度、对比度和空间分辨率。所配制溶液的折射率可使用折射仪进行测量。
技术故障排除 
溶液储存时间过长可能影响其透明化能力，以及荧光信号和结构完整性的保持能力。应使用新鲜配制的溶液。这些溶液可在 4 °C 下保存最多 1 个月。等距性对于实现高效、有效的神经元成像及准确的信号重建至关重要。尽管在孵育 12 小时后观察到样本尺寸略有扩张（图 1B），但通过将孵育时间控制在 8–12 小时之间，可有效控制该扩张现象。为了获得更精...

组织透明化方法已显著改善了生物和临床样本在光学显微镜下的深度无关成像，使得能够从完整组织中提取结构信息1,2。光学透明化技术还可能加快组织学分析速度，并降低其成本。目前主要有三种透明化方法：亲水性、疏水性和基于水凝胶的方法1,2。其中，亲水性方法在保持荧光信号和组织完整性方面表现更优，且相较于其他两种方法毒性更低3,4。
一种亲水性透明化方法 ScaleS 因其在保持组织结构和分子完整性的同时具备强大的透明化能力（透明-保存光谱）而具有独特地位5。在之前的研究中，我们通过改进 ScaleS 的透明化流程，开发了一种快速且等距的组织切片（约 1 mm 厚度）透明化方案 ScaleSF6。该透明化方案需将脑切片依次在三种溶液中孵育 10.5–14.5 小时。该方法具有很高的透明-保存光谱，甚至可兼容电子显微镜（EM）分析（补充图 1），从而实现多尺度、高分辨率的三维（3D）成像，并实现信号的精确重建6。因此，ScaleSF 特别适用于脑组织，其中神经元细胞具有高度复杂的长程突起，并形成用于传递和接收信息的特化精细亚细胞结构。获取从神经环路到亚细胞水平的神经元结构信息，对于深入理解脑功能具有重要意义。
本文提供了一种使用ScaleSF技术对神经元结构进行成像的详细方案，成像尺度涵盖介观/环路水平至微观/亚细胞水平。该方案包括组织制备、组织透明化处理、透明化组织的操作以及对透明化组织进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。本方案重点在于从神经环路到亚细胞组分尺度上解析神经元结构。有关溶液配制以及将腺相关病毒（AAV）载体立体定位注射至小鼠脑内的详细操作步骤，请分别参考Miyawaki等（2016）7和Okamoto等（2021）8。

<table><tbody><tr><td>16倍多介质物镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01028-85</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>TaKaRa Bio</td><td>L03</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13407-45</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06286-55</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-环糊精</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essential</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>ver. 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Leica 应用套件 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td><td></td></tr><tr><td>甲基-&amp;beta;-环糊精</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck Millipore</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (10倍; pH 7.4)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>27575-31</td><td>10倍 PBS(&amp;ndash;)</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31233-55</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35940-65</td><td></td></tr><tr><td>振动组织切片机</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

本文提供了一种详细的实验方案，用于在脑组织中从介观到微观水平可视化神经元结构。利用经ScaleSF光学透明化处理的小鼠脑切片，可实现从神经环路至亚细胞级神经元结构的成像。该透明化方法是ScaleS的改进版本，是一种适用于组织切片的亲水性透明化技术，兼具高效的透明能力以及对荧光信号和结构完整性的高度保留。本研究设计了一种可定制的三维（3D）打印成像腔室，用于稳定固定透明化后的脑组织。将携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体注射至小鼠脑内后，使用4%多聚甲醛固定脑组织，并用振动式组织切片机切成1 mm厚的脑片。脑切片按照透明化方案依次浸入三种溶液中孵育，分别为ScaleS0溶液、磷酸盐缓冲液（–）和ScaleS4溶液，总时长为10.5–14.5小时。透明化后的脑切片被固定于成像腔室内，并包埋于溶解在ScaleS4D25(0)溶液中的1.5%琼脂糖凝胶中。使用配备长工作距离多浸润物镜的共聚焦激光扫描显微镜进行切片的三维图像采集。从介观神经元成像开始，我们成功在光学透明化的脑切片中观察到了树突棘和轴突终扣等精细的亚细胞神经元结构。该实验方案将有助于在神经环路至亚细胞组分尺度上深入理解神经元结构。

采用本方案实现了1 mm厚小鼠脑切片的光学透明化。图1B展示了小鼠脑切片在透明化处理前后的透射图像。该组织透明化方法使1 mm厚的小鼠脑切片变为透明。在透明化溶液中孵育12小时后，脑切片的最终尺寸略有扩大（线性膨胀率为102.5% ± 1.3%）。通过PV-FGL小鼠中血浆膜上靶向表达的EGFP评估了组织中荧光信号和结构完整性的保留情况（图1C）。在这些小鼠中，体树突膜靶向的EGFP在PV阳性神经元中表达9。经透明化处理后，体树突区域血浆膜上靶向的EGFP表达得以保留（图1C）。此外，先前的电镜研究表明，经ScaleSF透明化处理的脑组织结构完整性保持良好（补充图1）6。
折射率不匹配引起的像差导致图像亮度和分辨率明显下降（图3）。将一片厚度为1 mm...

本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。

本文提供了一种详细的实验方案，用于在脑组织中从介观到微观水平可视化神经元结构。所涵盖的神经元结构包括……

我们的方案将有助于从神经回路到组分尺度的神经元结构研究，这对于深入理解脑功能至关重要。我们的透明化技术 ScaleSF 具有强大的透明能力，同时能高度保持组织结构，从而实现对大尺度和小尺度结构的同时可视化。本方案在神经元细胞具有复杂突起、大量连接并形成特化精细亚细胞结构的脑组织中尤为有效。实验开始前，按照本表所示配制Sca/eS溶液，并用锡箔纸覆盖样本。取六孔细胞培养板，在两个独立的孔中分别加入8毫升ScaleS0溶液和8毫升ScaleS4溶液，将培养板置于37摄氏度培养箱中预热。用刮勺将脑片转移至预热的ScaleS0溶液中，于37摄氏度、90 RPM条件下在摇床培养箱中孵育2小时。接下来，将透化的脑切片转移至六孔细胞培养板中，每孔加入8毫升不含添加剂的PBS，置于40至60 RPM的摇床中洗涤15分钟。重复此步骤两次。然后，将脑切片转移至8毫升预热的ScaleS4溶液中，在37摄氏度、90 RPM条件下孵育8至12小时。进行腔室制备时，使用3D打印技术制作腔室框架和显微镜载物台适配器。利用压敏胶将腔室框架固定在盖玻片上。用ScaleS4D25(0)溶液配制1.5%琼脂糖溶液。将溶液混合后微波加热，直至琼脂糖完全溶解。随后让溶液冷却至37摄氏度。用刮勺将透明化处理后的脑片转移至成像腔底部的盖玻片上。使用干净的纸巾去除透明化切片上多余的溶液。用移液枪将 ScaleS4 凝胶加入脑切片中，以填满成像腔。随后用镊子将另一块盖玻片盖在上面，再覆盖一张滤纸和一块载玻片。将成像腔室转移至4°C的冰箱中。在玻璃载片上放置金属重物，静置30分钟。孵育结束后，从成像腔室中取出材料，并擦去多余的凝胶。将成像腔室置于60毫米玻璃培养皿中，并使用压敏胶将成像腔室边缘的多个点固定在培养皿上。向培养皿中加入ScaleS4溶液，在20至25摄氏度下以40至60 RPM轻轻振荡一小时。更换新鲜溶液，并用移液器吸头轻轻刮擦凝胶表面以去除表面的气泡。将成像室安装在显微镜载物台上。准备一台配备多浸润物镜的共聚焦激光扫描显微镜，物镜参数为2.5毫米工作距离、16倍放大倍数和0.60数值孔径。打开所有相关成像设备，例如工作站、显微镜、扫描仪、激光器、汞灯，并启动成像软件。将多浸液物镜的校正环设置为1.47。将物镜浸入溶液中，并缓慢接近切片。清除物镜尖端附着的所有气泡。使用落射荧光在透明化组织中寻找感兴趣区域。设置图像采集参数时，首先根据图像大小随位深度增加的特性，确定图像采集的位深度。然后根据发射光谱设置检测波长。设置XY分辨率、扫描速度和针孔大小。同时调整激光功率、检测器放大器增益和偏移，直至获得合适的图像。根据ROI的大小确定拼接范围，确保完整覆盖ROI的全长和全宽。在所有平面上浏览组织，并设置图像栈的起始点和终止点。根据所需的Z轴分辨率设置Z步长。采集图像，并使用图像分析软件进行处理。采用本方案，成功实现了厚度为一毫米的小鼠脑片的光学透明化。PV-FGL小鼠大脑皮层中的EGFP表达显示，组织的荧光信号和结构完整性均得以保留。由折射率不匹配引起的像差导致EGFP阳性神经元的图像亮度和分辨率明显下降。当校正环调整至与该 ScaleS4 溶液匹配时，共聚焦激光扫描显微镜可清晰地观察到这些神经元。对小鼠初级体感皮层中 EGFP 标记的神经元进行三维重建，样品为一毫米厚的脑切片。在更高放大倍数下，可观察到带有树突棘的单个树突分支。在切片中还观察到了轴突末端的分支以及轴突上的突起。成像液体与物镜之间的折射率匹配对于透明化组织中的三维成像至关重要。我们的技术将有助于从神经回路到组分尺度整合神经元结构，从而为神经元机制及大脑信息处理提供深入见解。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

一种从介观尺度到微观尺度的神经元成像组织清除方法

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。...

一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

来源： Pekarek, B. T., et. al., 通过CLARITY组织透明化技术对完整神经元树突进行成像与定量分析。J. Vis. Exp.

完整小鼠脑组织中树突分支及树突棘形态的共聚焦显微成像

为了获得大组织内荧光标记细胞的高分辨率图像，理想情况下应无需切片即可对生物样本进行成像。3DISCO...

通过3DISCO技术在细胞水平上对完整生物系统进行成像

ACT-PRESTO（活性透明技术——基于压力的高效稳定大分子递送至器官）能够实现快速、高效且低成本的组织透明化，并通过被动扩散或压力辅助递送方式，促进抗体快速渗透入透明化组织。利用该方法，可对多种组织进行透明化处理，使用多种抗体进行免疫标记，并实现整体体积成像。...

ACT-PRESTO：用于大体积成像的生物组织透明化与免疫标记方法

本方案描述了通过表达荧光标记物的改良型狂犬病毒进行逆向感染标记后，对特定神经元群体进行的大规模重构，以及独立且无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类之间形态学参数的全面表征。...

基于形态学指标的大规模重建及无偏独立聚类以分类特定神经元群体

我们介绍一种在厚脑切片中使用高尔基-考克斯染色法的实验方案，以实现对具有长树突的神经元进行可视化观察 单个组织样本中包含的树木。本方案还介绍了两种变体，分别涉及焦油紫复染，以及未处理脑组织的冷冻以实现长期保存。...

使用高尔基-考克斯法对厚脑切片中的神经元进行成像

本文介绍一种用于小鼠脑组织透明化、荧光标记及大规模成像的实验流程，该方法可实现新皮层中细胞类型三维空间组织结构的可视化。...

小鼠新皮层细胞组织的大规模三维成像

神经元树突的形态通常与其功能相关。事实上，许多影响神经元发育的疾病过程均表现为形态学表型。本方案描述了一种简单而强大的方法，用于分析完整的树突分支及其相关的树突棘。...

通过CLARITY组织透明技术对完整神经元树突进行成像与定量分析

本方案描述了使用iDISCO+对完整小鼠脑组织进行磁共振成像、透明化处理和免疫标记的方法，随后详细介绍了利用光片显微镜进行成像，以及使用NuMorph进行后续分析的步骤。...

利用MRI、组织透明化和光片显微镜对完整新生小鼠脑进行全脑单细胞成像与分析

本方案提供了一种结合（的逐步操作流程，用于对数十个死后人类脑切片进行快速且同步的光学透明化、多轮标记及三维体积重建SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE])...

大规模人脑成像中用于光片荧光显微镜的光学透明化与标记技术

本研究介绍了一种提取和制备保留荧光信号的透明化全脑与脊髓样本的实验方案，可提高实验效率和数据完整性，从而推动神经科学研究的发展。...

小鼠脑-脊髓样本的提取与组织透明化制备

了解ScaleSF组织透明化技术用于小鼠脑片神经元成像的方法。该技术可在保持荧光信号的同时实现高分辨率三维成像，帮助研究者从神经环路到亚细胞结构深入解析大脑功能机制。

一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

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