Name: 演示序列比对以预测跨物种敏感性的工具，用于快速评估蛋白质保存 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:05:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: 了解如何使用SeqAPASS工具进行跨物种蛋白质保守性分析，快速预测化学物质敏感性。本方法帮助研究人员和决策者评估化学品安全性，支持毒性外推和生物通路知识应用。

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作者感谢美国环境保护局计算毒理学与暴露研究中心的 Daniel L. Villeneuve 博士和路易斯安那州立大学环境科学系的 Jon A. Doering 博士对本文早期草稿提出的宝贵意见。本研究由美国环境保护局资助。本文所表达的观点仅为作者观点，不一定反映美国环境保护局的立场或政策，且提及商品名称或商业产品并不表示联邦政府对此类产品的认可。

作者声明无利益冲突。

人们普遍认识到，仅通过实验手段测试足够多的物种以涵盖可能接触毒理学相关化学物质的生物体在基因组、表型、生理和行为方面的多样性是不可行的。SeqAPASS 的目标是最大限度地利用现有且持续增长的蛋白质序列与结构数据，通过分子水平的比较，将已测试生物体的化学物质毒性数据/知识外推至数百乃至数千种其他物种。SeqAPASS 工具旨在通过简化且快速的分析流程，降低科学家、风险评估人员和监管人员在进行蛋白质序列比对时的复杂性，其功能包括透明生成并可下载的汇总表格、交互式数据可视化，以及对濒危物种和常用模式生物的便捷识别。本文描述了运行 SeqAPASS 第1、2、3级的实验方案，用于评估一级氨基酸序列相似性、功能结构域的保守性，以及参与化学物-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用的关键氨基酸。通过每一级 SeqAPASS 分析所获得的证据线可预测不同物种对化学物质的易感性，提供一致且易于解读的数据。迄今为止，该工具已广泛应用于多个领域，包括识别与特定受体结合的化学物质，以及评估脊椎动物生态受体与哺乳动物系统之间的交叉读取潜力。此外，本文还通过两个案例研究——分别聚焦于甲状腺激素分布蛋白 TTR 和 MOR——展示了 SeqAPASS v2 至 v6 版...

传统上，毒理学领域在很大程度上依赖整体动物实验来获取化学品安全性评估所需的数据。这类方法通常成本高昂且耗费大量资源。然而，由于目前使用的化学品数量庞大，且新化学品的开发速度迅速，全球范围内已普遍认识到需要更高效的化学品筛选方法1,2。这一需求以及随之而来的从动物实验转向新范式的变革，推动了多种新方法的发展，包括高通量筛选检测、高通量转录组学、下一代测序技术以及计算建模，这些方法均为颇具前景的替代性测试策略3,4.
评估化学物质暴露可能影响的各类物种的化学安全性一直是一项长期挑战，这不仅存在于传统的毒性测试中，也存在于新兴的替代方法中。比较毒理学和预测毒理学的进步为理解不同物种间的相对敏感性提供了框架，而计算方法的技术进步则持续提升了这些方法的适用性。过去十年中，已有多种策略被提出，这些策略利用现有的基因和蛋白质序列数据库，结合对特定化学物质分子靶点的认识，支持跨物种外推的预测方法，从而将化学安全性评估范围扩展到典型模式生物之外5,6,7,8。
为了推动科学研究成果的实际应用，建立在预测毒理学的基础研究之上，优先开展化学品测试工作，并支持决策制定，美国环境保护署开发了“基于序列比对预测跨物种敏感性”（SeqAPASS）工具。该工具是一个公开且免费的基于网络的应用程序，利用公共数据库中持续扩展的蛋白质序列信息，预测不同物种对化学品的敏感性9。该工具基于以下原理：通过评估某种化学品已知蛋白质靶点的保守性，可判断该物种对该化学品的相对内在敏感性。因此，SeqAPASS能够快速将已知敏感物种的蛋白质氨基酸序列，与所有具备现有蛋白质序列数据的物种进行比对。这一评估过程包含三个分析层级：（1）初级氨基酸序列比对，（2）功能结构域比对，以及（3）关键氨基酸残基比对。每个层级对化学物-蛋白质相互作用的知识要求逐步深入，同时在敏感性预测中提供更高的分类学分辨率。SeqAPASS的一个重要优势在于，用户可根据所关注的化学物-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用的相关信息丰富程度，自定义并进一步优化评估过程，通过增加额外的证据来完善靶点保守性的判断。
首个版本于2016年发布，允许用户以简化的方式评估蛋白质的初级氨基酸序列和功能结构域，以预测化学物质敏感性，并具备基本的数据可视化功能（表1）。已有研究表明，单个氨基酸的差异是影响化学物质-蛋白质相互作用跨物种差异的重要决定因素，进而可能影响物种对化学物质的敏感性10,11,12。因此，后续版本的开发着重考虑了对化学物质直接相互作用具有关键作用的氨基酸残基13。根据利益相关方和用户的反馈，该工具每年发布新版本，新增功能旨在满足科研人员和监管机构在应对跨物种外推挑战方面的需求（表1）。2020年发布的SeqAPASS 5.0版本引入了以用户为中心的功能，包括数据可视化和数据整合选项、外部链接、摘要表格与报告生成功能，以及图形化展示功能。总体而言，该版本的新特性和功能提升了数据整合能力、与外部数据库的互操作性，以及跨物种敏感性预测结果的数据解读便捷性。

<table><tbody><tr><td>电子表格程序</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>任何可用于查看和处理 csv 文件的程序（例如 Microsoft Excel、OpenOffice Calc、Google Docs）均可用于访问数据导出文件。</td></tr><tr><td>基本的计算机配置和互联网接入</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>SeqAPASS 是一个免费的在线工具，可通过互联网连接轻松使用，无需下载软件。</td></tr></tbody></table>

跨物种序列比对预测易感性工具在蛋白质保守性快速评估中的应用演示

Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation

美国环境保护署跨物种敏感性预测序列比对（SeqAPASS）工具是一种快速、免费、在线的筛选应用程序，可帮助研究人员和监管人员将毒性信息外推至不同物种。对于人类细胞、小鼠、大鼠和斑马鱼等模型系统中的生物靶标，已有多种化学物质的毒性数据。通过评估蛋白质靶标的保守性，该工具可将这些模型系统产生的数据外推至数千种缺乏毒性数据的其他物种，从而预测相对内在化学敏感性。该工具的最新版本（2.0–6.1 版）新增了多项功能，可快速合成、解读和使用相关数据，并生成适合发表和展示的高质量图表。
这些功能包括可自定义的数据可视化以及一份全面的摘要报告，旨在总结 SeqAPASS 数据，便于用户解读。本文描述了指导用户提交任务、浏览各级蛋白质序列比对，以及解释和展示结果数据的操作流程。文中重点介绍了 SeqAPASS v2.0-6.0 版本的新功能。此外，还描述了两个应用案例，分别聚焦于利用该工具分析转甲状腺素蛋白和阿片受体蛋白的保守性。最后，讨论了 SeqAPASS 的优势与局限性，以明确该工具的适用范围，并展示其在跨物种外推中的不同应用。

为了展示 SeqAPASS 工具的应用并突出其新功能，本文描述了两个案例研究，分别代表了蛋白质保守性可预测化学物质敏感性在物种间存在差异（人源转甲状腺素蛋白）和无差异（μ阿片受体 [MOR]）的情况。第一个案例通过蛋白质序列/结构比较，用于预测不良结局通路（AOP，定义见表2）的适用范围；第二个案例则侧重于提出与跨物种对废水中阿片类物质敏感性相关的研究假设。这些案例中描述的基本方法可应用于任何化学物质，展示了该工具在决策和科研中的广泛适用性。
甲状腺激素对正常的生长发育至关重要。它们在甲状腺中合成，并分泌到血液中，与分布蛋白结合后被运输至全身14,15,16,17,18。近期研究表明，环境污染物如多氯联苯（PCBs）、多溴二苯...

本文介绍了一种利用美国环境保护署最新版本的跨物种敏感性序列比对预测工具（SeqAPASS）的操作方案。该方案演示了如何应用此在线工具快速分析蛋白质保守性，并对不同物种的化学物质敏感性进行可定制且易于解读的预测。

美国环境保护署跨物种敏感性预测序列比对工具（SeqAPASS）是一种快速、免费、在线的……

在化学品安全领域，SeqAPASS 协议提供了一种快速且简化的流程，用于评估蛋白质在多种物种间的保守性，从而推断毒性和生物学通路的相关知识。SeqAPASS 被开发为一种简化、透明且用户友好的基于网络的界面，旨在实现快速的跨物种外推，供研究人员和决策者共同使用。该工具利用现有物种敏感性信息，应对化学品毒性知识外推的挑战，能够一致地预测数百至数千种无法在实验室条件下进行测试的物种对化学品的易感性。要开始使用 SeqAPASS 工具，请首先访问 seqapass.epa.gov。现有用户可选择登录按钮进入您的账户。新用户可通过选择主页上的链接创建账户。登录 SeqAPASS 工具后，进入“请求 SeqAPASS 运行”选项卡。SeqAPASS 提供了多种有用资源，帮助用户确定查询的蛋白质靶标。这些资源可通过点击“确定蛋白质靶标”下方的下拉按钮进行访问。确定蛋白质靶标后，点击“比较氨基酸序列”下的“按物种”或“按登录号”。例如，若要分析μ阿片受体的保守性，可点击“按登录号”，并在蛋白质登录号框中输入相应的登录号。除非用户已事先确定了蛋白质登录号，否则建议使用物种搜索选项。选择“请求运行”以启动查询。提交查询后，选择页面顶部的“SeqAPASS 运行状态”标签，以查看已提交运行的状态。完成时间将取决于当前工具的使用情况。在“查看 SeqAPASS 报告”标签页中，列出了在指定账户下执行的所有运行记录。选择“查看报告”可在网页浏览器中查看数据，点击“请求所选报告”可打开一级查询蛋白质信息页面，并查看结果及数据自定义选项。如需开展并运行二级 SeqAPASS 分析（用于评估特定蛋白质结构域的保守性），请在一级查询蛋白质信息页面中，点击“二级”标题旁的加号，以加载二级查询菜单。单击“选择结构域”框，以列出查询蛋白的功能结构域。一旦从 NCBI 进化保守结构域数据库中识别出结构域，并在 SeqAPASS 下拉列表中选中该结构域，即可启动二级查询。操作方法是点击“请求结构域运行”按钮。单击“刷新二级和三级运行”以填充二级数据。在“查看二级数据”下方，单击“选择已完成的结构域”框以选定已完成的结构域登录号。然后单击“查看二级数据”按钮以打开结果。数据将显示在“查看 SeqAPASS”选项卡下所选层级的内容中。首先，我们查看第一层级的数据。在“查询蛋白信息”页面，选择主报告或完整报告旁边的单选按钮，以简洁或扩展格式查看数据。物种将显示为“是”或“否”的易感性预测结果，表明该蛋白相对于查询序列是否保守。在报告中，点击相应的蛋白质登录号或物种 ID，可跳转至 NCBI 数据库以获取更多信息。如需查看具有易感性预测结果物种的相应毒性数据，请向右滚动结果表格，查看 ECOTOX 列。点击链接可在 ECOTOXicology 知识库中打开相应物种，以获取毒性数据。除完整报告和主报告外，还可通过选择“查看一级摘要报告”来浏览数据的摘要报告。摘要报告会显示各个分类群的汇总指标和敏感性预测结果。任何格式的报告数据均可轻松下载。选择所需的报告类型后，点击“下载表格”即可将其保存为电子表格文件。要查看二级数据，请滚动至“查看 SeqAPASS”标签页的顶部，然后选择“二级”。二级 SeqAPASS 数据的报告形式与一级数据类似，同时也在“查询蛋白质信息”页面底部提供。选择所需报告类型旁边的单选按钮即可查看相应数据。二级报告展示的信息与一级报告类似，但增加了蛋白质结构域的相关信息。SeqAPASS 数据可轻松可视化，以方便解读。点击“可视化”旁边的加号，然后点击“可视化数据”按钮，即可在新标签页中打开交互式箱线图。在新标签页中，选择箱线图（BoxPlot）按钮。在箱线图页面顶部，控制选项可帮助用户自定义图形。用户可从图中添加或移除分类群组，选择在图例中显示的物种，设置物种名称的显示方式，并高亮特定物种子集，例如受威胁或濒危物种。可视化结果可轻松导出并保存。点击“下载箱形图”以选择文件类型并下载图像。在下载前，用户可自定义图像的文件类型和分辨率。尽管默认的报告设置已能满足大多数分析需求，但可使用“查询蛋白质信息”菜单顶部的子菜单来更改参数。如需记录当前报告设置，可点击“下载当前报告设置”按钮，以下载包含当前应用设置的文件。此操作适用于一级和二级。此处示例为一级分析。要启动三级 SeqAPASS 分析，请进入“一级查询蛋白质信息”页面，点击三级标题旁的加号，以展开三级查询菜单，该菜单支持单个氨基酸残基的比对。在进行三级分析之前，必须通过查阅现有文献来确定特定的氨基酸残基。单击参考文献浏览器旁边的加号以打开参考文献浏览器工具。该工具可帮助您生成预定义的布尔检索式，用于查询现有文献。单击“生成 Google Scholar 链接”以生成文献检索字符串。此内容可直接复制并用于检索目标文献数据库。或者，选择“搜索 Google 学术”将使用预定义的检索字符串自动在 Google 学术中进行文献搜索。选定氨基酸残基后，用户可设置三级分析。选择用户选定物种将要比对和分析的模板序列。此外，可在“附加比对”框中输入其他模板序列。在比对特定序列之前，用户必须输入自定义的运行名称。这将用于标识该次运行。在“选择分类群”框中选择分类群。需要注意的是，对于用户希望评估保护状况的所有分类群，此过程将重复进行。选择所有需要与模板序列进行比对的物种后，点击“请求残基运行”。当所有物种比对完成后，点击“刷新二级和三级运行”，以在“选择三级运行名称”菜单中载入已完成的三级任务。三级数据可按单个分类群或多个分类群进行查看。单击“合并三级数据”以打开合并的三级对话框，并同时分析多个分类群组。在“合并三级报告”对话框中，选择用作比较基准的三级模板，然后选择要比较的已完成任务。按需排列三级任务顺序，然后点击“查看三级数据”以生成三级报告页面。在“三级模板蛋白质信息”页面中，将显示来自模板序列的先前已鉴定的氨基酸位置，并可选择用于比对。在文本框中输入以逗号分隔的位置，或从残基列表中进行选择。输入所有位点后，选择“复制到残基列表”以将残基导入选择框中。确认所有氨基酸位点均已正确选择并核对无误后，点击“更新报告”以使用指定的位点更新比对序列。滚动至页面底部以查看结果报告。与之前的级别相同，选择主报告或完整报告旁边的单选按钮以选定报告类型。三级报告会显示相似的物种和蛋白质，并包含所评估的每个氨基酸残基的比对和保守性信息。要保存报告，请点击报告底部的“下载表格”按钮，并将其保存为电子表格文件。用户还可以选择“查看三级汇总报告”以查看并下载汇总报告表格。要查看三级数据的可视化结果，请点击可视化标题旁的加号，然后选择“可视化数据”以打开新页面。在可视化信息页面上，点击“热图”以打开交互式图形和控制选项。在“可视化”页面的“控制”部分，选择要在热图中显示的分类群，使用箭头按钮进行移位，并可根据需要重新排序。默认情况下，热图可视化会显示物种的常见名称、总体易感性预测结果以及每个氨基酸残基的匹配状态。“控制”标题下的可展开菜单中提供了操作热图设置的选项。在报告选项中，可选择生成简单报告或完整报告，并可在常见名称与科学名称之间切换所显示的物种。在可选选项下，可选择特定物种子集（如直系同源候选物种、受威胁物种、濒危物种以及常用模式生物），并在热图中对其进行高亮显示。在热图设置中，可通过取消或勾选复选框来自定义热图上显示的信息。可以移除敏感性预测结果和敏感性文本，也可以移除氨基酸比对和氨基酸信息。要保存热图可视化结果，请点击“下载热图”并选择所需的文件类型。SeqAPASS 具备决策汇总报告功能，使用户能够同时快速评估不同层级和物种的敏感性预测结果。从结果页面或数据可视化页面点击“将分析层级推送到DS报告”后，数据将被传输至DS报告标签页，在此处可整合并展示所有层级的分析结果。μ阿片受体的一级分析结果显示，易感性阈值为55%，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物以及大多数鱼类物种的相似性百分比均高于此阈值，因此其易感性预测结果为“是”。所有完全低于该阈值的物种，其易感性预测结果为“否”。在二级分析中，μ阿片功能区的相似性阈值为88%，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物及大多数鱼类的相似性均高于此阈值，这为μ阿片受体在脊椎动物中的保守性提供了另一条证据。在三级分析中，所有被评估的物种均被预测为具有易感性。由于这些氨基酸在强效μ阿片受体激动剂和强效拮抗剂的结合中均具有重要作用，这些数据表明，靶向人类受体的阿片类化合物可能与脊椎动物各物种中的受体以类似方式相互作用。SeqAPASS 的第三层级可用于假设生成。即使对于目标蛋白的关键氨基酸残基尚不明确，该工具仍可用于跨物种分析，识别序列中保守或保守性较低的区域。随后可利用分子生物学技术（如定点诱变研究）对这些假设进行验证。SeqAPASS 最初的研究重点是化学靶标。然而，我们的研究正在扩展，以探索主要的代谢酶、转运蛋白以及参与生物富集的蛋白质。

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