Name: 用于鉴定裂殖酵母多拷贝抑制因子的遗传筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 了解多拷贝抑制因子遗传筛选方法，用于鉴定裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中与ell1基因缺失相关的遗传抑制因子。该技术有助于揭示基因功能和保守的生物学通路。

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本工作由印度政府生物技术部的研究基金资助（项目编号：BT/PR12568/BRB/10/1369/2015），授予Nimisha Sharma。作者感谢美国波士顿学院的Charles Hoffman教授惠赠S. pombe cDNA文库，以及Susan Forsburg教授惠赠酵母质粒。

1.&#160;将cDNA文库转化至查询用S. pombe突变株中以筛选高拷贝抑制子
注意：采用标准的醋酸锂法27将 S. pombe cDNA 文库转化至查询菌株 S. pombe ell1Δ 中，仅进行了少量修改：
<ol>
	<li>培养 S. pombe ell1Δ 菌株在32 °C的YE培养基上表1) 平板，补充 225 µg/mL 腺嘌呤、亮氨酸和尿嘧啶。用一环接种物接种 ell1从上述平板中挑取Δ菌株，接种于15–20 mL添加有腺嘌呤、亮氨酸和尿嘧啶（各225 µg/mL）的YE培养基中，于32 °C振荡培养（200–250 rpm）过夜。</li>
	<li>次日，将过夜培养物用100 mL新鲜YE培养基稀释，并加入所需的补充物，调整至相应的OD600 nm （600 nm 处的光密度）达到 0.3，然后在 200–250 rpm 振荡条件下于 32 °C 继续培养至 OD600 nm 进入对数中期。</li>
	<li>将100 mL培养液分装至两个50 mL离心管中，在室温下以4,000 × g离心10 min g.</li>
	<li>弃去上清液，用 1 mL 无菌水洗涤细胞沉淀，即在 1 mL 无菌水中重悬细胞，于 4,000 × g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，按照步骤1.4所述，用1 mL 1x LiAc-TE（100 mM醋酸锂，10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.5）溶液洗涤每个细胞沉淀。</li>
	<li>移去上清液，将每份细胞沉淀重悬于 250 µL 1x LiAc-TE 中。使用这些 S. pombe 用于转化目的DNA的500 µL感受态细胞。将125 µL感受态细胞分装至四个不同的无菌微量离心管中，用于后续转化步骤。</li>
	<li>将鲑鱼精或鲱鱼精子的载体DNA煮沸1分钟，立即置于冰上。每次转化向含有125 µL感受态细胞的微量离心管中加入10 µL变性的单链载体DNA（10 mg/mL），用移液器枪头轻轻混匀。随后，加入50 µg的 S. pombe 将cDNA文库加入含有感受态细胞和载体DNA的微量离心管中。</li>
	<li>将微量离心管在室温下孵育10分钟，然后向管中加入260 µL聚乙二醇-醋酸锂溶液（40% [w/v] PEG 4,000，100 mM 醋酸锂，10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.5），并用移液器吸头轻轻混匀。</li>
	<li>将含有转化混合物的微量离心管在32 °C下孵育2 h，期间不振荡。向微量离心管中加入43 µL预热的二甲基亚砜（DMSO），轻轻混匀。随后将离心管置于42 °C下进行热激处理5 min。</li>
	<li>在 4,000 × g 条件下离心收集细胞 g 室温孵育5分钟。弃去上清液，并用移液器吸头吸除残留的PEG-LiAc-TE溶液。</li>
	<li>将细胞重悬于 100 µL 无菌水中，并涂布于一块 EMM2 培养基上表1) 培养皿（150 mm），加入所需补充物和 0.2 µg/mL 的 4-NQO。</li>
	<li>将平板置于32 °C培养5-6天，使菌落生长可见。挑取获得的菌落，在含有0.2 µg/mL 4-NQO的相同培养基平板上划线培养，用于后续筛选。</li>
	<li>对于一次文库转化实验，按照上述步骤1.8至1.14所述，使用500 µL感受态细胞（将125 µL感受态细胞分装至4个微量离心管中）进行转化。</li>
	<li>作为对照，接种1/10th 将转化混合物涂布于一个不含4-NQO但含有必要补充成分的EMM2平板（150 mm）上，用于计算转化后获得的文库克隆总数，并筛选分离抑制子克隆。</li>
</ol>
2.&#160;通过假定的抑制因子验证和测试查询突变株相关表型的挽救/抑制
注意：应激斑点实验按以下所述进行，以检测并验证假定的抑制因子对ell1缺失相关4-NQO应激敏感性的挽救或抑制作用。
<ol>
	<li>在无菌96孔微孔板的不同孔中各加入100–200 µL无菌水。</li>
	<li>使用无菌牙签或20–200 μL移液器吸头，从含有4-NQO的平板上经cDNA文库转化后获得的不同菌落中挑取少量接种物。将各个不同菌落的接种物分别加入含有100–200 µL无菌水的微孔板独立孔中，充分混匀。</li>
	<li>将每个孔中的细胞悬液各取3 µL点种于含有腺嘌呤（225 µg/mL）和尿嘧啶（225 µg/mL）但缺乏亮氨酸（本研究所用文库构建质粒载体上的可筛选营养缺陷型标记）的EMM2琼脂平板上。根据需要在平板中添加适当浓度的4-NQO。</li>
	<li>将平板在32 °C下培养3–4天，使细胞生长。鉴定在不同浓度4-NQO存在下能够生长的菌落，作为潜在的抑制子。</li>
	<li>为进一步验证这些抑制子，将筛选出的抑制子与适当的对照菌株一起，在含有腺嘌呤和尿嘧啶各225 µg/mL但缺乏亮氨酸的EMM2培养基中，于32 °C振荡（200–250 rpm）过夜培养。</li>
	<li>次日，用新鲜EMM2培养基将细胞稀释至OD600 nm为0.3，并在32 °C振荡培养至对数中期（OD600 nm约0.6–0.8）。</li>
	<li>将培养物进行适当倍数的连续稀释（1:10或1:5），点种于含有所需补充成分并添加0.4 µM 4-NQO或0.01% MMS的EMM2平板上。作为对照，将菌株点种于含有所需补充成分但不含任何DNA损伤剂的EMM2平板上。</li>
	<li>将平板在32 °C下培养3–5天，观察生长情况。 
	注意：应根据查询突变株相关的表型选择合适的检测方法，以测试表型的挽救或抑制效果。例如，若需鉴定某查询突变株冷敏感表型的抑制子，则对抑制子克隆的检测与验证实验应包括在低温条件下培养转化子。</li>
	<li>将分别携带目的全长基因（本例中为Spell1）或空载体的突变株作为阳性对照和阴性对照，与文库转化子一同点种。</li>
</ol>
3.&#160;从 S. pombe 抑制子克隆中分离质粒
注意：裂殖酵母（S. pombe）质粒提取参照《裂殖酵母：实验室手册》28 中描述的方案，并进行了若干修改。
<ol>
	<li>挑取单个酵母菌落接种于含有225 µg/mL腺嘌呤和尿嘧啶的EMM2培养基中，于32 °C、200-250 rpm振荡条件下过夜培养。次日，取5 O.D.的菌体（即10 mL、O.D.为0.5的培养物），在室温下以4,000 × g离心2分钟收集细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将菌体沉淀重悬于0.2 mL裂解缓冲液（2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris HCl（pH 8.0）和1 mM Na2EDTA）中。</li>
	<li>向微量离心管中加入0.2 mL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）和0.3 g酸洗玻璃珠。在4 °C下涡旋振荡2分钟，然后冰上孵育1分钟。重复此步骤6次。</li>
	<li>在室温下以10,000 × g离心15分钟。将上层水相转移至新的微量离心管中，加入200 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。</li>
	<li>以10,000 × g离心10分钟。将上层水相转移至另一新管中，加入两倍体积的100%乙醇（约400 µL）和十分之一体积的醋酸钠（3 M，pH 5.8）（约20 µL）。将微量离心管置于-70 °C孵育1小时。</li>
	<li>在4 °C下以10,000 × g离心15分钟沉淀DNA，弃去上清液。用70%乙醇（约500 µL）洗涤DNA沉淀，并在室温下晾干。</li>
	<li>将DNA重悬于20 µL无菌水中。取2-5 µL质粒DNA用于感受态E. coli细胞的转化。 
	注意：也可使用市售的任一种酵母质粒提取试剂盒从酵母细胞中分离质粒。</li>
</ol>
4.&#160;鉴定抑制克隆所编码的基因
<ol>
	<li>将分离的酵母质粒转化进入 大肠杆菌 Top10 感受态细胞 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG]，采用标准操作程序29 在含有相应抗生素的LB（Luria Broth）培养基平板上涂布细胞。</li>
	<li>从……中分离质粒 E. coli 使用标准碱裂解法转化子29，并采用相应组合的限制性内切酶进行酶切，以检测插入DNA片段是否成功释放。 
	注意：抑制质粒84用 BamHI限制性内切酶，抑制质粒104用 PstI/BamHI限制性内切酶</li>
	<li>将限制性消化后显示插入片段释放的质粒重新转化 ell1Δ 型菌株，以检测其是否能够挽救基因毒性应激敏感表型 ell1Δ 菌株</li>
	<li>选择能够抑制基因毒性应激敏感性的质粒克隆，并使用载体特异性的正向和反向引物对这些质粒克隆中插入的DNA片段进行测序。 
	注意：在本研究中， adh1 使用了启动子特异性的通用正向引物（5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3'）30.</li>
	<li>为确定负责抑制作用的基因，使用 NCBI 核苷酸 blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn）对获得的序列进行比对&amp;#38;BLAST_SPEC=GeoBlast&amp;#38;PAGE_TYPE=BlastSearch）或 Pombase 序列比对工具（https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core）。选择显示最高比对程度的序列，并将其鉴定为多拷贝抑制质粒的基因。</li>
</ol>

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作者无利益冲突。

酵母已被广泛用于研究在真核生物中进化上保守的基本生物学过程和通路。由于其具备丰富的遗传学和基因组学工具，并且适用于多种生物化学、遗传学和分子生物学实验操作，酵母成为遗传学研究的优良模式生物34,35,36。多年来，酵母研究人员设计了多种遗传筛选方法，用以鉴定基因间的遗传相互作用，从而揭示单个基因（或多个基因）的功能及其可能参与的通路和生物学过程10,11,17,37。其中一种常见且有用的筛选方法称为“多拷贝抑制”或“高拷贝数抑制”。
该筛选方法需要一种表现出功能缺失表型的查询突变菌株，随后将该突变菌株用高拷贝数的基因组文库或cDNA文库进行转化...

基因相互作用网络提供了关于基因的功能信息，并阐明了这些基因可能参与的通路和生物学过程 体内此外，它们还可能揭示不同基因之间如何相互作用，从而产生特定的表型。1,2,3多年来，研究人员设计了多种遗传筛选方法，以回答基本的生物学问题并研究人类疾病。用于鉴定基因相互作用的筛选可通过多种方式开展。不同遗传筛选中鉴定出的基因相互作用可能代表基因之间不同的机制性关系。此外，研究发现，编码属于同一通路或复合物蛋白的基因，往往共享一组常见的基因相互作用。4,5因此，基因互作网络可用于建立细胞内的功能组织结构，其中具有最相似图谱的基因属于同一复合物或通路，相似性稍低的基因属于同一生物学过程，而图谱存在重叠但更为多样的基因则反映属于同一细胞区室的成员6.
基于剂量抑制（“高拷贝或多重拷贝抑制”）的遗传互作筛选是常用的方法之一。这些筛选可通过将待测突变菌株转化入高拷贝数的基因组文库或cDNA文库，随后采用适当的检测或筛选技术，以鉴定出具有抑制或增强作用的遗传互作7,8,9。为确保全基因组范围的全面覆盖，这些筛选也可通过在一组全基因组功能缺失突变体中过表达特定目的基因，或在功能缺失的待测突变体中过表达高拷贝质粒携带的基因组文库或cDNA文库来实现9,10,11,12,13,14,15。多重拷贝策略还可结合可调控启动子，采用显性/过表达策略实现。
使用基于抑制子的筛选方法的主要优势在于，通过另一个基因抑制突变菌株中已存在的表型，可以确立这两个基因产物之间的遗传关系，而这种关系可能无法通过其他方法得以证明。其次，已有研究发现，预先存在的突变会使特定通路变得敏感，从而可通过分离抑制子来鉴定该通路中的其他组分，而这些组分可能无法通过更直接的遗传筛选方法被识别。此外，该筛选方法还可用于鉴定具有不同抑制机制的抑制子16。抑制子相互作用通常发生在功能相关的基因之间，可用于阐明通路中的层级关系。抑制作用的具体潜在机制可能因多种因素而异，包括筛选中所使用的查询突变体类型、实验条件以及基因表达水平。一种常见的剂量抑制机制涉及编码在同一复合物中协同作用或在同一细胞/生物学过程中平行作用的产物的基因。在酵母等较为简单的模式生物中进行此类筛选所获得的结果可推广至更高等的真核生物，因为大多数基本的生物学通路和过程在进化过程中是保守的。
这些遗传筛选方法也可以通过多种方式进行改造，以回答不同的生物学问题。例如，可以鉴定来自不同生物体的同源基因，这些基因能够抑制查询突变株的表型。该方法还已被用于阐明潜在的耐药机制，并确定新型抗菌17,18、抗真菌19,20、抗寄生虫21和抗癌22化合物的蛋白靶点。此外，该筛选方法还可用于鉴定药理活性未知的药物作用的抑制因子。因此，原则上，这些多拷贝抑制子筛选方法可在不同生物体的多种应用中进行优化和使用。尽管酵母研究人员所采用的大多数遗传筛选最初都是在S. cerevisiae中建立的，但&#160;S. pombe已发展成为执行各种遗传筛选和检测的互补模型系统23。此外，S. pombe在基因组组织和生物学&#160;过程方面，如更多基因含有内含子、DNA复制起点的复杂性、着丝粒结构、细胞周期的调控以及RNA干扰&#160;机制的存在，与高等真核生物具有更高的相似性23,24，这凸显了在S. pombe中设计和使用遗传工具的重要性&#160;。
本文介绍了一种基于“剂量抑制”方法在S. pombe中鉴定遗传互作因子的实验方案。该方案的核心在于，通过多拷贝质粒和/或强启动子过表达野生型基因，从而快速高效地筛选cDNA文库。本方案包含四个主要步骤：将文库转化至目标功能缺失突变株中，筛选能够抑制该突变株特定表型的质粒克隆，从这些抑制子克隆中回收质粒，以及鉴定负责表型抑制的基因。与所有基于从文库中筛选和鉴定cDNA的方法一样，筛选的成功依赖于使用高质量且复杂度高的文库，因为该筛选只能获得文库中实际存在的cDNA克隆。
利用本实验方案，我们已成功鉴定出两种新的抑制因子，可抑制查询菌株对基因毒性应激敏感的表型 S. pombe ell1 无效突变体。ELL（Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia）转录延伸因子家族可抑制RNA聚合酶II在DNA模板上的短暂暂停 体外 生化检测方法，并且在从裂殖酵母到人类的多种生物体中均保守存在25早期的研究已提供证据表明 S. pombe ell1 缺失突变体在4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）和甲基磺酸甲酯（MMS）存在下表现出基因毒性应激敏感性26因此，我们转化了一个 S. pombe 质粒编码的多拷贝cDNA文库转入待测样本 S. pombe ell1 无效突变体，并鉴定出两个假定的克隆，它们表现出抑制该基因毒性应激敏感性的能力 S. pombe ell1 在存在4-NQO（一种可诱导DNA损伤的化合物）的条件下，该基因的空突变体。随后对质粒克隆中插入片段进行测序，鉴定出编码 rax2+ 和 osh6+ 负责抑制基因毒性应激敏感性 ell1 过表达时的无效突变体 ell1 无效突变体

<table><tbody><tr><td>4-NQO</td><td>Sigma</td><td>N8141</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma</td><td>1371301000</td><td></td></tr><tr><td>硫酸腺嘌呤</td><td>Himedia</td><td>GRM033</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Himedia</td><td>GRM026</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004L</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Himedia</td><td>MB054</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Fermentas</td><td>ER0051</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Himedia</td><td>RM095</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Himedia</td><td>MB007</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>氯仿:异戊醇 24:1</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Himedia</td><td>RM1023</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Himedia</td><td>GRM3960</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精单链DNA</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠</td><td>Sigma</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>六水合三氯化铁</td><td>Himedia</td><td>RM6353</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Amresco</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Himedia</td><td>GRM102</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Qualigen</td><td>Q26897</td><td></td></tr><tr><td>亮氨酸</td><td>Himedia</td><td>GRM054</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂</td><td>Sigma</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>钼酸</td><td>Himedia</td><td>RM690</td><td></td></tr><tr><td>烟酸</td><td>Himedia</td><td>CMS177</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇，分子量 4000</td><td>Sigma</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>泛酸</td><td>Himedia</td><td>TC159</td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Himedia</td><td>MB082</td><td></td></tr><tr><td>质粒提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二甲酸氢钾</td><td>Merc</td><td>DDD7D670815</td><td></td></tr><tr><td>碘化钾</td><td>Himedia</td><td>RM1086</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Himedia</td><td>GRM205</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Himedia</td><td>GRM1183</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>Himedia</td><td>RM1037</td><td></td></tr><tr><td>Tris游离碱</td><td>Himedia</td><td>MB209</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Himedia</td><td>GRM264</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物粉末</td><td>Himedia</td><td>RM668</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸锌</td><td>Merc</td><td>DJ9D692580</td><td></td></tr></tbody></table>

遗传筛选鉴定裂殖酵母（schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

鉴定基因相互作用是解析基因功能的有力工具，可揭示基因与其他基因之间的功能关系及其在生物通路和生物过程中的组织方式。尽管大多数遗传筛选最初是在Saccharomyces cerevisiae中开发的，但Schizosaccharomyces pombe为开展此类遗传筛选提供了互补的研究平台。用于鉴定基因相互作用的常用方法之一，是在功能缺失突变体中利用全基因组范围的高拷贝质粒文库进行克隆过表达，随后筛选能够抑制突变表型的克隆。
本文描述了一种在 S. pombe 中进行基于“多拷贝抑制”的遗传筛选实验方案。该筛选有助于鉴定与 S. pombe 中转录延伸因子 Ell1 缺失相关的基因毒性应激敏感表型的多拷贝抑制子。筛选首先通过将待测的 ell1 空白突变菌株转化入一个高拷贝数的 S. pombe cDNA 质粒文库，并在含有4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO，一种可诱导基因毒性应激的化合物）的 EMM2 平板上筛选出抑制子。随后，从两个初筛获得的抑制子克隆中分离质粒，并用限制性内切酶消化以释放插入的 DNA 片段。将能够释放插入片段的质粒重新转化至 ell1 缺失菌株中，以验证这些抑制性质粒克隆是否能在4-NQO及其他基因毒性化合物存在条件下恢复 ell1 缺失突变体的生长能力。对那些能够挽救缺失表型的质粒进行测序，以鉴定出负责抑制 ell1 缺失所致基因毒性应激敏感表型的基因。

筛选多拷贝抑制因子 ell1 缺失相关基因毒性应激敏感性 S. pombe 
我们采用上述方案进行遗传筛选，以鉴定查询基因功能缺失表型的多拷贝抑制子 ell1 缺失突变菌株。生长相关的敏感性 ell1 在存在基因毒性试剂4-NQO的条件下，缺失菌株所表现出的表型被用作功能缺失表型，以筛选多拷贝抑制因子。 图1 展示了遗传筛选的示意图。筛选开始时，检测遗传毒性应激敏感性 ell1 缺失突变体（h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1） ell1&#916; :: kanMX6）首先在4-NQO存在条件下，相对于其同基因型野生型菌株（h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1）进行了验证图2A。随后，该查询 <e...

本研究描述了一种在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中进行多拷贝抑制子遗传筛选的实验方案。该筛选利用全基因组范围的质粒文库，鉴定能够抑制查询突变株功能缺失表型的抑制子克隆。通过此筛选方法，鉴定了ell1基因缺失突变体的新遗传抑制子。

遗传筛选鉴定裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

鉴定基因相互作用是解析基因功能的有力工具，可通过揭示其功能关系来深入了解基因的作用机制……

抑制子筛选可鉴定出能够揭示目的基因功能及其在体内可能参与的通路和生物学过程的遗传相互作用。该技术能够发现两种基因产物之间的遗传关系，而这些关系可能无法通过其他方法得以证实。在酵母中进行此类筛选所获得的结果可推广至高等真核生物，因为大多数基本的生物学通路和过程在进化过程中是保守的。该方案的成功取决于高质量质粒的可获得性及其向酵母细胞高效转化的能力。因此，在转化之前，需先将裂殖酵母 ell1 基因敲除菌株在 32°C 条件下于 YE 培养基平板上培养。用接种环从平板上取一环 ell1 突变菌株，接种至 5 毫升补充型 YE 液体培养基中，然后在 32°C 摇床中过夜培养。孵育后，将过夜培养物稀释至含有所需补充物的新鲜YE培养基100毫升中，使600纳米处的光密度达到0.3。在32摄氏度下振荡培养（转速为200至550转/分钟），直至600纳米处的光密度达到对数中期。将100毫升培养物分装至两个50毫升离心管后，在室温下以4,000 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升无菌水中。离心后再次弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于1毫升醋酸锂TE缓冲液中。通过离心收集细胞，再将每份细胞沉淀重悬于250微升醋酸锂TE缓冲液中。接着，将125微升感受态细胞分别转移至四个不同的无菌微量离心管中，用于后续转化步骤。将鲑鱼精或鲱鱼精子的载体DNA煮沸1分钟，随即置于冰上冷却。每次转化时，向含有125微升感受态细胞的微量离心管中加入10微升单链载体DNA，并用移液器轻轻混匀。随后，向含有感受态细胞和载体DNA混合物的管中加入50微克裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）cDNA文库。将该管在室温下孵育10分钟后，加入260微升聚乙二醇-醋酸锂溶液，并用移液器混匀。将含有转化混合物的离心管在32摄氏度下孵育两小时，期间不振荡。向离心管中加入43 µL预热的二甲基亚砜，轻轻混匀。随后，将离心管置于42摄氏度下进行热激处理，持续五分钟。离心收集细胞，弃去上清液，操作方法如前所述，然后用移液器吸出残留的聚乙二醇-醋酸锂-TE 溶液。用 100 微升无菌水重悬细胞，将其接种于一个含有所需补充成分和 0.2 微克/毫升 4-NQO 的 EMM2 培养皿上。随后，将培养皿置于 32 摄氏度条件下培养 5 至 6 天，使菌落生长出现。为进一步筛选，将获得的菌落划线接种于含有 0.2 微克/毫升 4-NQO 的相同培养基平板上。对于一次文库转化实验，使用 500 微升感受态细胞进行转化，并将转化混合物的十分之一涂布于含有必要补充成分但不含 4-NQO 的 EMM2 平板，以计算转化后获得的文库克隆总数，并用于筛选抑制子克隆。向无菌 96 孔微孔板的每孔中加入 100 至 200 微升无菌水。使用无菌牙签或20至200微升移液器吸头，从含有4-NQO的平板上经cDNA文库转化后获得的每个菌落中挑取少量接种物。将不同菌落的接种物分别加入含有无菌水的平板的各个孔中，并充分混匀。从每孔中取3微升细胞悬液，点种到EMM2琼脂平板上，并向平板中加入适当浓度的4-NQO。在32摄氏度下培养细胞三至四天后，鉴定在不同浓度4-NQO中能够生长的菌落，这些菌落可能为抑制子。为进一步验证这些抑制子，将筛选出的抑制子菌株及相应的对照菌株接种于含有225微克/毫升腺嘌呤和尿嘧啶的EMM2培养基中，在32摄氏度下振荡培养过夜。培养结束后，用新鲜EMM2培养基将细胞稀释至光密度（OD）为0.3，并在32摄氏度下振荡培养至对数中期。将培养物进行适当的系列稀释后，点种于含有0.4微摩尔4-NQO或0.01% MMS并添加了所需补充物的EMM2平板上。作为对照，将菌株点种于含有所需补充物但不含任何DNA损伤剂的EMM2平板上。将平板在32摄氏度下培养3至5天，以观察生长情况。将含有目的基因全长序列的突变株以及空载体分别作为阳性和阴性对照，与文库转化子一同点样。在含有每毫升225微克腺嘌呤和尿嘧啶的EMM2培养基中接种单个酵母菌落，于32摄氏度、200至250 RPM振荡条件下过夜培养细胞。培养结束后，取光密度为0.5的10毫升培养物，在室温下以4,000 × g离心2分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 0.2 毫升裂解缓冲液中。向微量离心管中加入 0.2 毫升苯酚-氯仿-异戊醇和 0.3 克酸洗玻璃珠。涡旋振荡管子 2 分钟以混匀，随后冰上孵育 1 分钟。在室温下以10,000 × g离心试管15分钟。将上层水相转移至新的微量离心管中，并加入200 µL苯酚-氯仿-异戊醇。再次以10,000 × g离心10分钟后，将上层水相转移至另一新管中。然后，向离心管中加入两倍体积的100%乙醇和十分之一体积的乙酸钠，在零下70摄氏度下孵育1小时。在4摄氏度下以10,000 × g离心15分钟，沉淀DNA，并弃去上清液。用70%乙醇洗涤DNA沉淀，室温下空气干燥。将DNA重悬于20微升无菌水中，取3至5微升质粒DNA用于转化感受态的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞。按照标准操作流程，将分离得到的酵母质粒转化至大肠杆菌TOP10菌株中，并将细胞涂布于含有相应抗生素的LB平板上。使用标准的碱裂解法从大肠杆菌转化子中提取质粒后，选择适当的限制性内切酶组合进行酶切反应，以验证目的DNA片段是否被成功释放。接下来，将经限制性消化后在 ell1 缺失菌株中显示出插入片段释放的质粒重新转化，以检测其是否能够挽救 ell1 缺失菌株对基因毒性应激的敏感表型。与野生型菌株相比，ell1 缺失的粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）菌株对 4-NQO 表现出敏感性。在不含 4-NQO 的平板上可获得大量菌落。然而，在4-NQO平板上获得的转化子较少，因为它们作为惩罚性抑制因子，抑制了ell1缺失突变体对4-NQO的敏感性。在620个转化子中，有74个在0.4-微摩尔4-NQO条件下表现出生长能力。观察发现，这74个转化子中仅有16个在0.8-微摩尔4-NQO存在下能够生长。携带空载体的ell1缺失菌株以及全部16个转化子均在缺乏4-NQO的平板上表现出生长。仅含有空载体的ell1缺失突变体在0.8 µM 4-NQO条件下不生长，而六个转化子在0.8 µM 4-NQO条件下能够生长，表明这些转化子中存在的文库克隆可能抑制了ell1缺失突变体的基因毒性应激表型。对抑制性质粒84和104进行限制性酶切，分别释放出约1 kb和800 bp的插入片段。将抑制性质粒克隆重新导入ell1缺失突变体后，可抑制其对4-NQO相关的生长敏感性。然而，在MMS存在条件下，携带ell1缺失突变的抑制性质粒的菌株生长优于含空载体的菌株。此类遗传筛选可用于阐明潜在的耐药机制，并鉴定新型抗菌、抗真菌、抗寄生虫或抗癌化合物的作用蛋白靶点。他们还可以确定药物的作用机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于鉴定裂殖酵母多拷贝抑制因子的遗传筛选

我们已开发出全面且无偏倚的全基因组筛选方法，以研究基因-药物和基因-环境之间的相互作用。本文介绍了对这些突变体文库进行筛选的方法。...

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本文介绍了一种在芽殖酵母中定义化学-遗传相互作用的经济高效方法。该方法基于酵母分子生物学的基本技术，非常适合对小到中等规模的化合物库及其他培养环境进行机制性研究。...

快速鉴定化学遗传相互作用 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

抗应激能力是长寿的标志性特征之一，已知其受遗传因素调控。在此，我们开发了一种无偏倚的高通量方法，用于筛选赋予胚胎干细胞抗应激能力的突变，从而建立用于长寿研究的小鼠模型。...

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基于蛋白质遗传的高通量筛选 S. cerevisiae

我们介绍一种在裂殖酵母中进行的简单抑制子筛选方案。该方法高效且无需诱变，  选择性  用于  突变  经常  发生于   a  单个  基因组的  位点...

一种利用深度测序辅助的裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe自发抑制子筛选方法

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以靶向关键的生物学过程。确定细菌效应蛋白所靶向的宿主通路，是阐明分子致病机制的关键。本文介绍了一种利用改良的酵母抑制和毒性筛选方法，以揭示有毒细菌效应蛋白所靶向的宿主通路。...

利用酵母毒性及抑制子筛选鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路

以下是一种通过增加拷贝数抑制子筛选来鉴定基因相互作用的实验方案，适用于酿酒酵母（Saccharomyces...

一种用于表征调控线虫时序性寿命遗传关联的抑制子筛选方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，通过基因组分析和功能基因组筛选，鉴定并比较在基因工程小鼠模型中以及相应人类肿瘤类型中发生的肿瘤的治疗靶点。...

利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

明暗交替实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细介绍了我们进行该实验的具体操作步骤。...

小鼠明暗转换实验

了解多拷贝抑制因子遗传筛选方法，用于鉴定裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中与ell1基因缺失相关的遗传抑制因子。该技术有助于揭示基因功能和保守的生物学通路。

遗传筛选鉴定裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

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