Name: 长期培养用人心肌组织的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习利用生物模拟培养室进行人心室肌组织离体长期培养的方法。该技术通过施加前负荷和后负荷模拟生理环境，可连续记录组织收缩并评估关键收缩参数，为心血管医学中的药物筛选和心肌功能研究提供重要工具。

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研究由DZHK基金81Z0600207（JH、PS和DM）和81X2600253（AD和TS）资助。
作者感谢Claudia Fahney、Mei-Ping Wu和Matthias Semisch在准备实验装置以及组织培养的日常维护中提供的支持。

本研究所述实验的组织采集已获得慕尼黑大学和波鸿鲁尔大学机构审查委员会的批准。研究按照《赫尔辛基宣言》指南进行。患者在组织采集前均签署了书面知情同意书。
1. 组织获取
<ol>
	<li>从接受心脏移植或心脏手术的患者处获取人体组织。</li>
	<li>在获取组织前，配制 2 L 心肌停跳液（以下简称切片缓冲液（表 1））。</li>
	<li>获取一块 4 cm × 4 cm 大小的透壁左心室（LV）活检组织后，立即将其（在切除后 5 分钟内）放入一个可密封的一次性无菌塑料烧杯中，烧杯内含约 70 mL 冷（4 °C）切片缓冲液。保持在 4 °C。 
	&#8203;注意：本方案所用切片缓冲液允许组织在低温（4 °C）下保存长达 36 小时，便于从远离实验室的临床机构进行低温运输。然而，运输时间 ≤ 24 小时已被证明为最佳。</li>
</ol>
2. 准备琼脂糖和振动切片机
<ol>
	<li>确保准备好足够数量的培养室并进行灭菌处理（图1A）。
	<ol>
		<li>将培养室和石墨电极浸入1 L的10%异丙醇溶液中，振荡过夜。次日，将培养室转移至100%异丙醇溶液中浸泡3分钟，并将石墨电极在120 °C条件下高压灭菌10分钟。</li>
		<li>将培养室和石墨电极置于超净工作台内自然晾干。</li>
		<li>根据摇床可用位置，将电路板安装到每个培养室上。按照制造商说明，将两个石墨电极固定在电路板上。</li>
		<li>将一个35 mm培养皿盖置于培养室顶部，以防止污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的培养箱中设置Myodish培养系统（参见材料表），并将系统连接至计算机（图1B）。</li>
	<li>用切片缓冲液（不含葡萄糖；表2）配制4%低熔点琼脂糖。琼脂糖溶液可在4 °C保存6个月。
	<ol>
		<li>实验当天，使用设定为80 °C的水浴加热一定量的琼脂糖储备液使其融化。根据体积不同，融化过程约需30分钟。</li>
		<li>琼脂糖完全液化后，用10 mL注射器吸取8 mL液态琼脂糖，并额外吸入2 mL空气。用无菌帽封闭注射器，倒置放入37 °C水浴中保温20分钟，以防止琼脂糖凝固，并使其温度平衡，避免对样品造成热损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如配备水冷装置，应在组织切片前至少30分钟开启振动切片机的水冷系统，以确保充分冷却。将水循环温度设定为4 °C。 
	注意：此处使用的切片托盘和冷却板均内置水循环系统。这非常有助于降温并降低污染风险。当然，也可使用冰块作为冷却方式。此外，在本实验方案的此阶段，水冷装置无需连接至振动切片机的切片托盘和/或冷却板。</li>
	<li>使用100%异丙醇冲洗振动切片机的切片托盘和样品台所有表面，至少持续3分钟，进行清洁。 
	注意：根据所使用的振动切片机型号不同，其设置可能有所差异。请参考实验室现有振动切片机的操作手册，了解具体设置及刀片校准方法。</li>
	<li>向切片托盘中加入切片缓冲液，至其容量的90%–95%。在当前使用的装置中，这大约相当于400 mL。将水冷装置的管路连接至振动切片机切片托盘和冷却板上的阀门。</li>
	<li>将准备过程中所需的所有工具浸入100%异丙醇溶液中5秒进行消毒。随后将工具从异丙醇中取出，在超净工作台内自然晾干。</li>
</ol>
3. 样品修剪与包埋
<ol>
	<li>将组织样本转移至盛有冷切片缓冲液的100 mm培养皿中。将培养皿置于4 °C的冷却板上（连接冷却器或放置在冰上）。</li>
	<li>用镊子夹住心内膜，使用剪刀剪除约3 mm的心内膜小梁组织。以同样方法，若存在过多的心外膜下脂肪组织，也应予以去除。</li>
	<li>将切割后的组织样本（心内膜面朝上）固定在一块2 cm × 2 cm的橡胶片上，使用四根0.9 mm × 70 mm的20 G针头呈正方形排列固定（0.9 cm × 0.9 cm；图1C，D）。确保每根针头的斜切边缘朝内，以增强固定效果并防止损伤心肌组织。 
	注意：上述正方形的排列方向应与预期的主要心肌纤维走向垂直。</li>
	<li>使用手术刀切除四个针头正方形范围以外的所有多余组织。若原始样本大小允许，可从同一原始样本中制备两份心肌组织样本。</li>
	<li>用镊子将修整后的样本置于无菌纱布上，以去除样本表面残留的多余切片缓冲液。为防止样本干燥，样本在纱布上的停留时间不得超过10秒。</li>
	<li>将样本放入35 mm培养皿中，使刀片切割方向垂直于心肌细胞的排列方向，且心外膜面朝下。若制备过程中包含两个样本，需确保样本居中且彼此不接触。</li>
	<li>从水浴中取出琼脂糖注射器，将样本浸入琼脂糖中（图2A）。在冷却板上静置5分钟使琼脂糖凝固。样本必须始终与培养皿底部接触，以确保切割平面与主要心肌纤维方向平行。 
	&#8203;注意：不要将注射器中的琼脂糖完全排空，以防产生气泡。在浸没样本时注意注射器中剩余的琼脂糖量。若培养皿中出现气泡，应小心将气泡重新吸入注射器中。</li>
</ol>
4. 将样本放置在切片托盘上
<ol>
	<li>使用刮刀或类似工具，从35 mm培养皿的样品与皿壁之间插入，取出含有样品的凝固琼脂糖。用解剖刀切除部分琼脂糖，同时确保样品始终被覆盖。 
	警告：切勿去除过多琼脂糖。在X/Z平面的长边和短边方向，至少应保留5 mm的琼脂糖。 
	注意：步骤4.2–4.4需迅速连续进行（即操作时间不超过5秒）。操作前应将所有所需工具置于触手可及处。样品放置后不可再次调整位置。尽量减少胶水暴露于空气和湿气中的时间。胶水接触空气或液体后会迅速固化，导致无法使用。</li>
	<li>用移液器将60 µL胶水滴加并均匀分布在切片平台的中心区域及其周围。</li>
	<li>用镊子将包裹在琼脂糖中的样品心外膜面朝下放置于已涂胶的区域上，切勿移动。样品的心内膜面必须在琼脂糖中可见。静置1分钟使胶水固化。使用钝头工具（例如镊子）从顶部轻轻按压含有样品的琼脂糖块，注意避免切割或损伤琼脂糖。</li>
	<li>将样品平台放入振动切片机切割槽中指定位置，切割槽内应已充满切片缓冲液。</li>
</ol>
5. 启动振动切片机
<ol>
	<li>将振动幅度设为 1 mm，初始切割速度设为 0.07 mm/s。设定切片厚度为 300 µm 以进行切片。</li>
	<li>当刀片仅切割琼脂糖时，将切割速度提高至最大值，在本例中为 1.50 mm/s。一旦振动切片机开始切割组织，立即降低速度至 0.07 mm/s。 
	&#8203;注意：如果组织切片不顺畅，例如样本中存在较大的纤维化区域，可尝试将切割振幅增加至 1.5 mm，并将切割速度降低至 0.04 mm/s。</li>
</ol>
6. 切片过程中培养基和培养箱的准备
<ol>
	<li>向每个培养室中加入 2.4 mL 完全培养基（表 3）。</li>
	<li>将加有培养基的培养室置于培养系统中，放入设定为 37 °C、5% CO2、21% O2、湿度 80% 的培养箱内，平衡培养基至少 20 分钟。</li>
	<li>将培养系统连接至计算机，并启动相应的软件程序。</li>
	<li>设置摇床转速为 60 rpm，并预设刺激参数（刺激脉冲和频率）。对于人源心肌组织切片，标准刺激设置为双相脉冲，电流为 50 mA，每个脉冲包括 3 ms 正向电流、1 ms 间歇和 3 ms 反向电流，起搏频率为每分钟 30 次（BPM）。 
	注意：在保存良好的组织中，典型刺激阈值约为 15 mA。为确保刺激可靠，并考虑到刺激阈值可能升高，建议将电流设置为刺激阈值的两到三倍。</li>
	<li>检查软件中的电极指示器，确认培养室的电极工作正常。 
	&#8203;注意：当培养软件中的通道指示器变为红色时，需采取相应措施。此情况表明双极脉冲电荷未达到平衡。</li>
</ol>
7. 制备切片
注意：初始的肌内膜片通常因形态不均而不适用于组织培养，需予以弃用。在前5到10片之后，组织片的质地和形态会有所改善。理想的组织片应至少为1 cm × 1 cm，无或仅有少量纤维化区域，无破碎，且纤维排列均匀（图2B，D）。位于心肌细胞纤维之间的间质性纤维化在衰竭的人类心肌中常可见到。但出人意料的是，这并非影响培养成功与否的负面预测因素。
<ol>
	<li>在5 cm的培养皿盖中倒入适量的冷切片缓冲液，以确保组织切片不会干燥。将切片放入含有冷切片缓冲液的培养皿盖中。</li>
	<li>使用镊子将琼脂糖与组织分离，避免接触组织。操作时需小心处理组织，因为任何组织损伤都会降低培养的成功率。</li>
	<li>通过靠近光源仔细观察，确定心肌纤维的方向。此步骤对第7.6步中将塑料三角片固定到组织上至关重要。 
	注意：步骤7.4和7.5需迅速连续进行，时间控制在5秒内。</li>
	<li>使用胶水将两个塑料三角片固定在样本两端，以便在培养腔内锚定组织。
	<ol>
		<li>在无菌培养皿盖上滴加1 µL胶水。用弯头镊子夹取一个已灭菌的塑料三角片，迅速将三角片前端浸入胶水中，然后将其垂直于心肌细胞排列方向粘附在样本上。对另一个三角片重复此操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用手术刀修剪掉超出三角片宽度的多余组织（图2C）。将带有两个固定三角片的切片重新放回切割托盘的切片缓冲液中。 
	注意：重复步骤7.2至7.5，直至制备出足够填充培养腔的切片数量。建议额外多准备几片，以便替换收缩功能较差的切片。</li>
</ol>
8. 切片封片
注意：后负荷由培养室中弹簧丝的刚度决定。根据弹簧丝的粗细，提供三种不同类型。
<ol>
	<li>从培养箱中取出装有培养基的培养腔室。选择一个已准备好的组织切片，通过将每个三角形端口连接到对应的针脚上，将其插入腔室中。</li>
	<li>根据样本大小调整固定针之间的距离。确保样本完全浸没在培养基中。将腔室放回培养系统中指定的插槽内，置于培养箱中。 
	注意：切勿过度拉伸组织，也切勿过度弯折弹簧丝！</li>
	<li>将培养皿放置到摇床上后，设定预紧张力。
	<ol>
		<li>通过逆时针旋转调节螺钉来降低预紧力，直至计算机屏幕上对应曲线的基线不再发生变化为止。</li>
		<li>通过顺时针旋转调节螺钉，小心地增加预紧力（即增加张力）。对于刚度最高的腔室，持续调节直至图中对应基线升高1000–1200个单位，相当于1 mN的预紧力。 
		&#8203;注：精确的调节取决于每个培养腔室的个体弹簧常数，该常数可根据制造商说明在实验前通过校准确定。记录软件支持输入各个腔室的校准参数，从而统一以µN显示力值。建议从培养开始即施加电刺激。因此，在调节预紧力过程中，组织切片可能已开始收缩。此时应关注舒张期基线以评估预紧力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 更换培养基
<ol>
	<li>根据表3中的配方配制培养基。使用前，向50 mL离心管中加入50 µL β-巯基乙醇（50 mM）。4 °C保存。</li>
	<li>每2天更换一次部分培养基。若需长期培养心肌片，则应每2天完全更新培养基。</li>
	<li>将新鲜培养基在37 °C水浴或热空气培养箱中预热30–45分钟。从培养箱中取出一个培养腔，置于超净工作台内。 
	注意：必须保持培养腔及培养基温度为37 °C（&#62; 35 °C），以防止因低温引起过度收缩。若温度过低，可能在换液后数小时内出现较轻微的损伤，表现为舒张期张力升高。此类损伤看似可恢复，但反复的温度应激可能导致损伤累积。</li>
	<li>移除培养腔中的旧培养基，保留约0.8 mL。向同一培养腔中加入1.6 mL新鲜培养基。每个培养腔的培养基总体积应约为2.4 mL。</li>
	<li>盖上培养腔盖子，并将其放回培养箱中原有位置。</li>
</ol>

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</ol>

JH、PS、DM 和 KL 无任何利益冲突需要披露。AD 和 TS 是 InVitroSys GmbH 的股东，该公司提供 Myodish 培养系统。

过去，心血管研究在心肌细胞培养方面取得了巨大进展。然而，具有完整几何结构的心肌细胞三维培养技术尚未成熟。与以往所采用的方案相比 离体 心肌组织的培养，我们在此描述的方案类似于 体内 更接近组织的体内环境。此外，施加前负荷和后负荷可实现更接近生物体的仿生环境。我们能够全面分析并理解组织收缩数据及收缩参数的连续记录。
数量 离体 使用类似装置的心血管组织培养技术受到限制11,21,22一种已发表的类似心肌切片培养技术采用6孔板进行心肌切片的培养10然而，这种特定设置的一个重要局限性在于，组织切片未受到前负荷和后负荷的作用，且在不接触组织的情况下无法获得随时间变化的收缩情况的详细视图。本文所述方法降低了组织损伤或感染的风险。此外，当向培养体系中添加感兴趣的物质时，该方法能够全面观察收缩力可能发生的各种变...

在过去的十年中， 体外 心肌细胞的培养已取得重大进展，涵盖了从二维（2D）和三维（3D）技术到类器官以及诱导多能干细胞分化为心肌细胞的应用1,2,3. 离体 原代细胞培养已被证明具有重要价值，尤其在遗传学研究和药物开发领域4,5,6使用人体组织可提高研究结果的转化价值。然而，目前尚未建立成熟的心肌组织长期三维培养技术，尤其是保持组织完整几何形态的培养。完整的几何结构是模拟心肌组织生理特征的关键要素 体内 条件，因为正常的心脏功能、不同细胞之间的通讯以及细胞与基质的相互作用都是必要前提。心肌组织培养经历了多个发展阶段。其成功率与稳定性 离体 心肌组织培养的初始效率较低，但近期的方法已取得令人鼓舞的成果7,8,9,10,11.
其中，Fischer 等人首次证明，人类心肌组织的存活性和收缩功能可在体外长期维持 离体 长期细胞培养7他们的技术基于从移植的人类心肌中切取的薄层组织切片，这些切片被安置在新开发的培养室中，后者可提供明确的生物力学条件和持续的电刺激。该培养方法高度接近 体内 心肌组织的功能，并已被多个独立研究团队成功复现2,12,13,14,15重要的是，Fischer 等人所使用的腔室系统还能够对生成的力进行长达 4 个月的连续记录，从而为完整的人类心肌生理学和药理学研究开辟了前所未有的机遇7.
其他研究团队独立开发了类似技术，并将其应用于人、大鼠、猪和兔的心肌组织7,10,11。Pitoulis 等人随后开发出一种更具生理性的方法，可在收缩周期中重现正常的力-长度关系，但该方法较不适合高通量分析16。因此，仿生培养的总体策略可被视为在动物实验的减少、优化和替代（3R）方面迈出的进一步一步。
然而，发挥这一潜力需要标准化的操作流程、高内涵分析以及高通量水平。我们介绍一种将活体人人心肌的自动化切片与 体外 在已商业化的仿生培养系统中进行维持（参见 材料表采用该方法，单个透壁心肌标本可制备的组织切片数量仅受限于处理时间。一个大小和质量足够（3 cm × 3 cm）的标本通常可利用自动振动切片机方便地切割出20至40片组织切片。这些切片可被放置于系统配套的培养室中。培养室支持电刺激，其参数可调（如脉冲持续时间、极性、频率和电流），并可通过室内的弹簧丝调节前负荷和后负荷。每片组织的收缩通过附着在弹簧丝上的小磁铁的运动进行记录，并以可解读的图形形式显示。数据可随时记录，并使用免费软件进行分析。除持续的基础起搏外，还可执行预设的实验方案，以功能评估其不应期、刺激阈值、停搏后增强效应以及力-频率关系。
对单个心脏来源的多个心肌片进行长期仿生培养，为未来在人类和动物组织中开展离体（ex vivo）研究开辟了道路，并有助于心血管医学中治疗性和心脏毒性药物效应的筛选。该方法已应用于多种实验研究2,12,13,15。本文详细描述了人体组织制备的逐步操作流程，并提供了常见培养问题的解决方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Bay-K8644</td><td>Cayman Chemical</td><td>19988</td><td></td></tr><tr><td>BDM (2,3-丁二酮单肟)</td><td>Sigma</td><td>B0753-1kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*H2O</td><td>Merck</td><td>2382.1</td><td></td></tr><tr><td>Calciseptine</td><td>Alomone Labs</td><td>SPC-500</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖*H2O</td><td>AppliChem</td><td>A3730.0500</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>BBraun</td><td>3703452</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A1069.0500</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>BBraun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇 100%</td><td>SAV LP GmbH</td><td>UN1219</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X 补充剂</td><td>Gibco</td><td>5150056</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>AppliChem</td><td>A1036.0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4*H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td></td></tr><tr><td>硝苯地平</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 x100</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>AppliChem</td><td>A1108.0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Thermo Scientific</td><td>KS15</td><td></td></tr><tr><td>Frigomix 水泵及冷却装置 + BBraun Thermomix BM</td><td>BBraun</td><td></td><td>自制的冷却与加热组合系统</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Binder</td><td>CB240</td><td></td></tr><tr><td>MyoDish 培养系统</td><td>InVitroSys GmbH</td><td>MyoDish 1</td><td>Myodish 培养系统</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr><tr><td>37°C 水浴锅</td><td>Haake</td><td>SWB25</td><td></td></tr><tr><td>80°C 水浴锅</td><td>Daglef Patz KG</td><td>7070</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 塑料一次性烧杯</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>滤器，Steritop 快速释放型</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>针头 0.9 x 70 mm 20G</td><td>BBraun</td><td>4665791</td><td></td></tr><tr><td>塑料三角刮刀</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>Razor Derby premium</td><td>Derby Tokai</td><td>B072HJCFK6</td><td></td></tr><tr><td>Razor Gillette Silver Blue</td><td>Gillette</td><td>7393560010170</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀片</td><td>Feather</td><td>02.001.30.020</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 鲁尔接头注射器 BD Discardit</td><td>BBraun</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 3.5 cm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

人源心肌组织长期培养的制备

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

心肌细胞培养已取得众多进展，从二维（2D）细胞培养发展到诱导多能干细胞（iPSC）来源的类器官。2019年，研究人员展示了一种在体外（ex vivo）培养源自人类心脏样本心肌切片的方法，该方法更接近体内（in vivo）心肌收缩的生理条件。这些样本主要来源于心脏移植手术或左心室辅助装置植入术。利用振动切片机和专门开发的培养系统，将厚度为300 µm的切片置于一根固定丝和一根弹簧丝之间，从而实现数周内稳定且可重复的培养。在培养过程中，切片可根据个体化设置持续接受电刺激。收缩活动可实时显示并记录，药物也可方便地施加。用户可设定并执行自定义的刺激方案，以评估关键的收缩参数，如停搏后增强效应、刺激阈值、力-频率关系以及不应期。此外，该系统还支持可变的前负荷和后负荷设置，使培养条件更接近生理状态。
本文介绍了一种使用商用仿生培养液成功建立人类左心室心肌片长期培养的逐步操作指南。

将培养室插入相应的连接器后，心肌片的收缩情况会显示在计算机屏幕上（图3）。人源心肌片在受到刺激后立即开始收缩。在最初的5-10分钟内，心肌片出现过度收缩现象，表现为舒张期张力升高，这是由受损组织部分发生强直性收缩所致。该过程在1-1.5小时内不同程度地恢复。稳定后，人左心室（LV）组织片在刺激下产生的颤搐力介于1 mN至3 mN之间。收缩期表现为收缩力迅速显著上升，随后舒张期收缩力同样迅速下降。
心肌片的收缩由培养软件记录，并保存至指定文件中。每个生成的原始数据文件均被转换为可读的Axon二进制文件格式（.abf），以便于对数据进行分析和定量。在初步分析中，使用适当的程序打开.abf文件，并选取约5分钟的收缩数据，以确定该时间段内的平均收缩幅度。此操作针对记录数据文件中的多个时间点进行。将这些随时间变化的收缩值绘制成图，可得到用于比较对照组与实验组收缩发展情况的有用图表。为了更深入地了解所制备心肌片的功能表现，还进行了刺激方案实验。这些实验持续约45分钟，在此期间改变刺激参数，以评估收缩耦合的相关指标。
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我们提出了一种实验方案 离体 人室心肌组织的培养。它允许对收缩力和收缩动力学进行详细分析，并可施加前负荷和后负荷以模拟 在体 更接近生理环境。

心肌细胞培养已取得大量进展，从二维（2D）细胞培养发展到诱导多能干细胞（iPSC）来源的类器官。2019年，……

通过本方案，可在仿生腔室中对人类左心室组织切片进行离体培养。施加前负荷和后负荷可提高生理环境的模拟程度。该技术能够持续记录组织收缩情况。用户自定义的刺激方案可用于评估关键的收缩参数，如暂停后增强效应、刺激阈值、力-频率关系以及不应期。利用该装置对心肌片进行长期培养，将为未来的心血管离体研究铺平道路，促进心血管医学领域中治疗性药物及心脏毒性药物效应的筛选。首先，将培养室和石墨电极浸入一升10%异丙醇溶液中，并振荡过夜。第二天，将培养室转移至100%异丙醇溶液中处理3分钟，然后将培养室和石墨电极置于超净台中自然风干。根据摇床的可用位置，将电路板安装到每个培养室上。按照制造商的说明，将两个石墨电极放置在电路板上，然后在培养室上放置一个35毫米的培养皿盖，以防止污染。接下来，用切片缓冲液将切样盘填充至其容量的90%到95%。将组织样本转移至盛有冷切片缓冲液的100毫米培养皿中，并将培养皿置于4摄氏度的冷却板上。用镊子夹住心内膜，去除心内膜小梁，然后使用剪刀剪除约3毫米的心内膜组织。将切割的组织样本心内膜面向上，用四根0.9×70毫米的20号针固定在一块2×2厘米的橡胶补片上，针呈正方形排列。确保每根针尖的对角边缘朝内，以增强固定效果并防止损伤心肌。使用手术刀切除四个针位外侧的所有多余组织。使用镊子将修整好的样品置于无菌的组织纸上 10 秒钟，以去除多余的切片缓冲液。接着，将水浴中的琼脂糖注射器取出，把样品浸入琼脂糖中。将样品放在冷却板上静置 5 分钟，使琼脂糖凝固。在琼脂糖中必须能够看到样本的心内膜面。使用镊子将含有样本的琼脂糖块的心外膜面放置在已涂胶的区域上，然后用钝头工具从顶部轻轻按压含样本的琼脂糖块，注意不要切割或损坏琼脂糖。让胶水固化1分钟。将振动幅度设为1毫米，初始切割速度设为0.07毫米每秒，切片厚度设为300微米。将培养系统连接至计算机后，启动相应的软件程序。设置摇床转速为60转每分钟，并预设刺激参数。对于人源心脏切片，将标准刺激设置为双相脉冲，电流为50毫安，包含3毫秒的正向电流、1毫秒的暂停，以及3毫秒的反向电流脉冲，起搏频率为每分钟30次（bpm）。随后检查软件中的电极指示器，确认培养室的电极工作正常。使用镊子将琼脂糖与组织分离。避免触碰组织，并小心操作，因为任何组织损伤都会降低培养的成功率。将两个塑料三角形固定在样品上时，先在无菌培养皿盖上放置1微升胶水。使用弯头镊子夹取一个经过高压灭菌的塑料三角形，迅速将三角形的前缘浸入胶水中，然后将其垂直于心肌细胞排列方向粘贴到样品上。对另一个三角形区域重复上述操作。使用手术刀修剪掉超出三角形范围的组织，将含有两个已固定组织片的切片放回盛有切片缓冲液的切片托盘中。从培养箱中取出装有培养基的培养室。选择一个制备好的切片，通过将每个三角形连接到对应的针脚上，将其插入到孵育 chamber 中。根据样本大小调整固

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

长期培养用人心肌组织的制备

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成年小鼠心肌细胞的分离与培养用于细胞信号转导研究 体外 心脏肥大

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人源心肌组织长期培养的制备

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