一种研究细胞内囊泡破裂功能的光动力学方法

囊泡内吞进入细胞质后形成细胞内囊泡。囊泡的通透化会激活多种信号通路。染料辅助激光失活技术可用于研究细胞内囊泡破裂所导致的后果。

通过调节静置条件和光照，可实现对细胞内囊泡亚细胞结构损伤的空间和时间控制。首先，将HeLa细胞培养在添加10%FBS的DMEM培养基中。用PBS洗涤细胞后，进行胰蛋白酶消化处理。

然后将细胞重悬于添加了10% FBS的DMEM中。在25微升低血清培养基中稀释300纳克Gal3-GFP质粒，随后加入0.6微升P3000试剂。

轻轻混匀，然后涡旋振荡溶液。将0.45 µL Lipofectamine 3000试剂加入25 µL低血清培养基中稀释，并轻轻混匀。室温孵育5分钟。

然后将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine 3000混合，在室温下孵育10分钟。将DNA-脂质体混合物、300,000个悬浮的HeLa细胞以及200微升含10%FBS的DMEM混合后，接种到35毫米玻璃底培养皿中央的玻璃区域。为使细胞贴壁，将培养皿置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育至少4小时。

将AlPcS2a用添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM稀释，配制为1 µM的AlPcS2a溶液。将含AlPcS2a的培养基在37 °C水浴中预热，并用该培养基替换细胞培养液。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中孵育过夜。

次日，更换为新鲜培养基后，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除细胞外的 AlPcS2a。在 37 摄氏度下孵育 4 小时，使沿内吞途径残留的染料在溶酶体中聚集。为通过破坏溶酶体来操控单个细胞，将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台上。

使用488纳米和561纳米激光分别激发GFP和AlPcS2a。在标记AlPcS2a并选定为损伤目标的囊泡上，圈定一个5×5微米的感兴趣区域。随后，用0.21毫瓦或70次重复的633纳米激光对感兴趣区域进行脉冲照射。

以Gal3斑点的形成为指标，监测溶酶体膜通透化。使用商业化标记物对HeLa细胞中的溶酶体进行AlPcS2a染色，并用绿色荧光染料进行阳性染色。在表达TagRFP-Galectin3的HeLa细胞中，溶酶体经AlPcS2a染色。

随后使用近红外光进行聚焦照射，结果表明，基于AlPcS2a的发色团辅助激光失活技术能够控制目标区域内的局部溶酶体破裂，同时保持其余溶酶体完整。此步骤至关重要，因为孵育时间将决定内体或溶酶体的存留状态。例如，研究人员可通过膜不可渗透性染料的释放情况来判断其大小。

也可使用pH敏感性染料（如FITC葡聚糖）来区分内体和溶酶体。该技术有助于研究细胞内囊泡膜破裂所引发的下游效应。在不同情况下均存在相应的下游效应。