用于鉴定裂殖酵母多拷贝抑制因子的遗传筛选

抑制因子筛选识别遗传相互作用，这些相互作用将揭示目的基因的功能以及它们可能参与体内的途径和生物过程。该技术可以识别两种基因产物之间的遗传关系，而这两种基因产物可能尚未使用其他方法证明。酵母中这种筛选的结果可以扩展到高真核生物，因为大多数基本的生物途径和过程在整个进化过程中都是保守的。

该方案的成功取决于其转化为酵母细胞的高质量和高效率的可用性。因此，在YE培养基板上以32摄氏度培养裂殖酵母菌绒毛1缺失菌株之前，质粒的转化方案。从平板中取出一个充满ell1突变菌株的环，接种5毫升补充的YE培养基，然后在32摄氏度下振荡过夜的同时孵育小瓶。

孵育后，将过夜生长培养物稀释在含有所需补充剂的100毫升新鲜YE培养基中，以在600纳米处达到0.3光密度。将培养基在32摄氏度下孵育，同时以200至550 RPM振荡，直到600纳米的光密度达到对数中期。将100毫升培养物分成两个50毫升离心管后，在室温下以4， 000倍G沉淀细胞10分钟。

丢弃上清液后，将细胞沉淀重悬于一毫升无菌水中。再次离心并弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于一毫升乙酸锂TE中。通过离心沉淀细胞，并将每个细胞沉淀重悬于250微升乙酸锂TE中。接下来，将125微升感受态细胞转移到四个不同的无菌微量离心管中，用于后续转化步骤。将鲑鱼睾丸或鲱鱼精子的载体DNA煮沸一分钟，然后立即将管子放在冰上。

对于每次转化，将 10 微升单链载体 DNA 添加到含有 125 微升感受态细胞的微量离心管中，并通过移液轻轻混合。随后，将50微克粟多酵母cDNA文库加入含有感受态细胞和载体DNA混合物的管中。将试管在室温下孵育10分钟后，加入260微升聚乙二醇 - 醋酸锂溶液并通过移液混合。

将含有转化混合物的试管在 32 摄氏度下孵育两个小时而不摇动。将43微升预热的二甲基亚砜加入试管中，轻轻混合。现在，将管子暴露在 42 摄氏度的热冲击下五分钟。

如前所述沉淀细胞并丢弃上清液，然后移出残留的聚乙二醇乙酸锂TE溶液。将细胞重悬于100微升无菌水中，并将它们接种在一个含有所需补充剂和每毫升0.2微克4-NQO的EMM2板上。然后，通过将平板在 32 摄氏度下孵育五到六天，让菌落出现在平板上。

为了进一步筛选，在每毫升4-NQO存在0.2微克的情况下，在同一培养基板上划线获得的菌落。对于一个文库转化实验，使用 500 微升感受态细胞进行转化，并在 EMM2 平板上板 1 x 10 的转化混合物中加入缺乏 4-NQO 的所需补充剂，以计算转化后获得的文库克隆总数并筛选抑制克隆。向无菌 96 孔微量滴定板的每个孔中加入 100 至 200 微升无菌水。

使用无菌牙签或 20 至 200 微升微量移液器吸头，从含有 4-NQO 的平板上 cDNA 文库转化后获得的每个菌落中挑选少量接种物。将来自每个不同菌落的接种物添加到含有无菌水的板的每个孔中并充分混合。将每个孔中的三微升细胞悬液点到EMM2琼脂平板上，并向平板中加入适当浓度的4-NQO。

在32摄氏度下培养细胞三到四天后，确定显示不同浓度4-NQO生长的菌落作为推定的抑制因子。为了进一步验证抑制因子，在含有每毫升腺嘌呤和尿嘧啶225微克的EMM2培养基中以32摄氏度振荡过夜。孵育结束后，在新鲜的EMM2培养基中将细胞稀释至0.3的光密度，并在32摄氏度下振荡直至对数中期阶段同时生长。

在含有0.4微摩尔4-NQO或0.01%MMS的所需补充剂的EMM2平板上发现适当的连续培养物稀释液。为了控制，在EMM2平板上发现菌株，并添加所需的补充剂，但缺乏任何DNA损伤剂。将平板在 32 摄氏度下孵育三到五天以监测生长。

发现用感兴趣的全长基因或空载体转化的突变菌株分别作为阳性和阴性对照，以及文库转化体。在含有每毫升腺嘌呤和尿嘧啶225微克的EMM2培养基中接种单个酵母菌落，并在32摄氏度下以200至250RPM振荡孵育细胞过夜。在孵育结束时，通过在室温下以4， 000倍G离心2分钟来收获光密度为0.5的10毫升培养物。

除去上清液并将细胞沉淀重悬于0.2毫升裂解缓冲液中。向微量离心管中加入0.2毫升苯酚氯仿异戊醇和0.3克酸洗玻璃珠。通过涡旋试管两分钟进行混合，然后在冰上孵育一分钟。

在室温下以10， 000倍G离心管15分钟。将上层水层转移到新鲜的微量离心管中，加入200微升苯酚氯仿异戊醇。再次以10， 000倍G离心10分钟后，将上层水层转移到新管中。

然后，向管中加入两体积的 100% 乙醇和 1×10 体积的乙酸钠，并在零下 70 摄氏度下孵育一小时。通过在4摄氏度下以10， 000倍G离心15分钟沉淀DNA，并除去上清液。用70%乙醇洗涤DNA沉淀并在室温下风干。

将DNA重悬于20微升无菌水中，并使用3至5微升质粒DNA转化感受态大肠杆菌细胞。使用标准方案，将分离的酵母质粒转化为大肠杆菌TOP10菌株，并将细胞散布在具有所需抗生素的LB平板上。使用标准碱裂解方案从大肠杆菌转化体中分离质粒后，遵循限制性内切酶的适当组合，以检查通过限制性酶切释放插入的DNA片段。

接下来，在ell1缺失菌株中重新转化限制性酶切后显示插入释放的质粒，以检查它们拯救ell1缺失菌株的遗传毒性应激敏感表型的能力。与野生型菌株相比，ell1缺失的Pombe裂殖酵母菌株对4-NQO表现出敏感性。在缺乏4-NQO的平板上获得大量菌落。

然而，在4-NQO平板上获得的转化体较少，因为它们充当ell1零突变体的4-NQO敏感性的惩罚性抑制因子。在620个转化体中，74个在0.4微摩尔4-NQO上显示生长。观察到，74个中只有16个在0.8微摩尔4-NQO存在下显示生长。

ell1缺失菌株用空载体转化，所有16个转化体在缺乏4-NQO的平板上均显示生长。仅含有空载体的ell1缺失突变体在0.8 μmolar 4-NQO处没有生长，6种转化体在0.8 μmolar 4-NQO处表现出生长，表明其中存在的文库克隆可以抑制ell1 null突变体的遗传毒性应激表型。抑制质粒84和104的限制性酶切分别释放了1个ka碱基和800个碱基对的插入片段。

将抑制质粒克隆重新引入ell1空突变体中导致4-NQO相关生长敏感性的抑制。然而，在MMS存在的情况下，含有ell1缺失突变体的抑制质粒比具有空载体的抑制质粒表现出更多的生长。这些基因筛选可以描绘潜在的耐药机制，并确定新型抗菌、抗真菌、抗寄生虫或抗癌化合物的蛋白质靶标。

他们还可以确定药物的作用机制。