可视化大鼠内侧腓肠肌神经肌肉接头的形态学特征

该协议展示了一种使用具有不同生物标志物（即神经丝200，水泡乙酰胆碱转运蛋白，α-蹦极毒素和S100）的荧光免疫组织化学来检查大鼠内侧腓肠肌中突触前末端，突触后受体和突触周围施万细胞之间空间相关性的方法。

该方案可用于评估正常和病理条件下神经肌肉接头的完整性和可塑性。该技术是一种在单个肌肉切片上同时标记施万细胞和实验室前后动物的技术。对成年雄性大鼠实施安乐死后，将大鼠置于罩中，并用剪刀和镊子打开胸腔以进入心脏。

从左心室向主动脉插入和静脉导管，切开右心耳蜗。接下来，用100毫升0.9%生理盐水开始灌注，直到从右甲骨文流出的血液清晰。然后继续在0.1摩尔磷酸盐缓冲液或PB pH 7.4中灌注250至300毫升4%多聚甲醛10分钟。

灌注后，使用手术刀片切除双侧后肢的皮肤，并暴露双侧坐骨神经和内侧腓肠肌。使用刀片从后肢小心地解剖双侧内侧腓肠肌，并将整个肌肉固定在10毫升4%多聚甲醛中。两小时后，从溶液中取出肌肉，并在4摄氏度下用10毫升25%蔗糖在0.1摩尔PB中冷冻保护一天。

一旦肌肉组织浸入蔗糖溶液中，使用冷冻切片培养基将其固定在滑动切片机系统的冷冻阶段。将肌肉沿着肌肉的长轴水平切成80微米的厚度。使用刷子，将每孔7个冷冻切片有序地放入具有10毫升0.1摩尔PB的六孔培养板中。对于荧光染色，在轨道振荡器上以20rpm的速度在轨道振荡器上用含有75微升10%Triton X 100和45微升正常驴血清的1.5毫升0.1摩尔PB孵育4个切片。

30分钟后，将切片转移到含有兔抗神经丝200，山羊抗水泡乙酰胆碱转运蛋白0.1摩尔PB，1%正常驴血清和0.5%Triton X 100的一抗混合溶液中，并在4摄氏度下孵育过夜。第二天，在轨道振荡器中以20 rpm的速度在0.1摩尔PB中洗涤切片三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将切片孵育在含有驴抗兔AF 488和驴抗山羊AF 546的二抗的混合溶液中，以及α蹦极毒素AF 647和鬼臼蛋白350的生物标志物，在0.1 M PB中含有1%正常驴血清和0.5 Triton x 100，持续一小时， 保护它们免受光线照射。

孵育后，在PB中洗涤切片并将其安装在显微镜载玻片上。在蒸馏水中使用50%甘油将盖板玻璃涂抹在切片上。使用配备20 x主观透镜（数值孔径为0.75）和40 x透镜（数值孔径为0.95）的con焦点成像系统观察和成像标本。

对于多重荧光成像，请按照文本手稿中所述设置每个生物标志物的激发和发射波长。将图像捕获的分辨率设置为 640 x 640 像素。接下来，设置开始和结束焦平面。

将步长设置为一微米或两微米。然后选择深度模式、图像捕获和 Z 系列。对于20 X的较低放大倍率图像，使用105微米针孔以2微米步长捕获40 Z堆栈图像。

选择 Z 轴上的投影或地形模式和强度投影，将所有图像集成到单个焦点中。对于40 X的更高放大倍率图像，以一微米步长捕获80 Z堆栈图像，变焦设置为2和105微米针孔。将所有图像集成到单个焦点中。

使用图像处理系统重建三维图案的图像。这里展示了内侧腓肠肌与神经丝200个阳性神经纤维、水泡乙酰胆碱转运蛋白阳性突触前末端、α蹦极毒素阳性突触后乙酰胆碱受体、S100突触周围突触周围细胞、鬼痴素阳性肌纤维和DAPI标记细胞核的代表性空间相关性。神经丝200根正神经纤维成束运行。

这些神经纤维向水泡乙酰胆碱转运蛋白的突触前末端提供了分支，从而与突触后乙酰胆碱受体的α蹦极毒素形成镜像关系。此外，在靠近突触前末端的神经丝200根阳性神经纤维周围检测到S100阳性突触周围施旺细胞。空间相关性以三维模式进一步表现出从不同角度显示神经肌肉接头的详细形态特征。

为了观察肌肉切片的更多成像，沿着80微米厚度沿长轴水平切片肌肉至关重要。