Name: 微管触觉的自组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 了解利用MAP65交联剂和PEG拥挤剂自组装微管类晶簇的方法。该方案可在30分钟内形成纺锤体形结构，为研究微管组织和有丝分裂纺锤体等生物系统提供可重复的体外模型。

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作者谨向2021年夏季所有Ross实验室成员，特别是K. Alice Lindsay，致以诚挚感谢。本研究工作得到了美国国家科学基金会（NSF）资助项目BIO-2134215的支持，该项目资助了S. Sahu、N. Goodbee、H.B. Lee和J.L. Ross。此外，KECK基金会的资助项目（Rae Anderson，南达科他大学，项目负责人）部分支持了R. Branch和P. Chauhan&#160;

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方法已在多篇论文中用于制备微管束状聚集体（图2）22,28。这些实验具有重要的生物学意义，有助于揭示调控大多数细胞类型中分裂期或减数分裂期纺锤体形态与稳定性的组织原理。此外，微管是典型的液晶介晶分子模型，有助于深入理解液晶如何从各向同性相中成核并生长出向列相。
本文所述方法在探索微管自组织方面具有多项优势。首先，该方法具有高度可重复性，已在实验室中由包括高中生在内的多名学生成功操作，即使这些学生在进入实验室前几乎没有任何先验知识或培训。束状相（tactoids）具有双折射性22，因此除了荧光显微镜外，也可通过透射光观察，这使得该方法适用于众多实验室，并可将此实验流程广泛应用于教学目的以及高端科研。最后，该方法为进一步以简化、还原论的方式理解和探究生物系统开辟了途径，使研究者能够明确每个额外条件、蛋白质或添加剂如何影响束状相的自组织行为，甚至最终影响纺锤体的形成。实现更优生物模拟的目标包括活性、流动性以及纤维极性分选等方面。
可能有多种因素影响实验，导致出现意外结果。例如，如果束状相（tactoids）未形成（图2），而是观察到扇形样图案，则表明MAP65很可能不存在或未能与微管结合22,28。这一现象在MAP65荧光通道中也应明显可见，因为GFP-MAP65将不会结合到微管上。
如果 tactoid 未形成，且背景在玻璃上呈现为斑点状，可能是由于表面涂层所致。硅烷化处理一旦完成，其效果在盖玻片上仅能维持1个月。当涂层失效后，微管蛋白将非特异性地结合到暴露的表面，从而产生不规则的结合模式。
如果未形成滴状相（tactoids），且观察到微管蛋白呈现各种形状和大小的聚集体，则可能是由于微管蛋白质量较差所致。可通过离心去除微管蛋白中初始的聚集体，以避免其引发偏离正常通路的聚集，而非微管聚合。如果表面与微管蛋白发生结合，则可能消耗溶液中的微管蛋白。微管蛋白浓度过低，低于微管聚合所需的临界浓度时，也可能导致聚集体的形成。
在FRAP实验中，如果MAP65通道未显示任何恢复信号（图5），则可能是光漂白过程对微管造成了光损伤。光损伤会导致纤维结构的局部破坏。可通过透射光通道进行检查以确认此现象。由于微管束与周围水环境之间存在较高的折射率差异，因此在透射光通道中可观察到微管束的形态。由光照引起的光损伤会在光漂白区域的透射光成像中表现为灼烧痕迹或对比度降低。若出现此情况，必须降低激光或光照强度，以避免对蛋白质造成光损伤。
该实验流程和方法中遇到了若干挑战。其一，目前长度测量需通过手动点击图像完成。这种方法虽然简单直接，但可能导致较大的不确定性。相比之下，利用横截面并拟合高斯函数来测量宽度，是更为准确的尺寸量化方法。类似的方法也可用于长度的测量。第二个问题是，由于液晶滴（tactoids）有时过于细长，可能发生弯曲，这使得长度的量化更加困难。虽然可以使用分段线来测量轮廓长度，但每增加一个线段都会引入额外的不确定性。
从科学角度来看，这种方法作为液晶或纺锤体模型的应用存在一些其他挑战。第一个挑战是微管形成的滴状物（tactoids）具有细长的形态图3 和 图 4）。如先前发表的文献所述22微管束状液晶相是均质的液晶相，不具有双极性。这意味着构成该结构的微管并未重新取向以指向结构的末端。相反，所有微管均平行于长轴排列，且 &#34;极&#34; 位于无穷远处。这与分子液晶、肌动蛋白或DNA等同样可作为液晶介晶的体系中所观察到的纺锤体结构截然不同。在这些其他体系中，纺锤体呈双极结构，当在正交偏振镜下观察时，会显示出棒状结构重排的典型特征。
该系统中的第二个主要挑战是微管在束状相（tactoid）内部无法移动。荧光漂白后恢复（FRAP）实验及分析结果表明，微管的恢复程度极低。这种类固态特性使得微管束状相作为大规模液晶类似物的价值降低。液晶的向列相应同时具备液体（流动性）和晶体（有序性）的特性。尽管该结构在形态上与纺锤体相似，但其缺乏流动性使得其作为有丝分裂纺锤体模型的吸引力下降。另一方面，这一问题也为研究如何改进实验条件以在系统中引入更高流动性提供了机会。
这些科学挑战带来了令人兴奋的机遇，有助于我们获得关于该系统的新知识。为了使微管束状体更具双极性，可以使用更短的微管。然而，这存在额外的挑战，因为与肌动蛋白不同，微管缺乏大量特征明确的端帽蛋白来调控其长度。通过成核与生长方式制备短微管时，需要使用非常高浓度的微管蛋白（tubulin）和GMPCPP。高浓度的微管蛋白会导致系统中纤维数量增加，从而使微管束状体之间的分离更加困难。引入新的微管端帽蛋白（如DARPin33）可能有助于缓解这一问题。第二个问题是微管的不可移动性，这可以通过添加运动蛋白来缓解，例如在有丝分裂中起作用的运动蛋白四聚体kinesin-534。或者，也可使用人工构建的二聚体kinesin-1二聚体15。
另一种增加流动性的方法是允许微管表现出其动态不稳定性，即微管的生长与缩短。目前，以稳定的GMPCPP纤维作为种子并随后发生动态不稳定的微管，其长度远超形成纺锤体或液晶滴状结构（tactoid）所需的理想长度，从而会形成类似扇形或束状的极长结构。因此，引入微管动态不稳定性时必须谨慎操作，以维持液晶滴的形态。添加能够调控微管长度的相关蛋白和酶可能有助于缓解这一问题。例如，可能需要引入解聚型驱动蛋白（如kinesin-1335）或剪切酶（如katanin36）。这些实验复杂且具有挑战性，但无论结果如何，都将提供极具价值的见解。无论未来实验朝哪个方向发展，本文所建立的微管液晶滴构建平台都将有助于揭示微管组织的物理基础新信息。

通过有丝分裂进行的细胞分裂是维持生命最重要的生物学过程之一。由微管蛋白二聚体组成的微管丝是该过程的关键结构元件。在中期，当染色体排列于细胞中央时，会形成一种短暂的结构，因其形状类似于织布机上缠绕着丝线的纺锤而被称为有丝分裂纺锤体（图1A）。已有大量研究证实，在多种生物体中，微管在中期用于推动和拉动凝缩的染色体至细胞中央，使其排列整齐，并与将在后期将染色体拉开的微管连接（图1B，C）。纺锤体在减数分裂（图1B）和有丝分裂（图1C）中均会形成，其结构由大量相互重叠的微管构成，这些微管并非像缠线一样围绕中心轴缠绕，而是平行于界面排列。这些基于微管的结构的形成需要相关蛋白进行交联，以及具有马达功能的相关酶来协助推动和拉动染色体1。
对减数分裂纺锤体的研究表明，微管较短、具有动态性，并以交联阵列的形式相互重叠2,3,4,5,6（图1Di）。由于这些短微管在物理结构上的排列方式，减数分裂纺锤体在性质上类似于液晶 tactoid（图1E）。事实上，纺锤体已被证实能够发生融合与合并，这与液晶 tactoid 的行为一致5。
自20世纪60年代以来，许多研究采用固定、连续切片和电子显微镜技术确定有丝分裂纺锤体内部存在两种微管类型7,8,9,10。第一种称为动粒微管，连接纺锤体极与动粒。第二种称为极间微管或极微管，其延伸超过染色体并在中区重叠（图1Dii）8,9,10。第三种称为星体微管，位于纺锤体外部，连接两极与细胞边缘；这些微管结构不在本讨论范围之内。近期研究发现，augmin6与γ-微管蛋白环复合物之间的相互作用影响微管成核中心，导致形成如图1D所示的较短微管的有丝分裂纺锤体&#160;。
由于微管的长度远大于其宽度，具有高长径比和高刚性，因此它们类似于放大版的液晶分子。在软物质物理学中，原子和分子可通过简化的相互作用来近似描述，从而推导出相变的物理机制，包括成核过程以及晶体的熔化11。&#160;类似地，微管是介观尺度的物体，可视为放大版的液晶分子，有助于揭示液晶动力学的物理规律，包括从各向同性相中形成向列相的成核与生长过程。此外，如上所述，减数分裂纺锤体表现出类似于液晶滴晶（tactoid）的特性，即一种从液晶分子的各向同性状态中成核并生长的向列态3,4,5。对于滴晶而言，其成核与生长过程与其他晶体类似（即需要相对较高浓度的介晶分子［mesogen，指形成液晶的分子］）。滴晶独特的&#34;纺锤体&#34;形状源于液晶介晶分子的局部排列，这些分子排列形成向列相（图1E）。它们无法形成圆形晶体，因为分子结构高度不对称。鉴于微管的这种特性，由局部高浓度微管构成的有丝分裂纺锤体结构也呈现相同形状也就不足为奇了，无论称之为滴晶还是纺锤体。滴晶可以是双极的，其两极位于锥形末端（图1Ei），也可以是均匀的，其两极实际上位于无穷远处（图1Eii）。
鉴于纺锤体形成的重要性，人们一直在致力于实现自组织的纺锤体形成 体外 通过离子种类介导的微管凝聚成束现象的演示12,13，产生排阻相互作用的拥挤剂14,15，以及特异性的微管交联蛋白13,16,17,18,19,21令人惊讶的是，尽管这些试剂都能提高微管的局部浓度，但它们通常形成的是长的微管束，而非纺锤体样结构（tactoids）。这些微管束之所以较长，一个可能的原因是构成它们的微管本身较长。最近使用较短微管的研究也报道了形成长微管束，且这些微管束末端不呈锥形15；在这种情况下，束状结构由驱动蛋白等马达蛋白连接在一起，这些蛋白可促使束状结构延伸，从而使其变长。如本文所述，形成锥形、纺锤体样结构则需要较短的微管以及非延伸性交联蛋白。
最近，我们开发了一种技术，可在存在成核稳定微管的条件下，利用反向平行交联蛋白MAP65来形成微管束状结构（tactoids）22。实验所需的微管必须较短，但目前已知的微管长度调控因子中，能够阻止微管动态不稳定或末端-末端融合的因子较少。因此，我们采用GMPCPP在微管生长后对其进行成核和稳定化处理，从而能够形成高密度的短微管，这些微管可自组织为束状结构。在双折射显微镜下观察，这些束状结构表现出均一性。除了使用短微管外，还采用了特定的反向平行交联蛋白MAP65来促进束状结构的形成（图2）。MAP65是一种属于PRC1/Ase1家族的植物微管相关蛋白，该家族为有丝分裂过程中介导微管交联的蛋白家族23。MAP65以二聚体形式存在，具有强烈的自身结合能力以及与微管结合的能力24。与肌动蛋白丝所形成的减数分裂纺锤体和束状结构25,26,27（具有双极性并表现出类似液晶的液态特性）不同，微管束状结构被观察到具有类固态特性22,28。
本文介绍了微管束状体的制备方法，并利用基于荧光的技术对组装体的形态及组分的流动性进行表征。

<table><tbody><tr><td>2% 二氯二甲基硅烷</td><td>GE Healthcare</td><td>118945</td><td>一种疏水性硅烷表面处理剂。可重复使用最多三次，并在室温下保存一年。</td></tr><tr><td>5分钟环氧树脂</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>用于密封实验腔室</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr><tr><td>BL21 感受态细胞</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>用于表达 MAP65 的感受态细菌细胞</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>氧气清除系统的一部分。用 ddH₂O 配制 300 mg/ml 的储存液，分装成 10 &amp;mu;l 等份，在 -20&amp;deg;C 保存最多一年。</td></tr><tr><td>盖玻片（22 mm × 22 mm 或 22 mm × 30 mm）</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>用于实验腔室</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>一种小分子，用于断裂二硫键并清除氧气。将粉末（Sigma）溶于 ddH₂O 配制成 1 M 储存液。溶液分装后于 -20°C 保存最多一年。每份分装液可使用 7–8 次，之后弃用。</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>微管蛋白缓冲液基础成分</td></tr><tr><td>Eppendorf 0.5 ml 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>用于盛放实验溶液</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>用于清洁以及将溶液抽吸通过实验腔室</td></tr><tr><td>配备高数值孔径物镜的荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 共聚焦</td><td>用于成像实验</td></tr><tr><td>-20&amp;deg;C 冰箱</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>用于储存试剂</td></tr><tr><td>-80&amp;deg;C 超低温冰箱</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>用于储存蛋白质。</td></tr><tr><td>用于硅烷化的玻璃容器</td><td>Michaels</td><td></td><td>用于制备实验腔室——处理盖玻片</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher</td><td>12544-4</td><td>用于实验腔室</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td>氧气清除系统的一部分。用 ddH₂O 配制 300 mg/ml 储存液，分装成 10 &amp;mu;l 等份，在 -20&amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>氧气清除系统的一部分。该试剂在 4&amp;deg;C 保存最多一年。</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>一种水解缓慢的 GTP 类似物，通过降低微管的动态不稳定性以及自发成核的临界浓度，用于聚合并稳定微管，从而获得长度一致的微管。我们从 Jena Biosciences 购买 10 mM 储存液，并在 -20&amp;deg;C 保存最多一年。</td></tr><tr><td>显微镜加热装置</td><td>Okolab stage top incubator</td><td></td><td>用于成像实验</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>用于从镍珠中洗脱 MAP65 蛋白以纯化 MAP65</td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>用于清洁以及将溶液抽吸通过实验腔室。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>用 ddH₂O 配制成 1 M 溶液，现配现用，以防止随时间推移发生酸化。</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Airgas</td><td>NI 230LT22</td><td>用于快速冷冻分装样品。也可用于储存（不推荐）</td></tr><tr><td>MAP65 蛋白</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>一种分子量为 65 kD 的微管相关蛋白（MAP），具有反向平行微管交联功能。我们已从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中纯化出未标记和 GFP 标记的 MAP65-1 蛋白。将 GFP-MAP65 与未标记 MAP65 混合，使标记蛋白占比为 10%。工作液浓度为 10.8 &amp;mu;M。该工作液在 4&amp;deg;C 保存，每周新鲜配制。MAP65 和 GFP-MAP65 的纯化方案详见我们之前的方法章节（26）。</td></tr><tr><td>MgSO₄</td><td>Sigma</td><td>MKCJ940</td><td>微管蛋白缓冲液成分</td></tr><tr><td>NTA-镍珠</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>用于纯化 6xHis 标签 MAP65 蛋白的珠状介质</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>Nikon</td><td></td><td>405 nm 激光系统，可将激光聚焦于任意设定形状的兴趣区域</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>中性微管蛋白聚合基础缓冲液，由 80 mM K-PIPES（pH 6.8）、1 mM MgSO₄、1 mM EGTA 配制而成，在 4&amp;deg;C 保存最多一年。</td></tr><tr><td>永久性双面胶带</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>用于实验腔室</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>用于湿室</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>微管蛋白缓冲液基础成分</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>一种嵌段共聚物，两端为亲水性聚环氧乙烷（PEO）嵌段，中间为疏水性聚苯乙烯氧化物（PPO）嵌段，我们用其作为疏水性表面涂层以防止蛋白质结合到表面。Pluronic-F127 以粉末形式购自 Sigma，溶于 ddH₂O 配制成 5%（w/v）溶液，过夜溶解。溶解后可在室温下保存最多一年。</td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>一种拥挤剂，用于产生排阻力，促使束状体向表面聚集并帮助微管有序排列。我们用 PEM80 配制 5%（w/v）的 100 kDa PEG 溶液。该溶液在 4&amp;deg;C 保存最多一年，使用前置于摇床上混匀。该溶液黏稠，建议使用正向置换移液器操作。</td></tr><tr><td>正向置换移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于移取黏稠液体</td></tr><tr><td>盖玻片架</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72240</td><td>用于制备实验腔室——处理盖玻片</td></tr><tr><td>4&amp;deg;C 冰箱</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>用于储存试剂</td></tr><tr><td>标记微管蛋白</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL590M</td><td>购自 Cytoskeleton 的冻干罗丹明标记猪脑微管蛋白，储存于 -80&amp;deg;C，使用时用 PEM80 水化，水化后可使用最多一年。</td></tr><tr><td>微管蛋白</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td>购自 Cytoskeleton 的冻干猪脑微管蛋白（99% 纯度，未标记），储存于 -80&amp;deg;C，使用时用 PEM80 水化，水化后可使用最多一年。</td></tr><tr><td>紫外-臭氧清洗仪</td><td>Jelight</td><td>Model 342</td><td>用于制备实验腔室——处理盖玻片</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td><td>用于时间序列数据配准以消除漂移的插件</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td><td>用于时间序列数据配准以消除漂移的插件</td></tr></tbody></table>

微管束状聚集体的自组装

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

细胞骨架负责细胞内主要的结构组织与重构，所有这些过程均无需管理者来指导变化。这种情况在有丝分裂或减数分裂期间尤为明显，此时微管在细胞分裂过程中形成纺锤体。纺锤体是细胞分裂期间用于分离遗传物质的机械结构。为实现纺锤体的自组织构建 体外我们最近开发了一种技术，仅使用最少数量的微管相关蛋白和拥挤剂即可将微管重构为纺锤体样结构。具体而言，我们使用了MAP65，这是一种来源于植物的反向平行微管交联蛋白，与酵母中的Ase1及哺乳动物中的PRC1为同源蛋白。该交联蛋白可使微管自组织形成细长的、类似纺锤体的微管自组装结构。这些组装结构也类似于液晶滴状相（tactoids），表明微管可作为介观尺度的介晶分子（mesogens）。本文提供了构建此类微管滴状结构的实验方案，以及利用荧光显微镜表征组装体形态、通过光漂白后荧光恢复技术检测其组分分子运动性的方法。

仅需少量组分，即微管蛋白二聚体和微管交联蛋白，即可形成微管束状结构（tactoids）图2A）。尽管本方案描述的是在培养箱中孵育以成核并生长微管，但微管的成核与生长过程也可直接在显微镜下观察（通常在30分钟内完成）（图2B）。微管蛋白的浓度保持恒定 13.6 µm 以及10%的MAP65-MT结合。
图4展示了成功的实验数据。在微管蛋白通道（使用561 nm激光）和MAP65通道（使用488 nm激光）中均应可见层状小体（tactoids），且两者完美重叠（图4A）。该系统的一个未解之谜是，层状小体的宽度在多种实验条件变化下似乎保持不变，包括微管长度、MAP65浓度以及拥挤剂的改变（图4B）22,28。相比之下，其长度则表现出更大的可变性，并依赖于微管长度和MAP65浓度（图4B）22,28。
在进行荧光漂白后恢复（FRAP）实验时，观察到MAP65信号能够恢复，但微管信号并未恢复（图5）。FRAP中的信号恢复源于标记并经光漂白的分子的运动性和移动性。对于MAP65而言，被漂白的分子从微管上解离并移开，同时新的分子进入该区域（图5）。MAP65的结合处于动态平衡状态，因此结合与解离的速率相等（以每秒分子数为单位）。而对于微管，未观察到信号恢复，表明微管无法离开类晶结构（图5A、Bi、C）。此外，未观察到漂白区域的扩散现象，提示微管在局部位置上是不移动的，且在类晶结构内部并不表现为流体状态。
<img alt="有中期纺锤体示意图、微管、染色体和显微镜图像的细胞分裂过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：纺锤体形成的多种模型。 有丝分裂纺锤体是由微管及其相关蛋白和酶构成的复合结构，在细胞分裂过程中负责将染色体排列并分配到两个子细胞中。(A) 荷兰制造的中世纪早期纺锤车复制品图像，带有细纱线。该图改编自 Peter van der Sluijs 修改的维基媒体图像30。(B) 野生型减数分裂 II 不同阶段微管的三维重建。微管以绿色显示，染色体以灰色显示。比例尺 = 1 µm。该图改编自 Lantzsch 等人31。(C) 分裂中 Sf9 细胞有丝分裂纺锤体内微管的显微图像。纺锤体极和纺锤体微管用绿色荧光蛋白标记。比例尺 = 5 µm。该图改编自 Advani 等人32。(D) 有丝分裂和减数分裂纺锤体微管组织的多种模型。(i) 此前在非洲爪蟾卵提取物形成的减数分裂纺锤体中观察到，微管（绿色）在整个纺锤体中较短且具有动态性。这类似于液晶中双极纺锤状结构的组织方式。(ii) 有丝分裂纺锤体内微管组织的经典模型包含两种微管：在染色体周围中区交联的极间微管或极微管（深绿色），以及成束并从纺锤极延伸至着丝粒的动粒微管（浅绿色），通过推拉作用移动染色体。在所有图像中，染色体以半透明蓝色显示，纺锤体极以深绿色表示。(E) 液晶纺锤状结构中(i)双极和(ii)均质纺锤体中的介晶分子（绿色线条）示意图。双极纺锤体在末端具有两个极，介晶分子重新取向并指向这两个极；均质纺锤体的极位于无穷远处，介晶分子沿纺锤体长度方向不发生取向变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="向列相液滴形成示意图，微管在MAP65作用下的组装，时间推移序列，比例尺为5μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：微管凝聚。（A）微管可通过多种方式被束化和交联，包括离子种类、拥挤剂引起的耗竭力以及特异性微管交联蛋白（如MAP65）。（i）将微管蛋白二聚体与MAP65蛋白混合，以启动微管的成核与生长。（ii）微管从微管蛋白中成核并延伸，MAP65立即结合到微管、另一个MAP65单体或两者之上，从而引发束化。（iii）在交联形成的束内，微管继续成核并生长。（iv）最终结构为类似纺锤体的微管向列相液滴。（B）微管向列相液滴在105分钟内成核并生长的时间序列图像。比例尺 = 5 µm。该图改编自Edozie等人的研究22。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流动室示意图；样品流动方向，包含硅烷化盖玻片、载玻片和双面胶带。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：流动室组装示意图。 流动室由载玻片、硅烷化盖玻片和永久性双面胶带制成。黄色高亮区域为样品流动和观察的通道。流动室的体积约为 20 µL。为了防止在数小时的长时间成像过程中样品蒸发，使用环氧树脂密封流动室的两端。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="束状体分析：微管成像，MAP65通道，长度定量，高斯拟合图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：束状体图像及其长度与宽度分析。（A）按前述方法形成并使用转盘共聚焦显微镜成像的束状体示例数据，显示（i）微管通道成像，采用561 nm激光对罗丹明标记的微管蛋白进行成像；（ii）GFP-MAP65通道成像，采用488 nm激光对GFP进行成像；以及（iii）微管通道（品红色）与GFP-MAP65通道（青色）的合并叠加图像。重叠区域显示为白色，表明微管与MAP65完全共定位。所有图像的标尺 = 10 µm（A）。 （B）束状体长度与宽度的定量分析。（i）待分析束状体的无标注图像。标尺 = 5 µm。（ii）与（i）相同的图像，其中标注了长度（带线端的实线）和宽度（虚线）的测量方式。标尺 = 5 µm。（iii）通过在（ii）中标记的垂直平分线（虚线）上获取束状体的强度分布来测量宽度。该强度分布通过高斯函数拟合，以获得束状体的振幅和宽度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="FRAP 分析：微管和 MAP65 时间序列、强度图、恢复比较、荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：典型的 FRAP 数据与分析。 （A）显微镜时间序列数据，包括（i）微管束状结构、（ii）GFP-MAP65，以及（iii）双通道叠加图像，其中微管显示为品红色，GFP-MAP65 显示为青色；在 63 秒时进行光漂白，并继续观察 5 分钟。（B）漂白区域内（i）微管通道（品红色圆圈）和背景（深灰色圆圈）以及（ii）GFP-MAP65 通道（青色方块）和背景（深灰色方块）的定量强度。（C）数据经背景噪声校正，并对微管通道（品红色圆圈）和 GFP-MAP65 通道（青色方块）进行重新标度。微管信号未恢复，而 GFP-MAP65 信号出现恢复，可拟合为上升指数衰减曲线（深灰色线），以确定恢复的幅度和时间尺度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种使用植物微管交联蛋白MAP65和聚乙二醇（PEG）作为拥挤剂，形成类 tactoid 形状微管组装体的实验方案。

细胞骨架负责细胞内主要的结构组织与重构，而整个过程无需管理者来指挥变化。这是……

本方案利用反向平行交联蛋白MAP65，实现了微管束状结构的自发自组织。该系统有助于我们理解微管的组织机制以及有丝分裂纺锤体等生物系统。该技术的主要优势在于，它是一个简约的体系，能够高度可重复地重建出类似纺锤体的微管结构，并且易于被众多实验室采用。该方法不仅适用于细胞体系，还可作为介观尺度液晶研究的模型。制备微管蛋白时，首先从零下80摄氏度的冰箱中取出一份含有1毫克冻干微管蛋白的未标记微管蛋白分装样品，置于冰上保存。然后加入200微升冷的PEM-80缓冲液。为了完全溶解冻干粉，将离心管置于冰上10分钟。接着，从-80摄氏度冰箱中取出一支含有20微克冻干微管蛋白粉末的罗丹明标记微管蛋白管，置于冰上。然后加入4微升预冷的PEM-80缓冲液，将离心管继续在冰上放置10分钟，以确保冻干粉完全溶解。待冻干的微管蛋白完全溶解后，将100微升重悬的未标记微管蛋白溶液加入4微升罗丹明标记的微管蛋白溶液中。然后，缓慢吹吸混合6至7次。对于剩余的100微升未标记微管蛋白溶液，首先将离心管插入液氮中速冻，随后于-80°C保存以备后续使用。接下来，将微管蛋白混合液分装到七个新离心管中，每管加入15微升。按照之前的方法用液氮速冻，并于-80摄氏度保存，以备后续使用。为进行实验而组装流动池时，首先用双蒸水清洗载玻片，再用无尘实验室擦拭纸擦干。接下来，先用乙醇清洁载玻片，再用双蒸水清洗。为形成流动通道，剪取一段40至50毫米长的双面胶带，然后从中间撕开，得到两条较薄的胶带条，将这两条胶带条平行放置在载玻片上，间距为5至8毫米。接下来，将硅烷化盖玻片置于流路之上。然后，用笔的尾部轻轻按压双面胶带区域，以密封载玻片和盖玻片。若密封良好，胶带应从半透明变为透明。为去除边缘多余的胶带，使用剃刀片沿流动室入口边缘切割胶带，仅保留入口处一毫米的胶带。随后，用适当的实验参数标记该腔室。进行 tactoid 实验时，首先将所有必要的试剂在冰上解冻，并在操作过程中始终置于冰上保存。接下来，在流动室两端分别加入少量 20 微升含 5% 非离子型嵌段共聚物表面活性剂的 PEM-80 溶液，以对流动室进行包被，注意避免腔室内产生气泡。然后，将流动池置于由培养皿和湿润的无绒实验室擦拭布制成的湿室中，孵育至少5到7分钟。接下来，在冰上将PEM-80、GMPPCPP、Pluronic F-127、二硫苏糖醇、葡萄糖、聚乙二醇、先前制备的微管蛋白混合物以及用于可视化的GFP标记MAP65，在无菌离心管中用移液器吹打5至6次进行混合。随后，向微管蛋白-MAP混合液管中加入1 µL预先混合的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶溶液，并再次吹打7至8次混匀。将溶液的总体积分成两份，分别用于不同的腔室。同时，通过在腔室另一端使用无绒实验室擦拭纸，利用毛细作用去除先前加入流动腔室的液体，并向流动腔室中加入微管蛋白-MAP混合物。待样品完全进入腔室后，用五分钟环氧树脂密封腔室两端，并在37°C下放置约30分钟，以促进微管束状体的成核与生长。为通过荧光显微镜对焦滴相进行成像，应使用数值孔径为1.2或更高的60倍及以上放大倍数的物镜，以收集足够的荧光信号。使用互补金属氧化物半导体或电荷耦合器件相机记录图像。为维持样品状态，需将其置于设定为37°C的环境培养箱中。此外，也可使用其他类型的载物台加热装置，包括热空气载物台加热器以及通过循环温水控制物镜温度的温控套环，以实现相同目的。由于合适的激发光源对于罗丹明标记的微管蛋白产生正确荧光至关重要，因此应使用波长为561纳米、在样品处功率至少为1毫瓦的激光器，以获得高质量图像。然而，对于GFP标记的MAP65蛋白，则需将激发光源更换为波长488纳米的激光器。若使用宽场落射荧光显微镜，则采用罗丹明滤光片组，其激发光波长为540 ± 12.5 纳米，二向色镜截止波长为545 纳米，发射光为575 纳米长通滤光片。对于GFP标记的MAP，使用GFP滤光片组，激发光波长为480 ± 15 纳米，二向色镜截止波长为505 纳米，发射光为515 纳米长通滤光片。在确保照明功率和曝光时间设置适当，使相机的强度量程未达到饱和后，分别在红色和绿色通道中采集至少10个不同区域的图像，以覆盖超过100个 tactoid，并将图像保存为16位TIFF格式用于后续分析。采用本方案，可在30分钟内完成形成的微管束状体可直接在显微镜下观察。在微管蛋白通道中使用561纳米激光、在MAP65通道中使用488纳米激光均可观察到束状体，且两者的图像完全重叠。在此方法中，也可测量纺锤体的长度和宽度。研究发现，纺锤体的强度分布随其宽度而变化。此外，通过光漂白后荧光恢复（FRAP）实验，证明了微管纺锤体的不可移动性，光漂白后未观察到任何荧光恢复现象。另一方面，FRAP 实验揭示了 MAP65 具有可移动的特性，在光漂白后可观察到其荧光逐渐恢复。MAP65 的这种荧光恢复过程可通过上升指数衰减曲线拟合，以确定恢复的幅度和时间尺度。成束实验部分应在 10 至 12 分钟内完成，因为微管蛋白在冰上会迅速降解，这将不利于成束结构的成核。未来对不同的微管交联蛋白以及能够移动微管的交联马达蛋白（具有酶活性）的研究，将继续揭示有丝分裂纺锤体自组织的新信息。

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

微管触觉的自组装

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本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法测量果蝇透化胸段耗氧量的方法。与传统的线粒体分离技术相比，该技术所需组织量极少，且获得的结果更具生理相关性。...

利用少量组织测量果蝇透化肌纤维的线粒体耗氧量

本文介绍了一种利用生物素对小鼠肾小球细胞表面蛋白进行体内标记的实验方案。该方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白内源性免疫沉淀的操作方法。...

肾小球的分离与 体内 肾小球细胞表面蛋白标记

我们描述了通过X射线晶体学测定NEMO蛋白IKK结合域结构的实验方案。该方法包括蛋白质的表达、纯化与表征，以及获得其无配体结合形式蛋白质高质量晶体并完成结构解析的策略。...

NEMO 的 IKK 结合结构域的制备、结晶与结构测定

了解利用MAP65交联剂和PEG拥挤剂自组装微管类晶簇的方法。该方案可在30分钟内形成纺锤体形结构，为研究微管组织和有丝分裂纺锤体等生物系统提供可重复的体外模型。

微管束状聚集体的自组装

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