Name: 研究细胞内囊泡破裂功能的光动力方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 了解利用AlPcS2a介导的CALI技术研究活细胞内囊泡破裂动态的方法。该技术可精确控制亚细胞损伤，揭示囊泡破裂后的信号通路变化，为细胞生物学和神经科学研究提供重要工具。

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作者感谢中国台湾中央研究院生物医学科学研究所（IBMS）炎症核心设施提供的研究支持。该核心设施由中央研究院核心设施与创新仪器项目（AS-CFII-111-213）资助。作者感谢中央研究院（AS）生物医学科学研究所（IBMS）共用仪器核心设施在图像采集方面的协助。

1. AlPcS2a 储存液的制备
<ol>
	<li>将10 mg的AlPcS2a溶解于400 µL的0.1 M NaOH中。为提高溶解度，于50 °C加热溶液并涡旋振荡。</li>
	<li>将该溶液与4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，随后使用0.22 µm滤膜过滤，以去除不溶性沉淀物。</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计测定溶液浓度。AlPcS2a在672 nm处的消光系数为4 x 104 cm-1 M-1。用PBS将AlPcS2a溶液稀释至1 mM浓度，分装为1 mL每份，于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 转染
注意：Gal3-GFP 用作溶酶体破裂活细胞成像的指示剂。
<ol>
	<li>在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养HeLa细胞。用PBS洗涤细胞后，使用胰蛋白酶消化细胞，然后将细胞重悬于含10% FBS的DMEM培养基中。 
	注意：该方法适用于大多数贴壁细胞系，包括HeLa和A549细胞系。原则上，尽管未对悬浮细胞进行测试，CALI实验也可在悬浮细胞中进行。</li>
	<li>将300 ng Gal3-GFP质粒溶于25 µL低血清培养基中，然后加入0.6 µL P3000试剂，轻轻混匀。将0.45 µL Lipofectamine 3000试剂溶于25 µL低血清培养基中，轻轻混匀。</li>
	<li>室温孵育5分钟。将稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 3000混合，再于室温孵育10分钟。</li>
	<li>将DNA-Lipofectamine混合物、3 × 105个悬浮的HeLa细胞以及200 µL DMEM+10% FBS混合后，接种于35 mm玻璃底培养皿的中央玻璃区域。</li>
</ol>
3. AlPcS2a 染色
<ol>
	<li>为促进细胞贴壁，将细胞置于培养环境中孵育 37 °C 在提供有 5% CO2 至少 4 h。</li>
	<li>稀释 AlPcS2a 在添加了10% FBS的DMEM中制成 1 µM AlPcS2a 溶液。预先将 AlPcS 加热至适宜温度2a含培养基的培养环境 37 °C 水浴。将培养基更换为AlPcS2a含培养基</li>
	<li>将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在含有5% CO₂的培养箱中2 过夜（16–18 小时）。</li>
	<li>次日，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除细胞外的 AlPcS2a。弃去 PBS 后更换为新鲜培养基，随后继续培养于 37 °C 孵育4小时，以使胞吞途径中残留的染料积聚到溶酶体中。 
	注意：为了染色内体，将细胞在 1 µM AlPcS2a 在含10% FBS的DMEM中于15分钟内 37 °C接着，用 PBS 洗涤细胞两次，并将细胞置于预热的培养基中孵育，然后进行成像。</li>
</ol>
<img alt="红外诱导药物递送示意图；随时间推移的内体到溶酶体过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1．AlPcS2a介导的选择性静脉内皮损伤示意图。该图展示了选择性静脉内皮损伤的原理示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，LysoTracker，AlPcS2a，细胞合并图像，细胞定位分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2．AlPcS2a对溶酶体的染色。在HeLa细胞中，使用1 µM AlPcS2a过夜标记溶酶体，并用50 nM绿色荧光染料进行阳性染色。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 样品成像与光照
注意：可对单个细胞内的亚细胞区域或培养皿中所有标记了AlPcS2a的细胞进行光动力损伤处理。对整个培养皿进行大范围照射，可实现对该损伤的定量研究，包括生化分析。
<ol>
	<li>通过损伤单个细胞内的溶酶体来操控单个细胞，具体操作如下所述。
	<ol>
		<li>将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台上。分别使用488 nm和561 nm激光激发GFP和AlPcS2a。</li>
		<li>5 x 的圆圈 5 µm2 感兴趣区域（ROI）在AlPcS上的位置2a标记的囊泡，这些囊泡被选为受损对象。</li>
		<li>脉冲照射：使用633 nm、0.21 mW的激光对ROI进行70次照射。监测Gal3斑点的形成，作为溶酶体膜通透化的指标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照下述方法损伤培养皿中所有标记的细胞。
	<ol>
		<li>将培养皿置于平台上，用660 nm的准直LED光照射（根据AlPcS2a的激发光谱，近红外光为理想光源）。</li>
		<li>将培养皿置于显微镜下，按照步骤4.1.3中所述监测膜通透性变化的指标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下指标评估静脉输液（IVs）的损伤情况。
	<ol>
		<li>内体或溶酶体的内容物高度糖基化，在IV破裂后会暴露于细胞质中。利用细胞质中的糖结合凝集素（如galectin-1、galectin-3、galectin-8和galectin-9）迅速标记这些暴露的糖基化物质。16,20.</li>
		<li>可通过膜不可渗透性染料的释放情况来确定伤口大小，具体方法如所述21.</li>
		<li>内体与溶酶体的区别在于其腔内pH值。溶酶体破裂会扰乱腔内pH值，可通过使用pH敏感性染料（如FITC-葡聚糖）进行检测。3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="荧光显微镜，TagRFP-Gal3，AlPcS2a，光照前后示意图，细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3。AlPcS2a介导的CALI诱导TagRFP-半乳糖凝集素-3（Gal3）在照射区域内向溶酶体局部募集。 在表达TagRFP-半乳糖凝集素-3的HeLa细胞中，溶酶体经1 µM AlPcS2a染色过夜，随后用近红外光（633 nm）照射黄色方框区域。黄色方框内的AlPcS2a信号发生光漂白，同时伴随TagRFP-半乳糖凝集素-3点状结构的形成。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

AlPcS2a 与质膜结合后，通过内吞作用被细胞内化，并最终在溶酶体中积累。因此，通过调整孵育时间，可将 AlPcS2a 定位于不同的亚细胞区室。该方法的一个局限性在于，仅有一部分内体囊泡（IVs）可通过内吞作用被 AlPcS2a 标记，因为 IVs 的膜来源多样，还包括内质网和高尔基体等。此外，AlPcS2a 对早期内体或晚期内体的选择性标记较为困难，然而在亚细胞成像过程中，可利用荧光标记物来区分早期形成的内体与晚期形成的内体。CALI 诱导的 IV 损伤可通过多种染料实现3,24。
损伤程度可通过光的功率和照射时间进行控制。较强的损伤可能导致细胞皱缩或坏死。本文展示了若干IV损伤的指标，可用于确定实验条件。此外，这些指标也可作为受损IV的标记物，提供其随时间变化的亚细胞分布信息。
在临床上，AlPcS2a</s...

内体是一种细胞内囊泡（IV），通过胞吞作用形成，随后成熟为溶酶体。多种细胞内信号通路参与了细胞内囊泡的形成；此外，不同的内在和外在刺激均可对细胞内囊泡造成损伤（例如，病原体在感染过程中可从包被膜中逃逸并进入细胞质1）。这一过程通常伴随着胞吞囊泡的破裂2。因此，靶向和破坏细胞内囊泡的技术可用于相关研究3。
光动力疗法（PDT）是一种依赖光照射来杀伤肿瘤或病原体以治疗疾病的治疗方法4。在PDT中，靶向细胞被标记上无毒性的发色团，即光敏剂，这些光敏剂可通过光照在局部被激活5,6。光敏剂吸收光能后转变为激发的单重态，进而形成寿命较长的激发三重态。处于三重态的光敏剂可在氧气存在下发生电子或能量转移，产生活性氧物种（ROS），从而在光照区域内特异性地破坏被标记的细胞7。其效应因光照强度的不同而有所差异8。通过调控光敏剂的浓度和光照强度，可选择性地使靶向生物分子失活而不引起细胞裂解，该过程称为发色团辅助光失活（CALI）9。随着能够特异性标记多种亚细胞结构的光敏剂的显著发展，CALI已成为一种重要的工具，可用于调控光介导的生物分子失活，其应用范围涵盖核苷酸和蛋白质等小分子生物分子，以及线粒体和内体-溶酶体等细胞器3,10,11,12,13。
与CALI相比，化学或物理方法也可用于损伤膜结构，例如使用细菌毒素14,15和Leu-Leu-OMe16处理以造成溶酶体损伤。然而，这些方法会在细胞内引起大范围的内涵体/溶酶体（IV）损伤。CALI中则使用高效的光敏剂（例如Al(III)酞菁氯化二磺酸（AlPcS2a））；AlPcS2a通过内吞作用靶向溶酶体，可在特定区域可控地破坏内体或溶酶体17。AlPcS2a是一种不能穿透细胞膜的基于酞菁的发色团，可结合质膜上的脂质，通过内吞作用被细胞摄取，并经由内吞途径最终在溶酶体内富集18。它在近红外光谱区吸收光，产生单线态氧，这是激发态AlPcS2a生成的主要活性氧（ROS）18。单线态氧衰变迅速，其扩散和反应距离被限制在细胞内的极小区域（约10–20 nm）19。通过调节AlPcS2a的孵育时间与光照时间，可实现对亚细胞区域内IV损伤的时空精确控制。因此，CALI成为研究IV损伤后果以及IV形成与调控机制的有力工具。
本研究介绍了一种使用AlPcS2a 作为光敏剂的特异性CALI实验方案。该方案可应用于多种类型的囊泡（IVs），包括内体和溶酶体，并可用于检测膜破裂后的后续反应。通过表达荧光标记的半乳糖凝集素-316,20的HeLa细胞在溶酶体破裂后的变化，来演示本实验方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化铝(III)酞菁二磺酸（AlPcS）&lt;sub&gt;2a&lt;/sub&gt;)</td><td>前沿科学</td><td>P40632</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>ibidi</td><td>812128-200</td><td></td></tr><tr><td>培养基</td><td></td><td></td><td>DMEM 培养基，添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素 G 和 100 mg/mL 链霉素</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Gal3-GFP 质粒</td><td>addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Green DND-26</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L7526</td><td>绿色荧光染料</td></tr><tr><td>多孔板</td><td>珀金埃尔默</td><td>PK-6005550</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q15895</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>这些方法适用于大多数贴壁细胞系，但需针对不同情况分别确定实验条件。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤光片</td><td>默克</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>准直LED光源&amp;nbsp; (660 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3-C1 和 DC2100</td><td>近红外光基于AlPcS2a的激发光谱是理想的选择。</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>LSM 780</td><td>长期成像需要使用培养系统。</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红光LED</td><td>Tholabs</td><td>M660L4-C1</td><td></td></tr></tbody></table>

一种研究细胞内囊泡破裂功能的光动力学方法

A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture

细胞内囊泡（IVs）通过囊泡内吞进入细胞质而形成。IV的形成涉及多种信号通路的激活，这一过程与IV膜的通透性改变以及内体和溶酶体的形成密切相关。一种名为染料辅助激光失活（chromophore-assisted laser inactivation, CALI）的方法被用于研究IV的形成及其在调控IV过程中的相关物质。CALI是一种基于成像的光动力学方法，可用于研究由膜通透性改变所诱导的信号通路。该方法能够在细胞中对选定的细胞器进行时空特异性的通透性操控。CALI方法已被应用于通过内体和溶酶体的通透化来观察和监测特定分子。已知IV膜的破裂会选择性募集糖结合蛋白，例如半乳糖凝集素-3（galectin-3）。本文所述实验方案描述了利用AlPcS2a 诱导IV破裂，并以galectin-3作为标记物来标记受损溶酶体的方法，该方法有助于研究在不同条件下IV膜破裂及其下游效应的生物学后果。

已展示一幅示意图，表示AlPcS2a诱导的IV型内体和溶酶体损伤（图1）。
可使用市售标记物来确定AlPcS2a的染色条件。例如，AlPcS2a斑点与绿色荧光染料的共定位（图2）22。
荧光标记的半乳糖凝集素-3（galectin-3）可作为监测IV损伤的指示剂（图3）。此外，还可通过追踪Gal3点状信号的位置来检测下游信号通路，包括溶酶体修复和溶酶体自噬3,23。Gal3从细胞质快速聚集到受损的IV部位会显著增强Gal3的信号强度，若调整图像对比度以显示细胞质中的Gal3，则Gal3点状信号的强度可能达到饱和。事实上，图...

AlPcS2a介导的染料辅助激光失活（CALI）是一种用于研究活细胞内细胞内囊泡（IVs）时空损伤的有力工具。

细胞内囊泡（IVs）通过囊泡内吞进入细胞质而形成。IV的形成参与激活多种信号通路……

囊泡内吞进入细胞质后形成细胞内囊泡。囊泡的通透化会激活多种信号通路。染料辅助激光失活技术可用于研究细胞内囊泡破裂所导致的后果。通过调节静置条件和光照，可实现对细胞内囊泡亚细胞结构损伤的空间和时间控制。首先，将HeLa细胞培养在添加10%FBS的DMEM培养基中。用PBS洗涤细胞后，进行胰蛋白酶消化处理。然后将细胞重悬于添加了10% FBS的DMEM中。在25微升低血清培养基中稀释300纳克Gal3-GFP质粒，随后加入0.6微升P3000试剂。轻轻混匀，然后涡旋振荡溶液。将0.45 µL Lipofectamine 3000试剂加入25 µL低血清培养基中稀释，并轻轻混匀。室温孵育5分钟。然后将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine 3000混合，在室温下孵育10分钟。将DNA-脂质体混合物、300,000个悬浮的HeLa细胞以及200微升含10%FBS的DMEM混合后，接种到35毫米玻璃底培养皿中央的玻璃区域。为使细胞贴壁，将培养皿置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育至少4小时。将AlPcS2a用添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM稀释，配制为1 µM的AlPcS2a溶液。将含AlPcS2a的培养基在37 °C水浴中预热，并用该培养基替换细胞培养液。将细胞置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中孵育过夜。次日，更换为新鲜培养基后，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除细胞外的 AlPcS2a。在 37 摄氏度下孵育 4 小时，使沿内吞途径残留的染料在溶酶体中聚集。为通过破坏溶酶体来操控单个细胞，将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台上。使用488纳米和561纳米激光分别激发GFP和AlPcS2a。在标记AlPcS2a并选定为损伤目标的囊泡上，圈定一个5×5微米的感兴趣区域。随后，用0.21毫瓦或70次重复的633纳米激光对感兴趣区域进行脉冲照射。以Gal3斑点的形成为指标，监测溶酶体膜通透化。使用商业化标记物对HeLa细胞中的溶酶体进行AlPcS2a染色，并用绿色荧光染料进行阳性染色。在表达TagRFP-Galectin3的HeLa细胞中，溶酶体经AlPcS2a染色。随后使用近红外光进行聚焦照射，结果表明，基于AlPcS2a的发色团辅助激光失活技术能够控制目标区域内的局部溶酶体破裂，同时保持其余溶酶体完整。此步骤至关重要，因为孵育时间将决定内体或溶酶体的存留状态。例如，研究人员可通过膜不可渗透性染料的释放情况来判断其大小。也可使用pH敏感性染料（如FITC葡聚糖）来区分内体和溶酶体。该技术有助于研究细胞内囊泡膜破裂所引发的下游效应。在不同情况下均存在相应的下游效应。

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