Name: 在支持的脂质双层上重建膜系的最小肌动蛋白皮质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 了解在支持脂质双层上重建最小肌动蛋白皮质的方法，用于研究膜系细胞骨架网络动态。该技术允许顺序添加蛋白质而不破坏网络结构，适用于多种细胞骨架研究。

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本工作获得了安盛研究基金和华威大学-惠康基金会定量生物医学计划（惠康ISSF，RMRCB0058）对DVK的资助，NCBS-TIFR对AB和ST的资助，以及惠康-DBT玛格达尔什会士项目（IA/M/15/1/502018）对SM的资助。DVK还希望感谢生物物理学会支持举办了题为&#34;从分子尺度到介观尺度理解多组分细胞骨架网络的挑战&#34;的虚拟学术交流活动，该活动促进了本实验方案合集的形成。

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案提供了一个多功能的平台和实验设计的起点，用于研究细胞膜与皮层之间的界面。关键步骤包括洁净玻璃载片的制备、使用新鲜脂质以高效形成小单层脂泡（SUV）（这两者均影响支撑脂双层膜SLB的质量），以及使用新近纯化的肌球蛋白II蛋白以实现肌动蛋白丝的动态重组。在进行长时间动态成像时，非常关键的是引入氧气清除系统（例如原儿茶酸和原儿茶酸3,4-双加氧酶5,31）。
开放腔室设计允许在不引起脂质流动的情况下，向现有系统中依次添加组分。这相较于常用的封闭腔室方法，或在脂质体中封装蛋白质的研究而言，具有重要优势36。然而，诸如蛋白质诱导的膜形变等相反效应，则无法利用玻璃吸附的脂双层进行研究。
脂质双层可以通过多种不同的脂质组成来形成。该过程始于脂质囊泡吸附到亲水性玻璃表面，随后由于表面与囊泡之间以及囊泡与囊泡之间的直接相互作用，囊泡可能发生自发破裂；或者吸附的囊泡达到临界覆盖度后，少量囊泡破裂形成活性边缘，最终促成双层膜的形成32。除了玻璃之外，还可使用多种基底来构建支撑脂质双层，例如云母（如用于原子力显微镜）、软质基底（如聚二甲基硅氧烷）、聚合物垫层33,34,35，以及跨越电子显微镜载网孔洞的结构14。液滴界面双层是另一种构建稳定、自支撑脂质双层的有趣方法36。将肌动蛋白-肌球蛋白网络引入囊泡或乳液中，是一种在类细胞几何结构中研究这一最小系统的强有力方法37,38，该方法在其他文献中有详细描述39。

活体动物细胞的质膜持续与相邻的肌动蛋白细胞骨架相互作用，二者共同形成一种具有多种细胞功能的活性复合材料1,2。为了研究脂质膜与肌动蛋白界面处的过程，在支撑脂质双层（SLB）上重建细胞骨架网络已被证明非常有效。这种最小系统方法可精确控制细胞骨架网络组分和脂质组成。与巨大单层囊泡的游离脂质膜相比，SLB 的平面几何结构更有利于高效利用前沿显微技术，如超分辨率成像3,4、全内反射荧光（TIRF）5,6,7或干涉散射成像8，以研究细胞骨架网络的空间组织与动态行为。由于溶液中未结合的荧光标记分子对背景信号的贡献极小，TIRF 可为荧光标记组分提供最高的对比度。
本文介绍了一种基本实验方案，用于构建锚定在支撑脂质双层上的肌动球蛋白网络，该体系在研究活性准二维网络的物理特性9,10,11及其对膜结构组织的影响3,5,12,13,14,15,16（图1）领域被广泛应用。该方法不仅限于基于肌动蛋白的网络，还可轻松拓展用于研究微管、中间纤维或混合型复合网络，并结合表面敏感显微镜技术，探究脂质膜蛋白与细胞骨架组分之间的多种相互作用。
为了使本方案保持重点突出，我们未详细描述肌动蛋白和肌球蛋白的纯化与标记，也未详述如何调节和控制肌动蛋白-肌球蛋白网络的收缩性与组织结构。相关内容可参考同期发表于 JoVE 方法合集《用于生物材料、生物物理学和活性物质研究的细胞骨架网络体外重建》中的其他方案17。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg" /> 
图1示意图 体外 肌动蛋白-膜活性复合系统 由Biorender制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨二乙酸)琥珀酰基]（镍盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>琥珀色玻璃小瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP二钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor 细胞培养皿</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>β-酪蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>可选自 Electron Microscopy Sciences，货号 50980296</td></tr><tr><td>盖玻片，#1，直径 25 mm，Gold Seal</td><td>哈佛仪器公司</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，#1，40×22 mm，Gold Seal</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>气密性玻璃注射器，带可拆卸钝头针，容量 10 &amp;micro;L，100 &amp;micro;升，500 &amp;micro;L</td><td>Hammilton</td><td>1700 系列</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>清洗液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>脂质挤出器</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>微尖超声波破碎仪</td><td>声学</td><td>VC750</td><td>3 mm 尖端直径</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>尼康Ti Eclipse TIRF显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td>配备TIRF装置，通过保偏光纤连接至安捷伦（Agilent）MLC400单片式激光合束器，该合束器提供多条激光谱线；使用尼康100倍、1.45数值孔径（NA）油浸物镜，并配备两台512 × 512像素的EMCCD相机（Photometrics Evolve 512）</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland 产品</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 涂层镊子，型号 #2A</td><td>结构探针</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>冷藏微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯箱</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>需要真空和 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 供应</td></tr></tbody></table>

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

活细胞表面为多种细胞过程提供了多功能的活性平台，这些过程源于质膜与下方肌动蛋白皮层之间的相互作用。在过去几十年中，基于支撑脂双层与肌动蛋白丝网络相结合的重建最小系统，已被证明在揭示膜锚定肌动蛋白网络的基本机制与效应，以及研究单个膜相关蛋白功能方面具有重要作用。本文描述了如何重建此类活性复合系统 体外 由流体支撑的脂双层组成，通过膜结合的肌动蛋白结合蛋白与动态的肌动蛋白丝和肌球蛋白马达相偶联，该体系可通过全内反射荧光显微镜直接观察。开放式腔室设计使得系统能够逐步组装，并可系统性地调控多种参数，如连接蛋白浓度、肌动蛋白浓度、肌动蛋白丝长度、肌动蛋白/肌球蛋白比例以及ATP水平。最后，我们讨论了如何控制体系的质量，如何检测并排除常见问题，以及该体系相较于活细胞表面存在的一些局限性。

为便于说明，此处展示光漂白后第一幅图像（即 图3A 中 t = 0 s 时的图像）的典型漂白后恢复曲线，及其对以下函数28（见 图6A）的拟合结果：
<img alt="公式 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;" />
通过拟合该曲线得到的 re 值（23.94 µm）与步骤 2.8.4 中计算出的 re（23.24 µm）非常接近。其中，K 是一个漂白深度参数，可直接从 F0 估算得出（见步骤 2.8.4）。类似地，图 6B 显示了恢复曲线及其对以下函数的拟合结果28：
<img alt="公式 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;" />
我们发现扩散系数的拟合值为 1.34 &#181;m2/s，该值与……的值非常接近 1.39 &#181;m2/，该值由第2.8.4步中的公式计算得出。此处， MF 代表脂双层中可移动部分，即被漂白群体中恢复荧光的比例。脂锚定分子的流动性当然取决于脂质组成及其物理状态（液相或凝胶相）。在使用DOPC为基础的脂膜进行的实验中，其流动性应为 &#62;1 &#181;m2/s，且流动相分数不应低于0.9，以表明脂双层质量良好。我们建议使用无需拟合的手动方法快速检测双层膜的质量与分子流动性。在自动化分析大量FRAP曲线时，拟合方法可能更为适用。此外，若需开展更复杂的FRAP实验以系统表征体系中的扩散行为，我们推荐读者参考Lorén等人的综述。30 有关模型拟合及实验设计中潜在陷阱的更多细节。
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg" /> 
图6：量化脂质双层的扩散系数。（A）&#160;光漂白后第一张图像（图3A 中 t = 0 s）的线扫描轮廓及其对公式4的拟合，用于计算有效漂白半径。（B）漂白区域的恢复曲线及其对公式5的拟合，用于计算扩散系数和可移动组分比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过TIRF显微镜观察支撑脂双层上肌动蛋白-肌球蛋白网络动态组装与组织的上述实验的典型结果如 图7 和补充视频S1所示。
图7展示了连接蛋白、F-肌动蛋白和肌球蛋白II的图像拼接图。
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg" /> 
图7：收缩性肌动球蛋白流动驱动膜-肌动蛋白连接蛋白 HYE 的局部聚集。在向含有 HYE 和 F-肌动蛋白的支撑脂双层（SLB）中加入肌球蛋白 II 后，通过 TIRF 显微镜拍摄的 HYE（YFP 标记）、肌动蛋白丝（用 Atto-635 马来酰亚胺标记）和肌球蛋白 II 丝（用 Atto-565 马来酰亚胺标记）的快照。时间标注在图像上方：0 分钟表示荧光肌丝刚出现在 TIRF 视野中的时刻。在加入肌球蛋白之前（0 分钟），HYE 和 F-肌动蛋白在脂双层上均匀分布。肌球蛋白的活性诱导产生收缩性肌动球蛋白流动，在稳态时形成星状结构（15 分钟），从而驱动与膜偶联的组分（HYE）发生局部聚集。最下方一行为肌动蛋白（黄色）和肌球蛋白 II（洋红色）图像的叠加，显示了不同时间点肌动蛋白与肌球蛋白的组织结构。用于合成这些图像拼接图的原始图像已在 Fiji 软件中对背景信号、非均匀强度模式以及平移运动进行了校正。比例尺 = 10 µm。详细信息请参见 补充视频 S1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液名称</td>
			<td colspan="2">成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Rehydration buffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% 蔗糖, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLB Formation buffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5–6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLB Storage buffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Dilution buffer</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1 mM TCEP 或 DTT, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X ME 或肌动蛋白离子交换缓冲液&#160;</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl₂, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2（4°C 保存）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KMEH 或肌动蛋白聚合缓冲液&#160;</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM ATP 储存液</td>
			<td colspan="2">100 mM ATP 二钠盐, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, pH 7.5（-20°C 保存）&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 目标缓冲液</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2 mM ATP, 5 mM TCEP（4°C 保存）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-buffer</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0.1 mM CaCl₂, 0.2 mM ATP, 0.5 mM TCEP, 0.04% NaN₃, pH 8（4°C 保存）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin II buffer</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10–20 mM HEPES, pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>凝胶过滤层析缓冲液</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150–300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0.1% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>封端蛋白储存缓冲液&#160;</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris·Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5, 20% 甘油&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中所用缓冲液成分列表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>常见问题及其解决方案&#160; 射击&#160;</td>
			<td>问题</td>
			<td colspan="4">原因</td>
			<td colspan="4">可能的解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>脂质双层无扩散现象</td>
			<td colspan="4">导致该问题最可能的原因是盖玻片不洁净，这可能发生在清洗液老化或水浴超声过程中未进行加热时。这些双层膜会呈现“囊泡状”外观，因为破裂的囊泡附着在盖玻片上，但彼此之间未发生融合。使用超过6周的多层脂质体（MLVs）或超过6天的小单层脂质体（SUVs），或加入过少的SUVs，也可能导致囊泡状双层膜的形成。</td>
			<td colspan="4">使用新鲜的清洗液。确保加热器已开启，温度保持在45-65&#176;C使用新鲜的脂质混合物。（使用荧光脂质探针与荧光蛋白探针时，结果可能有所不同。例如，当双分子层存在亚衍射极限缺陷且未进行表面钝化步骤（或钝化无效）时，脂质探针会显示均匀的荧光强度分布，而荧光蛋白探针则可能出现明亮的荧光斑点。）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>脂质双层出现亮斑</td>
			<td colspan="4">长时间孵育SUV以形成双层膜可能导致整体扩散的脂双层，但偶尔会出现明亮的斑块。这些斑块可能是多层双层结构，可吸附大量荧光探针。</td>
			<td colspan="4">与 SUV 孵育 15-20 分钟即可。确保探针未发生聚集：将连接蛋白快速高速离心（300 × g，15 分钟， 4 &#176;C）可以去除聚集体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>脂质双层出现暗孔</td>
			<td colspan="4">当使用陈旧的小单层脂质体（SUVs）制备双分子层并在长时间内进行成像时，会发生这种情况（&#62; 形成后4小时）、溶液pH值因长时间成像而发生显著变化（例如在高ATP状态下并存在某些氧气清除剂时），或表面用β-酪蛋白过度钝化时（加入过多β-酪蛋白超过10-15分钟，或未充分洗涤去除）。</td>
			<td colspan="4">使用新鲜的脂质。降低成像帧率或有效激光照射时间。使用缓冲能力更强的缓冲液。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>脂质双层表现出缓慢的扩散&#160;</td>
			<td colspan="4">高胆固醇含量、长链饱和脂质或带电脂质的脂双层扩散较慢。</td>
			<td colspan="4">在此类情况下，需在高温下制备样品。可同时使用一种简单且经过验证的脂质组合作为对照，与复杂且未经验证的脂质组成进行比较。确保玻璃器皿洁净。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>肌动蛋白不发生聚合</td>
			<td colspan="4">&#160;靶向缓冲液过期，G-肌动蛋白储存液过期，新旧G-肌动蛋白发生共聚合。&#160;</td>
			<td colspan="4">确保 Ca2+ 被 Mg 取代2+ 在聚合前（使用ME缓冲液）。使用新鲜的ATP-Mg2+ 储备液。使用 freshly recycled G-actin。确保加入双层膜的 F-actin（以 G-actin 计）浓度高于 0.2 &#181;M对于较低浓度，使用鬼笔环肽稳定的F-肌动蛋白。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>肌动蛋白不与双分子层结合</td>
			<td colspan="4">膜-肌动蛋白连接蛋白未添加或添加浓度极低——这一点可通过连接蛋白的荧光信号推断。若荧光信号较强，则表明膜-肌动蛋白连接蛋白已丧失与肌动蛋白结合的能力。此外，若连接蛋白非特异性地结合于玻璃表面（当脂双层质量较差时），也可能无法招募肌动蛋白丝。</td>
			<td colspan="4">确保双层膜处于扩散状态。使用新鲜的连接蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>荧光F-肌动蛋白信号较弱</td>
			<td colspan="4">标记肌动蛋白与暗肌动蛋白的比例过低。可能是标记肌动蛋白或未标记肌动蛋白保存过久，导致二者无法有效共聚。</td>
			<td colspan="4">再次回收肌动蛋白，并使用 freshly recycled actin 重新尝试聚合实验。光损伤可能破坏或解聚 F-actin；如有可能，应选用红色或远红染料标记肌动蛋白（以及肌球蛋白）。&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>肌球蛋白不表现出收缩性</td>
			<td colspan="4">可以观察到，在向肌球蛋白浸润的体系中加入ATP后，肌动球蛋白并未出现收缩性。&#160;</td>
			<td colspan="4">检测肌球蛋白的浓度或纯度是否良好。使用 freshly recycled 的肌球蛋白（回收后6周内使用）。向肌球蛋白混合物中添加新鲜ATP可能有所帮助。对缓冲液进行脱气处理并使用氧气清除剂等方法可减少马达蛋白的光损伤。&#160; 更多信息可在 Plastino 等人或 Stam 等人所著的同一方法合集中找到</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>盖玻片不具备亲水性</td>
			<td colspan="4">盖玻片未清洗干净。</td>
			<td colspan="4">清洁的亲水性盖玻片是&#160; 对脂质双层的形成至关重要。清洗程序后，可通过观察水在盖玻片表面的润湿情况，直观判断其亲水性。将少量水滴加至平放的盖玻片上，若盖玻片未彻底清洗，水滴将保持圆形液滴状；而在经过处理、具有亲水性的盖玻片上，相同体积的水会铺展开，形成一层薄水膜。通过观察水在盖玻片表面的润湿行为，可判断使用清洗液/NaOH的清洗步骤是否有效。&#160;.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：常见问题及相应解决方案的故障排除指南。
补充视频 S1：收缩性肌动球蛋白流驱动膜-肌动蛋白连接蛋白 HYE 的局部聚集。 在含有 HYE 和 F-肌动蛋白的支撑脂双层（SLB）中加入肌球蛋白 II 后，对 HYE（YFP 标记）、肌动蛋白丝（用 Atto-635 马来酰亚胺标记）和肌球蛋白 II 丝（用 Atto-565 马来酰亚胺标记）进行 TIRF 显微成像的时间序列观察。时间显示在图像上方：0 分钟为荧光肌丝刚出现在 TIRF 视野中的时刻。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。

活细胞的表面为多种细胞过程提供了多功能的活性平台，这些过程源于质膜之间的相互作用……

在此，我们展示了一种相对简单直接的方法，用于组装膜锚定的肌动球蛋白网络，并利用先进的光学显微技术研究其动态行为。该方法的主要优势在于，我们的实验体系允许依次添加蛋白质和小分子，而不会干扰膜锚定的网络结构。该方法可轻松拓展用于研究其他细胞骨架蛋白或复合网络。该实验方案中最关键的步骤是确保支撑性脂双层正确形成，因此在开始添加细胞骨架蛋白之前，我们必须首先熟练掌握这一环节。首先，取三到五块矩形玻璃盖玻片，放入考林瓶中。打开水浴超声仪，并将温度设定为65摄氏度。将 Coplin 染色缸中装入 2% 清洁溶液，完全浸没盖玻片，并将其放入超声波清洗器中，在全脉冲模式下超声 30 分钟。使用钝头 PTFE 涂层镊子逐个取出盖玻片，用蒸馏水彻底冲洗后，放入另一个装有两倍正常浓度氢氧化钠溶液的 Coplin 染色缸中。将盖玻片在全脉冲模式下超声处理 20 分钟。取出盖玻片，用蒸馏水彻底冲洗，并放入另一个装有蒸馏水的考林瓶中。在开始实验前，将该考林瓶置于配备氮气供应的化学通风橱内。使用手套和镊子将盖玻片取出，并在氮气流下干燥。将两面均干燥后，放置于洁净的塑料网格上并盖上盖子。将装有盖玻片的盒子放入干燥器中，以避免接触灰尘颗粒。然后取已灭菌的PCR管，用锋利的手术刀片切去管盖和底部的锥形部分。取圆柱形半切管，将紫外光固化胶涂于每个切管的光滑边缘，然后将其倒置放置在 freshly cleaned 盖玻片上，使边缘平整地贴合在盖玻片表面。一旦圆柱体放置在盖玻片上后，不得再进行横向移动，以确保胶水不会流入腔室中央空间。将带有盖玻片的腔室放入配备氧气供应和真空装置的紫外臭氧清洗仪中。打开紫外灯，照射三到五分钟，使胶水聚合。取出盖玻片，检测反应室是否泄漏，并丢弃有泄漏的反应室。用SLB形成缓冲液洗涤每个反应室，最后保留100微升缓冲液。用记号笔在100微升处标记缓冲液体积，然后向样品室中加入2微升0.1摩尔的氯化钙，随后向每个样品室中加入8微升SUV溶液，在25摄氏度下孵育15分钟。移除50微升SLB形成缓冲液，使样品室中仅保留50微升，然后向样品室中加入100微升XKMEH溶液并轻轻混匀。在不接触底部的情况下移除100微升缓冲液。加入 100 微升 XKMEH 缓冲液并移除 100 微升，重复洗涤 8 到 10 次。向双层膜中加入 10 微升浓度为 1 毫克/毫升的 β-酪蛋白，轻轻混匀，并在室温下孵育 5 到 10 分钟。用 XKMEH 缓冲液洗涤 β-酪蛋白 3 次，并将缓冲液体积重新补至 100 微升刻度线。在β-酪蛋白孵育期间，取出一份膜-肌动蛋白连接蛋白，从零下80摄氏度迅速在37摄氏度解冻，然后置于冰上。用蛋白稀释缓冲液将该样品稀释至浓度为1 µM。以确定的终浓度将连接蛋白加入溶液中，并轻轻混匀。室温孵育30至40分钟，用XKMEH缓冲液洗涤三到五次，以去除未结合的HSE蛋白。将每个腔室中的缓冲液体积补充至100 µL刻度线。样品现可进行成像。打开显微镜、激发激光器和检测相机。确保激光已校准、物镜已清洁，且软件已准备就绪，可以采集图像。在100倍物镜上滴加镜油，将样品固定在显微镜载物台上，并将物镜聚焦于双分子层。确保激光位置能够使光束在样品上发生全内反射。使用488纳米的激发光。为评估双层膜的完整性，选择双层膜上的一个感兴趣区域，采用信噪比达到5:1或更高的成像条件，快速拍摄几幅视野图像，以完成一次快速荧光漂白恢复（FRAP）检测。暂停录像，关闭TIRF显微镜的视场光阑，将集中的激光束聚焦在双层膜的一个小圆形区域上，以局部漂白该区域的荧光分子。将激光器调至最大输出功率，照射3到10秒以完成光漂白，随后关闭激光器。重新打开视场光阑至原始孔径，将成像条件恢复至漂白前的设置，并立即继续记录视野中荧光信号的恢复过程。检查双层膜是否具有流动性，并将图像保存为16位点TIF文件。将未标记的与荧光标记的G-肌动蛋白按10:1的摩尔比混合，再加入G缓冲液，使G-肌动蛋白的浓度为20 µM。向混合物中加入十分之一体积的10倍ME缓冲液，配制成一次性溶液，在室温下孵育2分钟。接下来，将加帽蛋白储备液在 37 摄氏度迅速解冻，然后置于冰上保存。用 G 缓冲液稀释，使加帽蛋白的浓度为所需终浓度的两倍，然后向肌动蛋白混合液中加入等体积的稀释后加帽蛋白溶液。最后，向反应混合液中加入等体积的新鲜两倍目标缓冲液。溶液的最终体积应为肌动蛋白混合物体积的四倍。确保各组分的最终浓度符合文本稿件中的描述。将样品在25°C避光孵育45至60分钟，以允许聚合反应进行。用平头枪头轻轻吹打五微摩尔的聚合肌动蛋白，并将其加入一个洁净的经高压灭菌的PCR管中。向管中加入一份XKMEH，使终体积超过20微升，并轻轻混匀以避免剪切F-肌动蛋白。从已安装的样品室中移除等体积的缓冲液。将聚合的肌动蛋白溶液加入样品池中，轻轻吹打三次，注意不要触碰底部的双层膜。将样品置于全内反射荧光显微镜（TIRF）上，静置20至30分钟。在F-肌动蛋白加入并达到稳定状态后，从不同视野记录若干图像。肌动蛋白孵育30分钟后，将样品重新放置到显微镜上。检查连接蛋白和F-肌动蛋白通道的信号。如有需要，调整成像条件。选择一个适合长时间延时成像的区域。在加入肌球蛋白之前，以 0.1 至 0.2 赫兹的频率采集 10 到 15 帧图像，然后暂停记录。使用平头吸头从储备管中吸取所需体积的回收肌肉肌球蛋白 II，并加入到一个洁净的经高压灭菌的 PCR 管中。立即向管中加入一滴XKMEH，使总体积超过20 µL，并轻轻混匀。小心地从已安装的样品室中移除等体积的KMEH缓冲液，注意不要扰动样品，然后轻轻将肌球蛋白溶液加入样品室中。切勿反复吹打，以免扰动表面结合的丝状结构。立即恢复延时成像记录，并保存所有图像，然后使用仅含缓冲液的样品为所有通道采集背景图像。将所有图像保存为 TIF 文件。拟合得到的扩散系数为 1.34 平方微米每秒，与基于公式计算的 1.39 平方微米每秒非常接近。光漂白后的线轮廓以及漂白区域的恢复曲线分别符合公式四和公式五。脂双层的可移动组分（代表漂白后恢复的组分比例）大于0.9，表明形成了良好的脂双层。肌球蛋白活性诱导产生收缩性的肌动球蛋白流，在稳态时形成星状样结构，驱动与膜偶联组分的局部聚集。可以采用多种显微技术，例如干涉散射显微技术，以研究无标记肌动球蛋白网络的动力学过程，且不会引起任何光损伤，也可使用超分辨率荧光显微技术。该技术为研究人员探索膜蛋白复合物如何与动态的肌动球蛋白网络相互作用以调控其结构和组成提供了途径。

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Research

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