微管触觉的自组装
2022年6月23日
本文介绍了一种使用基于植物的微管交联剂MAP65和PEG作为填充剂形成触头形状的微管组件的方案。
该协议能够使用抗并行交联剂MAP65实现微管触觉的自发自组织。该系统可以帮助我们了解微管组织和有丝分裂纺锤体等生物系统。该技术的主要优点是它是一种极简主义的系统，可以为微管重建纺锤状形状，具有高度可重复性，并且可供许多实验室使用。
该方法不仅适用于蜂窝系统，还可以作为中观尺度液晶研究的模型。要制备微管蛋白，首先从零下80摄氏度的冰箱中取出等分试样的含有一毫克冻干微管蛋白的未标记微管蛋白，并将其保存在冰上。然后，加入200微升冷PEM-80。
要溶解所有冻干物，请将管子放在冰上10分钟。接下来，从零下80摄氏度的冰箱中取出一管含有20微克冻干微管蛋白粉末的罗丹明标记的微管蛋白，并将其保存在冰上。然后，加入四微升冷PEM-80，并将管保持在冰上10分钟以溶解所有冻干物。
一旦冻干的微管蛋白溶解，将100微升重悬的未标记的微管蛋白溶液加入到四微升罗丹明标记的微管蛋白溶液中。然后，通过管道非常缓慢地混合六到七次溶液。为了储存剩余的100微升未标记的微管蛋白溶液，首先将管插入液氮中冷冻溶液，然后将管保持在零下80摄氏度以备将来使用。
接下来，通过将微管蛋白混合物分配到七个新管中，在每个管中加入15微升。如前所述，将管子冷冻在液氮中，并将其储存在零下80摄氏度以备将来使用。要组装用于执行实验的流动室，首先，用双蒸馏水清洁载玻片，并用不起毛的实验室湿巾将其干燥。
接下来，首先用乙醇清洁载玻片，然后用双蒸馏水清洗。要创建流路，请切开一块 40 到 50 毫米长的双面胶带。然后，将其分开以创建两条较薄的胶带条，并将两条胶带放在相隔五到八毫米的载玻片上。
接下来，将硅烷化盖玻片放在流动路径的顶部。然后，用笔的背面轻轻按压胶带区域，密封幻灯片和盖子滑落双面胶带条。如果密封性好，胶带应从半透明变为透明。
要移除边缘上多余的胶带，请用剃须刀片切割胶带，距离流室入口仅剩一毫米。然后，用适当的实验参数标记腔室 为了进行触觉实验，首先，将所有必需的试剂解冻在冰上，并在工作期间将它们储存在冰上。接下来，用溶解在PEM-80中的20微升5%非离子嵌段共聚物表面活性剂涂覆流动室，并在腔室的两端滴小滴，以防止内部形成气泡。
然后，将流动室保持在由培养皿制成的潮湿室中，并用湿的无绒实验室擦拭布至少五到七分钟。接下来，将PEM-80，GMPPCPP，普隆氟-127，二硫代三醇，葡萄糖，聚乙二醇，先前制成的微管蛋白混合物混合，并将MAP65与GFP MAP65混合，通过移液五到六次在无菌管中可视化，使管保持在冰上。然后，将一微升葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的预混合溶液加入微管蛋白- MAP混合物管中，并通过管道再次混合七至八次。
将溶液的总体积分成两部分，在单独的腔室中使用。同时，必须通过毛细管作用将先前添加到流动室中的液体除去，方法是在流动室的另一端使用无绒的实验室湿巾，同时将微管蛋白-MAP混合物添加到流动室中。一旦样品完全进入腔室，使用五分钟的环氧树脂密封腔室的两端，并将其保持在37摄氏度约30分钟，以成核并生长微管触觉。
对于通过荧光显微镜对触头进行成像，请使用数值孔径为1.2或更大的物镜，放大倍率为60X或更高，以收集足够的荧光光。使用免费的金属氧化物半导体或电荷耦合设备相机记录图像。为了保持样品，请将其保存在设置为37摄氏度的环境室中。
或者，可以为此目的使用其他级加热器，包括热空气级加热器和带有循环温水的客观温控环。由于适当的激发源对于罗丹明微管蛋白的正确荧光至关重要，因此在样品上使用功率至少为一毫瓦的561纳米激光器以获得高质量的图像。但是，对于GFP MAP65，将激发源更改为488纳米激光器。
如果使用宽视场落射荧光显微镜，则使用罗丹明滤波片立方体，激发波长为540 12.5纳米，二向色性为545纳米截止，截止波长为575纳米。对于 GFP MAP，使用激发为 480 15 纳米、二向色性为 505 纳米 15 纳米的光照度、发射为 515 纳米长通的 GFP 滤波立方体。在确保照明功率和曝光时间使相机的强度标度不饱和后，拍摄至少10张不同区域的图像，以在红色和绿色通道中对100多个触头进行成像，并将其保存为16位TIFF图像以供分析。
使用该协议，可以在显微镜下直接可视化在30分钟内形成微管触觉。触觉在微管蛋白通道中用561纳米激光器和在MAP65通道中用488纳米激光器可见。图像也彼此完美重叠。
在这种方法中，也可以测量触头的长度和宽度。发现触头的强度分布随其宽度而变化。此外，微管触觉的不动性通过光漂白或FRAP实验后的荧光恢复得到证明，在光漂白后没有显示出任何荧光恢复。
另一方面，FRAP实验揭示了MAP65的移动性，在光漂白后可以观察到逐渐恢复和荧光。MAP65的这种荧光恢复可以适应不断上升的指数衰变，以找到恢复的振幅和时间尺度。触觉实验部分应在10至12分钟内完成，因为微管蛋白在冰上会很快变质，这可能不利于触觉体的成核。
未来对不同微管交联蛋白和交联运动蛋白（可以移动微管的酶）的研究将继续揭示有关有丝分裂纺锤体自组织的新信息。
概述
本文介绍了一种使用MAP65（一种植物微管交联剂）和PEG（作为拥挤剂）形成触体形状的微管组件的协议。该方法允许微管触体的自发自组织，为微管组织和生物系统提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物物理学
背景
- 微管是细胞骨架的重要组成部分。
- 理解它们的组织对于洞察细胞过程至关重要。
- 该协议使用了一个最简化的系统来重现纺锤体样形状。
- 它适用于细胞系统和介观液晶研究。
研究目的
- 开发一种重复性的方法来形成微管触体。
- 促进微管组织的研究。
- 为研究生物系统（如有丝分裂纺锤体）提供模型。
使用的方法
- 制备未标记和罗丹明标记的微管蛋白。
- 实验流动室的组装。
- 混合试剂以形成微管触体。
- 使用荧光显微镜对触体进行成像。
主要结果
- 在30分钟内形成的微管触体可以被可视化。
- 触体在红色和绿色荧光通道中都可观察到。
- 该协议允许测量触体的尺寸。
- 图像显示微管蛋白和MAP65的荧光重叠。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来研究微管动力学。
- 它增强了对生物环境中微管组织的理解。
- 该技术对各种研究实验室都是可行的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reconstituting spindle-like microtubule assemblies with minimal components enables precise interrogation of cytoskeletal self-organization, a key challenge in early discovery and mechanistic de-risking. This platform provides a reproducible, quantitative system for studying microtubule dynamics relevant to mitosis and cellular architecture. Such minimalistic, tunable models support predictive confidence in target validation and facilitate translational continuity across discovery and preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic dissection of microtubule organization and spindle assembly.
- Supports functional validation of microtubule-associated proteins and crosslinkers.
- Facilitates hypothesis-driven studies on cytoskeletal dynamics and pathway modulation.
- Provides a controlled system for biological de-risking of mitotic targets.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for microtubule assembly and morphology.
- Enables standardization of fluorescence-based readouts for compound or protein screening.
- Supports scalability and platform reuse for evaluating modulators of cytoskeletal organization.
- Delivers robust, quantitative outputs for cross-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro spindle-like assemblies with disease-relevant mitotic processes.
- Bridges discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of cytoskeletal targets with translational potential.
- Provides a foundation for biomarker development linked to spindle dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This minimalistic assembly system fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling mechanistic studies and assay development for cytoskeletal targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for spindle assembly and microtubule regulation.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging and FRAP-based mobility assays for robust screening workflows.
- Analytics: Delivers dimensional and mobility measurements to compare protein function and assembly conditions.
- Translational Research: Connects in vitro assembly dynamics to mitotic spindle function in disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, accessible platform for cytoskeletal research across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeletal target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable protocols for cross-team adoption.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitotic and cytoskeletal targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biochemistry, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-NA objectives, temperature control, and FRAP-capable imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of reagent preparation and imaging parameters.
- Adaptable to different microtubule crosslinkers and crowding agents for broader model relevance.
- Limited by tubulin stability and time-sensitive assembly steps as noted in the protocol.
