Name: 慢病毒介导的shRNA递送到hESC和NPC，使用低成本阳离子聚合物聚乙亚胺（PEI） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学习使用低成本阳离子聚合物聚乙亚胺（PEI）制备慢病毒颗粒，实现shRNA在人胚胎干细胞和神经祖细胞中的高效递送。该方法为基因治疗和再生医学研究提供经济可行的技术方案。

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本研究得到了阿拉伯联合酋长国大学（UAEU）研究基金的资助，项目编号为 #31R170（扎耶德健康科学中心）和 #12R010（UAEU-AUA 基金）。我们感谢兰德尔·摩尔斯教授（Randall Morse，纽约奥尔巴尼沃兹沃思中心）在文稿的语言风格和语法修改方面提供的帮助。
所有数据均可根据要求提供。

1. 使用PEI或Lipofectamine 3000试剂转染HEK293T细胞
<ol>
	<li>将HEK293T细胞培养于含10% FBS和1×青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37 °C、5% CO2和21% O2的湿化培养箱中，直至细胞融合度达到90%时进行转染接种。为获得高滴度病毒，应使用较低传代次数的细胞（理想情况下低于P30）。</li>
	<li>在100 mm组织培养皿中加入10 mL完全生长培养基，接种4 × 106个细胞，并在含5% CO2和21% O2的湿化组织培养箱中过夜培养。</li>
	<li>每项转染实验中，将质粒DNA（1 mg/mL储备液）用1 mL无血清DMEM培养基稀释至1.5 mL离心管中，按以下比例加入进入载体和包装质粒： 
	进入载体 = 10 µg 
	psPAX2.0 = 7.5 µg 
	pMD2.G = 5 µg</li>
	<li>涡旋振荡10秒，然后在室温下以10,000 × g离心30秒以收集液体。</li>
	<li>向管中加入70 µL（1 mg/mL储备液）PEI，按上述方法短暂涡旋并离心收集。所用PEI体积基于总DNA（µg）与PEI（µg）1:3的比例。</li>
	<li>对于基于脂质体转染试剂（lipofectamine）的转染，将上述载体用500 µL无血清DMEM培养基稀释，并加入试剂盒提供的45 µL试剂P，室温孵育5分钟。</li>
	<li>用500 µL无血清DMEM培养基稀释试剂盒提供的70 µL试剂L，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将两管内容物混合，室温孵育20分钟，以形成复合物。</li>
	<li>将1 mL DNA/PEI或1 mL DNA/脂质体复合物逐滴加入含细胞的培养皿中，在37 °C、5% CO2和21% O2的湿化培养箱中孵育6小时。</li>
	<li>6小时后，更换为新鲜完全生长培养基（10 mL），并将细胞放回含5% CO2和21% O2的湿化培养箱中继续培养。</li>
</ol>
2. LVS 的收集与超速离心
<ol>
	<li>转染后第2天，收集含病毒的培养基，并再次用10 mL新鲜的完全生长培养基覆盖细胞。</li>
	<li>转染后第3天，收集含病毒的培养基，并将其与第2天收集的含病毒培养基混合。</li>
	<li>将病毒上清液在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟，沉淀细胞碎片。</li>
	<li>使用孔径为0.45 µm的低蛋白结合滤膜（PES或SFCA材质）过滤上清液，并于4 °C保存至进行超速离心。含有慢病毒颗粒的滤过上清液可在4 °C保存5天，病毒滴度无明显下降。</li>
	<li>用70%乙醇清洗超速离心管套管10分钟，晾干，盖紧，并于4 °C保存。</li>
	<li>将36 mL含有慢病毒颗粒的滤过培养基加入无菌的超速离心管中。</li>
	<li>用无菌移液条吸取4 mL无菌的20%蔗糖溶液（用PBS配制），加入5 mL无菌移液条中，并将其准确排至含有慢病毒的超速离心管（UC）底部。注意蔗糖溶液不应与培养基混合，需在管底形成梯度。</li>
	<li>使用无血清DMEM培养基平衡所有超速离心管，放入预冷的超速离心管套管中，盖紧管盖。</li>
	<li>在4 °C条件下以125,000 × g离心2小时。</li>
	<li>离心结束后，将管内容物倒置于含漂白剂的容器中，小心弃去上清液，避免扰动沉淀物。若可见沉淀，可做标记。</li>
	<li>将超速离心管置于一个50 mL无菌离心管中，并在沉淀物顶部精确加入200 µL无菌DPBS。于4 °C静置过夜。</li>
	<li>次日，通过移液枪轻柔吹打40次进行混匀。</li>
	<li>在台式离心机中以13,000 × g短暂离心，以沉淀任何残留碎片。</li>
	<li>将上清液转移至新管中，并将病毒原液分装为每份20 µL。于−80 °C保存。</li>
	<li>留出5 µL用于病毒滴度测定。</li>
</ol>
3. 基于pLKO.1载体的LVS滴度测定
<ol>
	<li>根据制造商的建议，使用qPCR测定慢病毒颗粒的滴度。</li>
	<li>为建立标准曲线，将试剂盒中提供的标准对照DNA进行5次10倍连续稀释：每次取5 µL DNA加入45 µL无核酸酶的H2O中。使用1:100至1:100,000的稀释度生成标准曲线。</li>
	<li>在冰上以复孔方式设置反应体系，如下所示： 
	2x qPCR预混液&#160; &#160; &#160; &#160; 10 µL 
	引物混合液&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; 2 µL 
	样品或标准DNA&#160; &#160;2 µL 
	无核酸酶H2O&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; 6 µL</li>
	<li>按照试剂盒说明书中的循环条件进行qPCR，共35个循环。</li>
	<li>以循环阈值（Ct）为Y轴，病毒滴度为X轴作图。</li>
	<li>利用四个标准对照DNA稀释样本（1:100至1:100,000）生成对数回归曲线，并通过趋势线方程计算未知病毒样品的滴度。</li>
</ol>
4. 基于pll3.7载体的LVS滴度测定
<ol>
	<li>在感染前24小时，将1 × 105个HEK293T细胞接种至12孔板的每个孔中，每孔加入1 mL完全培养基。</li>
	<li>在培养基中添加8 µg/mL聚凝胺，并将1 mL该培养基加入每个无菌的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>分别取4 µL、2 µL、1 µL、0.5 µL和0.1 µL浓缩的慢病毒颗粒，加入含8 µg/mL聚凝胺的1 mL培养基中进行稀释。</li>
	<li>将HEK293T细胞的培养基更换为含有指定体积慢病毒颗粒及8 µg/mL聚凝胺的培养基，于37 °C、含5% CO2和21% O2的湿润培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>次日，更换为新鲜培养基，并继续在37 °C、含5% CO2和21% O2的湿润培养箱中培养72小时。</li>
	<li>72小时后，用PBS洗涤细胞，按照生产商说明书在37 °C进行胰酶消化，并重悬于1 mL PBS中。</li>
	<li>使用流式细胞分选仪进行FACS细胞分选，遵循生产商推荐的操作步骤。以未感染的HEK293T细胞设定门控为0% GFP阳性细胞，每份样品计数50,000个事件，以确定各病毒稀释度下的阳性细胞百分比。</li>
	<li>仅选用产生2%–20% GFP阳性细胞的慢病毒颗粒体积，用于计算慢病毒颗粒的滴度。</li>
</ol>
5. hESC 的感染与稳定筛选
<ol>
	<li>用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 6 孔细胞培养板中每个孔内生长的细胞。</li>
	<li>加入 1 mL 1× 细胞解离试剂，于 37 °C 孵育 5 分钟，使细胞从培养板上脱离。</li>
	<li>用 DMEM/F12 培养基收集细胞，并在室温下以 1,500 × g 离心 5 分钟，以收集细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清，将细胞重悬于 1 mL 培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>用含 mTeSR1 的完全生长培养基制备细胞悬液，终浓度为 2 × 105 个细胞/mL，培养基中需补充 10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、青霉素/链霉素（P/S）和 10 µM ROCK 抑制剂（RI）。</li>
	<li>在 50 倍稀释的完全基底膜基质包被的 P24 孔板中，每孔加入 500 µL 完全生长培养基，接种 1 × 105 个细胞，并将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 和 21% O2 的湿润化培养箱中进行培养。</li>
	<li>次日，以感染复数（MOI）为 10 的病毒感染人胚胎干细胞（hESCs），同时加入 8 µg/mL 多聚素（polybrene），于 37 °C 孵育 8 小时。</li>
	<li>8 小时后，弃去含病毒的培养基，更换为新鲜生长培养基（不含 RI），继续培养至细胞融合度达到 90%。</li>
	<li>当细胞融合度达到 90% 时（通常为感染后 48–72 小时），开始使用嘌呤霉素进行筛选，浓度为 0.8 µg/mL。</li>
	<li>筛选完成后（通常为 4–6 天），将稳定转染的细胞按 1:4 比例传代，并扩增细胞用于冻存及后续分析。</li>
</ol>
6. H9 来源的神经前体细胞（NPCs）的转导
注意：NPCs 采用双 Smad 抑制方案由 H9 细胞衍生而来，具体方法如先前所述19。
<ol>
	<li>简而言之，将 H9 细胞用细胞解离试剂在 37 °C 下处理 5 分钟，以获得单细胞，然后重悬于含有 mTeSR1 并补充了 10 ng/mL 基础成纤维细胞生长因子（bFGF）、青霉素/链霉素（P/S）和 10 µM ROCK 抑制剂（RI）的完全培养基中。以 60,000 个细胞/cm2 的密度接种于经 1:50 稀释 Matrigel 包被的 6 孔细胞培养板中（第 0 天）。</li>
	<li>当细胞达到 95%–100% 汇合度时，开始诱导分化，更换为含 LDN193189（200 nM）和 SB431542（10 µM）的 100% KSR 培养基（第 1 天）。</li>
	<li>第 2 天，再次更换培养基，使用补充了 LDN193189（200 nM）、SB431542（10 µM）和 XAV939（5 µM）的 100% KSR 培养基。</li>
	<li>分化第 4 天，更换为 KSR 培养基（75%）和 N2 培养基（25%）的混合液，并补充 LDN193189（200 nM）、SB431542（10 µM）和 XAV939（5 µM）。</li>
	<li>从第 6 天至第 12 天，通过每天增加 25% 的 N2 培养基比例，逐步过渡至含 LDN193189（200 nM）、SB431542（10 µM）和 XAV939（5 µM）的 100% N2 培养基，并每 2 天更换一次培养基。</li>
	<li>将第 12 天的神经前体细胞（NPCs）在补充了 20 ng/mL bFGF 的 N2:B27 培养基中进行培养。</li>
	<li>在每孔 2 mL NPC 培养基中，将 2 × 105 个细胞接种至经 1:50 稀释的完全基底膜基质包被的 P6 培养板中，孵育以使细胞贴壁。</li>
	<li>次日，在含 8 µg/mL 多聚素（polybrene）的条件下，用慢病毒颗粒以 MOI 6 感染细胞。</li>
	<li>感染 8 小时后，将含病毒的培养基更换为新鲜的 NPC 生长培养基。</li>
	<li>次日，重复感染操作，并在 8 小时后更换培养基。</li>
	<li>继续培养细胞 72 小时，之后收获用于进一步分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

利用基因改造技术对干细胞进行研究或临床应用的能力，受到现有技术和对人胚胎干细胞（hESC）生物学基础认知的双重限制。在小鼠胚胎干细胞（ESC）中已显示出显著潜力的技术，如脂质体转染（lipofection）和电穿孔（electroporation），在hESC中效率较低，因为hESC notoriously 难以通过传统方法实现高效基因递送20。这一现状不仅推动了对现有技术的优化，也促进了新型方法的开发，以提高hESC中的转染效率。这些新方法的研发重点是在长期培养过程中，实现对hESC高效且稳定的基因递送，同时对其生长、多能性及分化潜能产生最小影响。在众多满足上述严格标准的新技术中，慢病毒介导的基因转移技术被广泛应用于hESC21,22。为生产表达特定基因的慢病毒颗粒，需将目标基因克隆至一种转移载体中，并与包装质粒共同转染HEK293T细胞，从而收获含有慢病毒颗粒的细胞培养上清液。为在hESC中使用，必须通过多种技术浓缩这些病毒颗粒，以获得至少达到1 × 107<...

源自囊胚内细胞团的人胚胎干细胞（hESCs）具有多能性，可根据外部因素分化为不同类型的细胞 体外 条件1,2为了充分挖掘人类胚胎干细胞（hESCs）的潜力，必须具备快速且可靠的基因递送方法。传统上，所采用的技术 broadly 可分为两类：非病毒和病毒基因递送系统。3,4较为常用的非病毒基因递送系统包括脂质体转染、电穿孔和核转染。非病毒递送系统的优点在于插入突变较少，且整体免疫原性降低。5,6然而，这些方法的转染效率较低，且外源基因瞬时表达的持续时间较短，这成为长期分化研究的主要限制因素。7电穿孔相较于脂质体转染可实现更高的转染效率；然而，其导致的细胞死亡率超过50%8,9,10通过核转染技术，结合脂质体转染与电穿孔，可提高细胞存活率和转染效率，但该方法需要细胞特异性的缓冲液和专用设备，因此在大规模应用时成本较高11,12.
相比之下，病毒载体在转导后表现出更高的转染效率以及总体较低的细胞毒性。此外，所递送的基因能够稳定表达，因此该方法适用于长期研究。13在将基因递送至人胚胎干细胞（hESCs）的常用病毒载体中，慢病毒载体（LVS）是其中之一，使用高滴度病毒颗粒时可实现超过80%的转导效率。14,15脂质体转染与磷酸钙法4 沉淀法是瞬时转染HEK293T细胞或其衍生细胞系的常用方法之一，通常与基因转移载体及包装质粒共转染，以产生慢病毒颗粒16尽管脂质体转染法具有较高的转染效率和较低的细胞毒性，但该技术受限于其成本较高，若需扩大规模以获得高滴度的慢病毒颗粒，成本将极为昂贵。CaPO4 沉淀法获得的转染效率与脂质体转染法相对相似。尽管磷酸钙法成本较低4 沉淀会导致转染后出现显著的细胞死亡，这使得标准化操作以及避免批次间差异变得困难17在此情况下，开发一种具有高效转染率、低细胞毒性且成本效益高的方法，对于生产可用于人胚胎干细胞（hESCs）的高滴度慢病毒颗粒至关重要。
聚乙烯亚胺（PEI）是一种阳离子聚合物，可在对HEK293T细胞进行转染时实现高效转染，同时细胞毒性较低，且与基于脂质转染的方法相比成本极低18。在此情况下，PEI可用于大规模生产高滴度慢病毒（LVS）的应用，通过多种技术从培养上清中浓缩慢病毒颗粒。本文所述方法介绍了使用PEI转染HEK293T细胞，并通过蔗糖垫超速离心法浓缩慢病毒载体。采用该方法，我们通常获得的病毒滴度稳定高于5 × 107 IU/mL，且批间差异较小。该方法操作简便、直接，且成本效益高，适用于向人胚胎干细胞（hESCs）及其衍生细胞进行基因递送的大规模应用。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL，无菌认证开放式超透明薄壁管</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF 重组人源</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 FRAC V</td><td>Invitrogen</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>环杷明</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 营养混合物&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca 和 Mg 的 DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 非必需氨基酸 (NEAA) 100X 溶液</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，100X&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH 多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH shRNA</td><td>Macrogen</td><td></td><td>序列：CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 完全培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基 1X CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 补充剂 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 补充剂 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1 TRC 载体</td><td>Addgene</td><td>10878</td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7 载体&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene 感染试剂</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>支化聚乙烯亚胺</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>嘌morphamine</td><td>Tocris</td><td>4551/10</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632&lt;br/&gt; 二盐酸盐&amp;nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（pei）通过慢病毒介导将shrna递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

本方案描述了利用慢病毒颗粒高效地将短发夹RNA（shRNA）递送至人胚胎干细胞（hESC）以及由hESC衍生的神经前体细胞（NPC）的方法。通过使用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），将携带shRNA的入门载体与包装质粒（pAX和pMD2.G）共同转染HEK293T细胞，从而产生慢病毒颗粒。病毒颗粒经超速离心浓缩后，平均滴度超过5 × 107。使用这些慢病毒颗粒可实现hESC和NPC的高效感染，这通过嘌呤霉素筛选及hESC中的稳定表达、以及NPC中绿色荧光蛋白（GFP）的瞬时表达得以证实。此外，Western blot分析显示，shRNA靶向基因的表达水平显著降低。同时，细胞仍保持其多能性及分化潜能，表现为后续可分化为中枢神经系统（CNS）的不同谱系。本方案主要涉及shRNA的递送，但该方法同样可用于cDNA的异位表达，以开展过表达研究。

基因转导后，人胚胎干细胞（hESCs）必须保持高存活率。尽管已对电穿孔法转染hESCs的方案进行了诸多优化以减少细胞死亡，但这些细胞在电穿孔后仍会出现超过50%的细胞死亡率，且转染效率较低20。慢病毒介导的基因转导不仅可实现高效的基因转移，而且在转导后还能维持较高的细胞存活率。以下结果展示了两种方法：一种使用GFP作为报告基因，在hESCs分化而来的神经前体细胞（NPCs）中实现瞬时表达；另一种使用嘌呤霉素对hESCs进行稳定筛选，以用于长期分化实验。
在第一组实验中，通过共转染携带shRNA的pll3.7载体（以GFP作为报告基因）以及第二代慢病毒包装质粒psPAX2.0和pMD2.G来产生慢病毒颗粒。转染后48小时和72小时收集慢病毒颗粒，并通过超速离心进行浓缩。图1A显示转染72小时后HEK293T细胞中GFP表达丰富。病毒蛋白的表达还导致HEK293T细胞出现合胞体形成，即单个细胞相互融合，如图1A中箭头所示...

利用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），我们高效地制备了用于在H9人胚胎干细胞（hESCs）中稳定表达shRNA的慢病毒颗粒，并实现了对H9来源的神经前体细胞（NPCs）的高效瞬时转导。

利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过慢病毒介导将shRNA递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

本方案描述了利用慢病毒颗粒将短发夹RNA（shRNA）递送至人胚胎干细胞（hESCs）和……

HEK293T 细胞的转染必须在细胞融合度达到 90% 时进行。此外，使用 0.45 微米低蛋白结合滤膜过滤慢病毒载体，以及使用蔗糖垫层进行超速离心，均为关键步骤。开始实验前，将 HEK293T 细胞培养于含 10% 胎牛血清和 1× 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，在 37°C、含 5% 二氧化碳和 21% 氧气的湿润培养箱中培养，直至细胞达到 90% 融合度，然后接种用于转染。在100毫米组织培养皿中，加入10毫升完全生长培养基，接种4×10⁶个细胞，于含5%二氧化碳和21%氧气的湿润化组织培养孵箱中过夜培养。每次转染时，按照文稿中所述的进入质粒与包装质粒比例，将1毫克/毫升的质粒DNA储存液用1毫升无血清DMEM培养基在1.5毫升离心管中稀释。涡旋振荡管子10秒，然后在室温下以10,000×g离心30秒以收集液体。然后，向离心管中加入 70 µL 浓度为 1 mg/mL 的聚合物聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）储备液。再次涡旋混匀，并短暂离心。对于基于脂质体转染试剂（lipofectamine）的转染实验，将载体溶解于 500 µL 不含血清的 DMEM 培养基中，其中含有试剂盒提供的 45 µL 试剂 P。然后，用500微升相同培养基稀释70微升试剂L。将两个离心管在室温下孵育5分钟。随后，混合两管中的内容物，并在室温下孵育20分钟，以促进复合物形成。接下来，将一毫升 DNA-PEI 或 DNA-脂质体转染复合物逐滴加入含细胞的培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳和 21% 氧气的条件下孵育六小时。孵育结束后，弃去原培养基，更换为 10 毫升新鲜的完全生长培养基，并将培养板放回培养箱中。转染两天后，收集含有病毒的培养上清，再向细胞中加入 10 毫升新鲜的完全生长培养基覆盖细胞。再次，在转染后第三天收集含有病毒的培养基，并将其与第二天时间点收集的培养基混合。在4°C条件下，以2,000 × g离心10分钟，沉淀细胞碎片。使用0.45微米孔径的低蛋白结合滤膜过滤上清液，并在4°C保存，直至进行超速离心。 用70%乙醇清洗超速离心管的套管10分钟以进行灭菌。晾干后关闭，并将套管置于4摄氏度环境中。向无菌超速离心管中加入36毫升含有慢病毒颗粒的过滤培养基。用无菌移液管吸取 4 毫升在 PBS 中配制的无菌 20% 蔗糖溶液，总体积为 5 毫升，然后将其加入含有慢病毒载体（LVS）的离心管底部。确保蔗糖溶液不与培养基混合，而在离心管底部形成梯度。使用无血清 DMEM 培养基平衡所有超速离心管，将离心管放入预冷的超速离心管套杯中，并盖紧盖子。在4°C条件下，以125,000 × g离心两小时。离心后，将管中内容物小心倒置至含有漂白剂的容器中，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。若可见沉淀，可对其进行标记。将超速离心管放入一个50毫升的无菌管中，并在沉淀物顶部加入200微升无菌DPBS。将试管置于4摄氏度过夜。次日，通过上下吹打轻轻混匀管内内容物，然后在台式离心机中以13,000 ×g离心，使任何残渣形成沉淀。将上清液转移至新管中，并对病毒制剂进行分装。最后，将试管置于-80摄氏度保存。转染后，在HEK293T细胞中观察到强烈的GFP表达。病毒蛋白的表达导致HEK293T细胞形成合胞体，即单个细胞发生融合。感染后，在病毒感染的神经前体细胞中也观察到明显的GFP表达。低成本PEI与Lipofectamine 3000试剂之间的LVS滴度测量结果显示，病毒滴度无显著差异。基于PLK 0.1的载体的病毒滴度如图所示。与未转导的细胞相比，慢病毒转染的细胞显示出超过80%的细胞活力，而经处理的细胞无一存活。Western印迹分析显示，在转导了空载体骨架的细胞中，L-2-羟基戊二酸脱氢酶表达丰富。然而，在转导了携带短发夹RNA的载体的细胞中未观察到表达。该技术的主要优势在于使用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺，通过将进入载体和包装载体共转染HEK293T细胞来生成慢病毒颗粒。

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科研

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生物学

慢病毒介导的shRNA递送到hESC和NPC，使用低成本阳离子聚合物聚乙亚胺（PEI）

本文详细介绍了利用微电极阵列（MEA）在贴壁哺乳动物细胞培养物中进行siRNA随机序列位点特异性转染的实验方案。...

使用微电极阵列（MEA）对贴壁细胞进行高效、位点特异性siRNA转染

来源：Tagliafierro, L.，等．用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台．J. Vis. Exp.

慢病毒转导神经前体细胞以调控α-突触核蛋白表达的表观遗传机制

在本视频中，我们演示一种方法，通过将 shRNA...

体外短发夹RNA介导的iHSPCs基因敲低：基于慢病毒的shRNA表达系统递送用于iHSPCs中特定基因表达的敲低

本文描述了一种用于评估聚合物基因递送纳米颗粒的纳米颗粒追踪分析（NTA）和高通量流式细胞术的实验方案。NTA...

通过纳米颗粒追踪分析与高通量流式细胞术评估聚合物基因递送纳米颗粒

递送仍是小干扰RNA（siRNA）在治疗应用中的主要挑战。本方案采用一种多功能且生物相容的siRNA递送平台，由精氨酸和聚乙烯亚胺接枝的多孔硅微粒组成。...

多孔硅微粒用于递送siRNA治疗剂

本实验方案的目标是利用带有神经靶向肽的阳离子/阴离子脂质体作为中枢神经系统递送系统，使siRNA能够穿过血脑屏障。优化siRNA等治疗方法的递送系统，将为朊病毒病及其他神经退行性疾病提供更多治疗选择。...

使用阳离子和阴离子脂质体将治疗性siRNA递送至中枢神经系统

本论文描述了一种利用PEI/MNP载体高效、非病毒性地将miR递送至内皮细胞并实现其磁化的方法。因此，该方法除了可实现遗传修饰外，还可实现磁性细胞导向和磁共振成像（MRI）检测。该技术可用于改善治疗性细胞产品的特性。...

制备与 体外 磁化miR修饰内皮细胞的表征

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

我们介绍了一种利用聚乙烯亚胺（PEI）包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒将siRNA转染至巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可高效地将siRNA递送至巨噬细胞。 体外 和 体内...

聚乙烯亚胺包被的氧化铁纳米颗粒作为小干扰RNA体外和体内递送至巨噬细胞的载体 In Vitro 和 In Vivo

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

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利用慢病毒介导的基因沉默技术在低吸附培养板中制备的人类假胰岛中的应用

学习使用低成本阳离子聚合物聚乙亚胺（PEI）制备慢病毒颗粒，实现shRNA在人胚胎干细胞和神经祖细胞中的高效递送。该方法为基因治疗和再生医学研究提供经济可行的技术方案。

利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过慢病毒介导将shRNA递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

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