遗传筛选鉴定裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

抑制子筛选可鉴定出能够揭示目的基因功能及其在体内可能参与的通路和生物学过程的遗传相互作用。该技术能够发现两种基因产物之间的遗传关系，而这些关系可能无法通过其他方法得以证实。在酵母中进行此类筛选所获得的结果可推广至高等真核生物，因为大多数基本的生物学通路和过程在进化过程中是保守的。

该方案的成功取决于高质量质粒的可获得性及其向酵母细胞高效转化的能力。因此，在转化之前，需先将裂殖酵母 ell1 基因敲除菌株在 32°C 条件下于 YE 培养基平板上培养。用接种环从平板上取一环 ell1 突变菌株，接种至 5 毫升补充型 YE 液体培养基中，然后在 32°C 摇床中过夜培养。

孵育后，将过夜培养物稀释至含有所需补充物的新鲜YE培养基100毫升中，使600纳米处的光密度达到0.3。在32摄氏度下振荡培养（转速为200至550转/分钟），直至600纳米处的光密度达到对数中期。将100毫升培养物分装至两个50毫升离心管后，在室温下以4,000 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升无菌水中。离心后再次弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于1毫升醋酸锂TE缓冲液中。通过离心收集细胞，再将每份细胞沉淀重悬于250微升醋酸锂TE缓冲液中。接着，将125微升感受态细胞分别转移至四个不同的无菌微量离心管中，用于后续转化步骤。将鲑鱼精或鲱鱼精子的载体DNA煮沸1分钟，随即置于冰上冷却。

每次转化时，向含有125微升感受态细胞的微量离心管中加入10微升单链载体DNA，并用移液器轻轻混匀。随后，向含有感受态细胞和载体DNA混合物的管中加入50微克裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）cDNA文库。将该管在室温下孵育10分钟后，加入260微升聚乙二醇-醋酸锂溶液，并用移液器混匀。

将含有转化混合物的离心管在32摄氏度下孵育两小时，期间不振荡。向离心管中加入43 µL预热的二甲基亚砜，轻轻混匀。随后，将离心管置于42摄氏度下进行热激处理，持续五分钟。

离心收集细胞，弃去上清液，操作方法如前所述，然后用移液器吸出残留的聚乙二醇-醋酸锂-TE 溶液。用 100 微升无菌水重悬细胞，将其接种于一个含有所需补充成分和 0.2 微克/毫升 4-NQO 的 EMM2 培养皿上。随后，将培养皿置于 32 摄氏度条件下培养 5 至 6 天，使菌落生长出现。

为进一步筛选，将获得的菌落划线接种于含有 0.2 微克/毫升 4-NQO 的相同培养基平板上。对于一次文库转化实验，使用 500 微升感受态细胞进行转化，并将转化混合物的十分之一涂布于含有必要补充成分但不含 4-NQO 的 EMM2 平板，以计算转化后获得的文库克隆总数，并用于筛选抑制子克隆。向无菌 96 孔微孔板的每孔中加入 100 至 200 微升无菌水。

使用无菌牙签或20至200微升移液器吸头，从含有4-NQO的平板上经cDNA文库转化后获得的每个菌落中挑取少量接种物。将不同菌落的接种物分别加入含有无菌水的平板的各个孔中，并充分混匀。从每孔中取3微升细胞悬液，点种到EMM2琼脂平板上，并向平板中加入适当浓度的4-NQO。

在32摄氏度下培养细胞三至四天后，鉴定在不同浓度4-NQO中能够生长的菌落，这些菌落可能为抑制子。为进一步验证这些抑制子，将筛选出的抑制子菌株及相应的对照菌株接种于含有225微克/毫升腺嘌呤和尿嘧啶的EMM2培养基中，在32摄氏度下振荡培养过夜。培养结束后，用新鲜EMM2培养基将细胞稀释至光密度（OD）为0.3，并在32摄氏度下振荡培养至对数中期。

将培养物进行适当的系列稀释后，点种于含有0.4微摩尔4-NQO或0.01% MMS并添加了所需补充物的EMM2平板上。作为对照，将菌株点种于含有所需补充物但不含任何DNA损伤剂的EMM2平板上。将平板在32摄氏度下培养3至5天，以观察生长情况。

将含有目的基因全长序列的突变株以及空载体分别作为阳性和阴性对照，与文库转化子一同点样。在含有每毫升225微克腺嘌呤和尿嘧啶的EMM2培养基中接种单个酵母菌落，于32摄氏度、200至250 RPM振荡条件下过夜培养细胞。培养结束后，取光密度为0.5的10毫升培养物，在室温下以4,000 × g离心2分钟收集细胞。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 0.2 毫升裂解缓冲液中。向微量离心管中加入 0.2 毫升苯酚-氯仿-异戊醇和 0.3 克酸洗玻璃珠。涡旋振荡管子 2 分钟以混匀，随后冰上孵育 1 分钟。

在室温下以10,000 × g离心试管15分钟。将上层水相转移至新的微量离心管中，并加入200 µL苯酚-氯仿-异戊醇。再次以10,000 × g离心10分钟后，将上层水相转移至另一新管中。

然后，向离心管中加入两倍体积的100%乙醇和十分之一体积的乙酸钠，在零下70摄氏度下孵育1小时。在4摄氏度下以10,000 × g离心15分钟，沉淀DNA，并弃去上清液。用70%乙醇洗涤DNA沉淀，室温下空气干燥。

将DNA重悬于20微升无菌水中，取3至5微升质粒DNA用于转化感受态的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞。按照标准操作流程，将分离得到的酵母质粒转化至大肠杆菌TOP10菌株中，并将细胞涂布于含有相应抗生素的LB平板上。使用标准的碱裂解法从大肠杆菌转化子中提取质粒后，选择适当的限制性内切酶组合进行酶切反应，以验证目的DNA片段是否被成功释放。

接下来，将经限制性消化后在 ell1 缺失菌株中显示出插入片段释放的质粒重新转化，以检测其是否能够挽救 ell1 缺失菌株对基因毒性应激的敏感表型。与野生型菌株相比，ell1 缺失的粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）菌株对 4-NQO 表现出敏感性。在不含 4-NQO 的平板上可获得大量菌落。

然而，在4-NQO平板上获得的转化子较少，因为它们作为惩罚性抑制因子，抑制了ell1缺失突变体对4-NQO的敏感性。在620个转化子中，有74个在0.4-微摩尔4-NQO条件下表现出生长能力。观察发现，这74个转化子中仅有16个在0.8-微摩尔4-NQO存在下能够生长。

携带空载体的ell1缺失菌株以及全部16个转化子均在缺乏4-NQO的平板上表现出生长。仅含有空载体的ell1缺失突变体在0.8 µM 4-NQO条件下不生长，而六个转化子在0.8 µM 4-NQO条件下能够生长，表明这些转化子中存在的文库克隆可能抑制了ell1缺失突变体的基因毒性应激表型。对抑制性质粒84和104进行限制性酶切，分别释放出约1 kb和800 bp的插入片段。

将抑制性质粒克隆重新导入ell1缺失突变体后，可抑制其对4-NQO相关的生长敏感性。然而，在MMS存在条件下，携带ell1缺失突变的抑制性质粒的菌株生长优于含空载体的菌株。此类遗传筛选可用于阐明潜在的耐药机制，并鉴定新型抗菌、抗真菌、抗寄生虫或抗癌化合物的作用蛋白靶点。

他们还可以确定药物的作用机制。