Name: 使用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝硬度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝组织弹性模量的方法。该技术可精确定位胶原富集区域，为研究肝纤维化机制提供可靠手段，并可推广至其他软组织研究。

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本工作由捷克科学基金会（18-02699S）、捷克科学院机构研究项目（RVO 68378050）以及捷克教育青年体育部项目NICR EXCELES（LX22NPO05102）资助。CIISB、Instruct-CZ（隶属于Instruct-ERIC欧盟联盟），由捷克教育青年体育部基础设施项目LM2018127以及欧洲区域发展基金项目&#34;UP CIISB&#34;（编号：CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974）提供资金支持，为CF纳米生物技术中心（CEITEC MU）的测量工作提供了财务支持。我们同时感谢位于捷克共和国布拉格的捷克科学院分子遗传学研究所光学显微镜核心设施（Light Microscopy Core Facility, IMG CAS），该项目由捷克教育青年体育部（LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045）和RVO: 68378050-KAV-NPUI资助，为本文所展示的显微成像提供了支持。

作者声明无利益冲突。

本方案提供了一种可重复的原子力显微镜（AFM）测量正常及纤维化小鼠肝组织的逐步操作方法。结合偏振显微镜技术，可实现高空间精度，并利用胶原纤维的双折射特性对其进行可视化观察。此外，本文还详细描述了所获得力曲线的分析方法。AFM刚度测量可在细胞水平上进行，从而能够监测因纤维化疾病发展所导致的肝组织力学性质的局部变化。肝纤维化并非均匀影响整个器官的均一过程；相反，富含胶原的纤维间隔区域与胶原沉积较少或无胶原沉积的区域相互交错分布。因此，刚度变化具有局部微环境特异性，仅影响与损伤区域直接接触的邻近细胞。这种刚度异质性的微尺度特征在AFM杨氏模量图中也清晰可见，表现为高刚度点与接近正常刚度区域相邻。这种差异表明，即使在胶原瘢痕组织区域内，其力学性质也并非均一，因而需要在细胞水平上通过AFM进行精确表征（图4）。
本方案允许在肝脏样本采集后独立进行原子力显微镜（AFM）肝脏硬度测量，因为包埋于OCT中的完整肝叶可在−80 °C长期保存。然而，一旦组织被切片，建议在约2周内完成样品测量，因为我们观察到组织切片在更长时间储存后会逐渐软化（图5）。
配备偏振显微镜的原子力显微镜（AFM）可精确定位肝小叶结构中的感兴趣区域。然而，在解读结果时也需考虑其存在的一些局限性。本研究中获得的刚度值是在室温下测量的。我们假设温度对软组织力学性能的影响较小；但这一因素可能是导致本研究中肝脏组织力学性能数值与已报道的体内数值之间存在差异的原因之一。
此外，本方案允许对肝脏组织进行长达3小时的原子力显微镜（AFM）分析，该过程需要对组织进行温和固定。组织切片的温和固定以及冻融循环很可能会对杨氏模量的绝对值产生影响。因此，所报道的杨氏模量数值可能与 体内 数值。需要进一步研究以优化从肝组织切片测量杨氏模量绝对值的实验方案，这可能通过采用不同的肝组织固定方法来实现。64.
然而，我们观察到经四氯化碳（CCl4）处理3周的小鼠肝脏中富含胶原的区域，其刚度较处理6周的小鼠更高。此类变化与长期损伤过程中纤维化的进展相对应（图4），并表明利用本方案可探测不同处理之间的相对差异。这一结果与Calò等人的观察一致.&#160;，他们发现轻度固定的肝组织切片中，富含胶原与缺乏胶原区域之间的刚度值差异与新鲜组织中的表现相似25。
我们使用了经直径为5.7 µm球形探针修饰的SD-qp-BioT-TL-10&#160;悬臂梁（理论弹性系数约为0.09 N/m），以尽量减少测量过程中对肝组织的机械损伤。5.7 µm的微珠可实现对样品足够的压痕深度以探测其刚度，同时保持样品的完整性。经过多次优化后，也可使用更小直径的微珠，以获得更高分辨率的刚度图谱，但这可能导致杨氏模量值的进一步高估（更多细节参见Crichton等人的研究65）。使用指定的悬臂梁-微珠组合，我们能够对样品刚度进行宽范围表征，范围从数十Pa到约100 kPa。
采用Sneddon模型从力-距离曲线中推导杨氏模量，因为该模型可用于分析使用胶体探针产生的较深压痕62。与赫兹（Hertz）模型不同，Sneddon模型不受接触半径必须远小于球体半径这一条件的限制。该模型进一步假设样品厚度远大于压痕深度30,66。在本研究中，胶原蛋白富集区域的压痕深度约为2 µm，微珠直径为5.7 µm，样品厚度为30 µm；因此，采用Sneddon模型是合适的。对于其他类型的组织，可使用考虑探针与基底间黏附力的其他模型63。
AtomicJ 中的分析通过实施对样品有限厚度的校正，以在推导杨氏模量时尽量减少基底的贡献62,67。在分析所获得的力曲线时，我们采用了一个0.45的单一泊松比，该值此前已被推荐用于软组织器官24。这种近似对计算得到的杨氏模量值影响不大，因为当泊松比从0.4变化到0.5时，根据斯内登（Sneddon）方程计算出的杨氏模量值仅下降至原来的0.893倍。鉴于不同CCl4处理时长之间杨氏模量存在多倍差异，采用近似泊松比所引入的误差仅为边缘性。
我们采用回撤曲线来计算刚度值，因为我们关注的是组织对悬臂所施加载荷的弹性响应，而非对压痕的塑性响应68。由于软组织具有黏弹性响应，拟合回撤曲线可能会高估杨氏模量，这一点需加以注意。此外，我们观察到，使用接近曲线进行数据分析时，纤维化区域与对照区域之间的刚度值趋势相似，尽管其绝对值相应较低（数据未显示）。
在优化实验方案过程中，我们确定了几个对测量结果可重复性至关重要的步骤。首先，在将微珠固定到悬臂梁上时，必须确保微珠大致位于半透明针尖的中心位置，以避免压痕过程中可能出现的机械不平衡。其次，在使用PFA固定肝脏组织时，必须严格遵守解冻和固定的时间限制，改变该步骤的时间可能会显著影响组织切片的力学特性。第三，必须反复校准悬臂梁，并持续监测和输入实时温度值，以避免因温度波动导致刚度值出现人为假象。最后，单个肝脏切片自制备完成后测量时间不应超过3 h，因为覆盖的PBS在较长时间内可能发生蒸发。读者可参考故障排除表（表3）以解决原子力显微镜（AFM）测量过程中遇到的问题，相关内容亦在Norman等人的研究中进行了详细讨论46。
表3：故障排除指南。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table 3v2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
本方案可实现对肝组织的可重复原子力显微镜探测。该方法有望揭示纤维化肝病在微观层面的发生及最终消退过程中的相关信息，并有助于开发针对慢性肝病进展过程中形成的纤维化瘢痕区域的治疗策略。

肝脏是维持生物体稳态的重要器官1,2。慢性肝病每年在全球范围内导致约200万人死亡3。其病因最常见为病毒感染、自身免疫性疾病、代谢综合征或与酒精滥用相关的疾病，并常伴随进行性肝纤维化。肝损伤会引发炎症反应，从而激活细胞在伤口愈合过程中沉积细胞外基质（ECM）。然而，在慢性损伤持续存在的情况下，过量的ECM会在肝脏内形成无法消退的瘢痕组织，进而导致肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌，最终发展为肝功能衰竭4。
肝细胞损伤会立即导致肝脏硬度增加5,6。这会直接影响肝细胞功能，激活肝星状细胞（HSCs）和门管区成纤维细胞，并促使它们转分化为沉积胶原的肌成纤维细胞7,8。纤维细胞外基质（ECM）的沉积进一步增加肝脏硬度，形成肝脏硬化与基质生成细胞激活之间的自我放大反馈环路。
因此，肝脏硬度已成为肝病预后的重要参数。生物力学组织特性的改变可在组织病理学分析诊断出纤维化之前被更早地检测到。因此，针对肝脏硬度的测量技术已在科研和临床应用中得到广泛发展。在临床环境中，瞬时弹性成像（TE）9,10,11,12,13 和磁共振弹性成像（MRE）14,15,16,17,18 已被用于通过检测整体肝脏硬度来无创性地诊断肝脏损伤的早期阶段19。
在瞬时弹性成像（TE）中，低振幅、低频（50 Hz）的超声波穿过肝脏，测量其传播速度，并据此计算组织的弹性模量13。然而，由于超声波在肝脏周围组织中的传播受到干扰，该技术不适用于腹水、肥胖或肋间隙较窄的患者9。
磁共振弹性成像（MRE）基于磁共振成像技术，利用20-200 Hz的机械剪切波作用于肝脏。随后采用特定的磁共振成像序列追踪组织内部的剪切波传播，并据此计算组织的硬度16。瞬时弹性成像（TE）和MRE技术所报告的硬度值均与通过肝活检获取的人肝组织样本经组织学METAVIR评分系统分级所得的肝纤维化程度具有良好相关性20（表1）。TE和MRE也已被应用于啮齿类动物模型，用于科研目的的肝脏硬度测量21,22,23。然而，由于这两种方法均通过组织对传播剪切波的响应来推导硬度值，所得数值可能并不能完全反映组织的绝对力学硬度。
为了直接对啮齿类动物肝脏进行力学表征，Barnes 等人开发了一种模型-凝胶-组织检测法（MGT 检测法），该方法将肝组织包埋在聚丙烯酰胺凝胶中24。该凝胶受到脉冲式均匀力的压缩，由此可计算出杨氏模量。MGT 检测法与一种适用于正常和纤维化肝脏的压痕检测法显示出良好的相关性24（表 1）。
表1：整体水平的肝脏硬度值。 TE与MRE相较于直接法 离体 使用压痕法和MGT检测对不同来源肝脏的弹性模量进行力学测量。E与G之间的关系由以下公式给出 E = 2G (1 + v），其中 v 是样品的泊松比；F0至F4代表METAVIR评分系统中的纤维化评分，其中F0表示无或轻度纤维化，F4表示肝硬化肝脏。缩写：TE = 瞬时弹性成像；MRE = 磁共振弹性成像；MGT = 模型-凝胶-组织；E = 弹性（杨氏）模量；G = 剪切模量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table 1v2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
通用肝脏硬度测量的主要缺点之一是无法提供肝脏内硬度异质性的细胞级分辨率。在纤维化进展过程中，富含胶原的区域相较于周围的实质组织表现出更高的刚性25,26。这种局部硬度梯度会影响定居的细胞，并在驱动肝星状细胞异质性方面发挥重要作用27。因此，为了更好地理解纤维化的进展，需要在显微水平上表征肝脏疾病发展过程中局部力学性质的变化。
原子力显微镜（AFM）能够以高分辨率和高力灵敏度测量组织的力学特性。AFM利用悬臂的针尖对样品表面进行压痕，施加的力可低至数皮牛顿，根据所用针尖的几何形状和尺寸，在微观或纳米尺度上诱导样品产生形变。样品对施加应变的力响应则通过测量悬臂的偏转来获得28。通过记录悬臂接近和回撤过程中的力-位移曲线，并结合适当的接触力学模型进行拟合，可评估样品局部的刚度29。
除了测量特定区域的硬度外，原子力显微镜（AFM）还能提供样品中特定结构的形貌信息，例如胶原纤维的结构。30,31,32已有多个研究描述了利用原子力显微镜（AFM）测量多种健康与病变组织（如皮肤）硬度的应用。32,33，肺34,35, 大脑36，乳腺37,38,39软骨40，或心脏41,42,43,44 来自患者和小鼠模型样本。此外，原子力显微镜（AFM）也已被用于 体外 用于测定细胞和细胞外蛋白质支架的刚度45,46,47.
由于生物样品具有柔软性和易碎性，利用原子力显微镜（AFM）测量其力学性质并非易事。因此，已有多种研究对不同的实验条件和设置进行了标准化，但所得的杨氏模量值仍存在显著差异（Mckee 等人综述48）。与其他软组织类似，不同肝纤维化等级下的肝脏杨氏模量值也表现出广泛的变化（表2）。杨氏模量数值的差异源于AFM操作模式、探针针尖、样品制备方法、样品厚度、压痕深度和施加力、测量过程中肝脏组织的环境条件以及数据分析方法的不同（表2）。
表2：细胞水平的肝脏硬度值。 使用原子力显微镜（AFM）获得的肝脏硬度值用于描述肝脏在细胞水平的机械特性。缩写：AFM = 原子力显微镜；E = 弹性（杨氏）模量；PFA = 多聚甲醛；PBS = 磷酸盐缓冲盐水。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/Table 2v2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
本文介绍了一种通过原子力显微镜（AFM）对肝脏组织中富含胶原的纤维化区域进行杨氏模量可重复测量的方案，结合偏振显微镜实现精确定位。我们采用四氯化碳（CCl4）在小鼠模型中诱导胶原蛋白在肝小叶中央区沉积49，可靠地模拟了人类肝纤维化的关键特征50。偏振显微图像能够利用胶原纤维的双折射特性显示肝脏中的胶原分布51，从而实现对肝小叶内目标区域的精确探针定位52。

<table><tbody><tr><td>原子力显微镜探头</td><td>布鲁克</td><td>JPK NanoWizard 3</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>安道尔</td><td>Zyla 5.5 USB（sCMOS，水冷）</td><td></td></tr><tr><td></td><td>The Imagingsource&amp;nbsp;</td><td>S/N:12310015</td><td></td></tr><tr><td>悬臂梁</td><td>SD-qp-BioT-TL-10，Nanosensors</td><td>S/N:73750F05</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂胶（长工作时间）</td><td>野牛环氧通用胶</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三聚氰胺微珠；直径，5.7 um</td><td>Microparticles公司</td><td>MF-R-5.7</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>&amp;nbsp;IX81</td><td></td></tr><tr><td>疏水性&amp;nbsp; 滑动标记器</td><td>SuperHT</td><td>PAP笔</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>JPK纳米向导&amp;nbsp; v6.1.151</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>AtomicJ v2.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>系统</td><td>Ubuntu 14.04.5 LTS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>减振隔离控制单元</td><td>表格</td><td>AVI-200-S</td><td></td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝脏硬度

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

基质硬化已被认为是肝纤维化进展的关键驱动因素之一。它对细胞行为的各个方面具有深远影响，例如细胞功能、分化和运动能力。然而，由于这些过程在整个器官中并非均匀分布，因此越来越需要在细胞水平上理解组织力学性质的变化。
为了能够监测肝小叶内富含胶原区域的硬化过程，本文提出了一种利用原子力显微镜（AFM）高空间精度测定肝组织弹性模量的实验方案。原子力显微镜是一种灵敏的方法，可用于表征局部力学特性，该特性以杨氏模量（也称为弹性模量）进行计算。将原子力显微镜与偏振显微镜相结合，可根据组织中胶原纤维的双折射特性，精确定位纤维化发生的区域。利用本方案，我们对纤维化小鼠肝脏中富含胶原的区域以及对照组小鼠肝脏相应区域的刚度进行了表征。
随着纤维化的进展，胶原蛋白阳性区域的硬度显著增加。本方案通过使用轻度固定的肝组织，提供了一种高度可重复的原子力显微镜（AFM）测量方法，可用于进一步理解疾病引发的局部组织力学性质变化及其对邻近细胞命运的影响。

采用本方案所述的原子力显微镜（AFM）技术，对来自对照小鼠以及轻度或重度纤维化小鼠的轻度固定的30 µm厚肝脏切片进行检测（纤维化模型分别通过注射CCl4持续3周或6周诱导49）。选择靠近中央静脉的胶原纤维区域进行刚度图谱的测量。在对照组肝脏中，分析了靠近中央静脉的区域，该区域对应于CCl4处理动物中通常形成胶原纤维的部位（图4A）。不同对照组肝脏之间以及单个肝脏切片内胶原富集区域的杨氏模量分布具有一致性和可重复性（图4B：左侧小提琴图）。
在 CCl4 处理的动物中，对应胶原沉积门脉周围区域的刚度图显示，其杨氏模量值显著高于对照组小鼠的相应区域（图 4B：对照组与 CCl4 处理 3 周小鼠的杨氏模量中位数分别为 1.9 kPa 与 2.6 kPa，p = 0.07；对照组与 CCl4 处理 6 周小鼠的杨氏模量中位数分别为 1.9 kPa 与 5.1 kPa，p = 0.02）。此外，随着 CCl4 处理时间的延长，杨氏模量值显著升高（图 4B；CCl4 处理 3 周与 6 周小鼠的杨氏模量中位数分别为 2.6 kPa 与 5.1 kPa，p = 0.04）。这表明随着纤维化进程的推进，胶原沉积区域逐渐变硬，且原子力显微镜（AFM）测量结果能够反映纤维生成过程。
为了评估OCT包埋的肝组织切片长期储存对胶原纤维力学性质的影响，我们检测了经CCl4处理的小鼠肝组织切片中胶原纤维的刚度，这些切片在切割后分别在−80 °C下储存了2周或3个月（图5）。原子力显微镜（AFM）测量结果显示，储存3个月的切片在胶原纤维富集区域的杨氏模量显著低于切片制备后2周内测量的切片（图5；2周与3个月储存时间的杨氏模量中位数分别为4.7 kPa与3.6 kPa；p &lt; 0.001）。因此，在OCT包埋的肝叶制备成切片后，应尽快测量其肝组织力学性质。
<img alt="杨氏模量分析、直方图和小提琴图显示了经 CCl4 处理后的刚度变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：原子力显微镜测量显示富含胶原的区域逐渐硬化，与长期 CCl 处理相关4 治疗 (A对照小鼠及经 CCl₄ 处理小鼠的肝脏切片4 用于测量富含胶原区域机械性能的样本为培养3周或6周的组织。偏振显微镜图像（左）中肝组织切片的框选区域为富含胶原的扫描区域（或对照组肝脏中的相应区域），用于后续原子力显微镜（AFM）测量30 µm x 100 µm，10 像素 × 36 像素）。右侧显示了与这些框选区域对应的带有颜色标尺的杨氏模量图，以及来自这些图的杨氏模量值的直方图；插图中的散点图展示了数值分布 &gt;每种条件下为 10 kPa。肝脏硬化表现为直方图分布逐渐向右偏移，以及插图散点图中数据点频率更高。比例尺 = 20 µm. (B小提琴图显示了每种条件下三个区域测得的弹性模量分布（左）以及所有三张图的汇总弹性模量值（右）。小提琴图展示了中位数（红线）、25th 百分位数和第75百分位数（黑线）；圆点代表来自1-3区各个地图的平均值。所展示的p值采用Student's t检验计算得出 t- 对均值进行的检验。缩写：AFM = 原子力显微镜；CCl4 = 四氯化碳 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="2 周与 3 个月储存后杨氏模量变化的显微镜图像及直方图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63974/63974fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：肝脏切片的长期储存会导致富含胶原区域的刚度下降。 经CCl₄处理的小鼠肝脏切片4 2 周）贮存于 −80 °C 用于测量杨氏模量的样本培养时间为2周或3个月。偏振显微镜图像（左）中框出的部分表示用于原子力显微镜（AFM）测量的富含胶原的区域30 µm x 100 µm，10 像素 × 36 像素）。对应的杨氏模量图谱附颜色标尺（右侧）。直方图显示从每个样本的 4–6 个区域采集的杨氏模量值；插图中的散点图显示具体数值 &gt;每种条件下为 10 kPa。比例尺 = 20 µm缩写：AFM = 原子力显微镜；CCl4 = 四氯化碳 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/63974fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图 S1：使用三聚氰胺树脂微珠修饰悬臂梁的方法。（A）示意图展示了将球形微珠连接至悬臂梁尖端的过程。分步操作说明详见第2节第1部分“将5.7 µm微珠连接至原子力显微镜（AFM）悬臂梁尖端”。（B）从顶部（左）和侧方（右）观察连接在悬臂梁尖端的5.7 µm球形微珠的显微图像。比例尺 = 20 µm。缩写：AFM = atomic force microscopy（原子力显微镜）；RT = room temperature（室温）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S2：AtomicJ 中的数据分析。（A）在 AtomicJ 中打开刚度图的步骤顺序。单击处理力曲线和图谱（x）可打开处理助手。通过单击添加（y）并选择所需文件，可将文件加载至处理助手中。单击下一步（z）进入下一步。（B）用于曲线拟合的参数、适用的接触力学模型以及测量过程中使用的原子力显微镜（AFM）设置。步骤 1–11 对应方案第 3 部分第 5 节“数据分析”中的相应子步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary_fig_2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S3：AtomicJ 中分析数据的概览。 分析数据的预览显示了刚度图（左上窗口）、力曲线（右上窗口）和原始数据（下窗口）。缩写：AFM = 原子力显微镜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63974/supplementary%20fig%203.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们介绍一种利用原子力显微镜测量正常和病变肝脏中富含胶原区域弹性模量的实验方案。同时使用偏振显微镜可对肝组织切片中富含胶原的区域进行高空间精度的定位。

基质硬化已被认为是肝纤维化进展的关键驱动因素之一，其对细胞的多个方面具有深远影响……

我们的实验方案能够区分肝组织切片中富含胶原和缺乏胶原的区域，因此可用于更详细地研究纤维化形成过程。该技术的主要优势在于利用偏振光显微镜定位肝组织切片中富含胶原的区域。我们的实验方案可为肝纤维化的研究提供重要见解，经过一定优化后也可适用于其他软组织（如肺组织）。首先，从零下80摄氏度取出冷冻的肝组织切片，在室温下解冻两分钟。用预冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液在4摄氏度条件下固定切片10分钟，随后用PBS洗涤五次。最后一次洗涤后，用纸巾擦去肝组织切片周围的多余 PBS，并用疏水性标记笔在肝组织切片周围标记出约 2 厘米 × 4 厘米的边界区域。用 PBS 覆盖样品，然后将样品装载到原子力显微镜（AFM）载物台上，并盖上 AFM 探头。在原子力显微镜（AFM）软件中，进入设置选项卡，并勾选自动保存选项，以自动保存所有文件。然后，转至设置选项卡并点击保存设置，指定用于保存测量文件的文件名和目录。通过打开激光并点击接近键，使原子力显微镜（AFM）悬臂探针接近组织表面。接近完成后，点击一次回撤键，使悬臂探针回撤至压电陶瓷扫描器行程的顶端位置。如有需要，使用原子力显微镜探头上的旋钮重新调整检测器位置。关闭激光。此时针尖已位于物镜的焦平面内。接下来，通过点击附件选项卡并选择直接叠加光学校准，将显微镜的光学视野与原子力显微镜（AFM）测量图谱进行叠加。在随后出现的窗口中，点击“下一步”以获取探针在特定区域扫描的一系列图像。再次点击“下一步”进入下一个窗口。在第一幅图像中，手动单击悬臂末端的中心，以在软件中标示针尖位置。可通过输入半径值调整标示针尖位置的圆圈大小，以提高准确性。单击“校准”按钮，可自动检测所有图像中的悬臂针尖位置。通过查看图像确认探针检测的准确性。单击“下一步”，然后单击“完成”以结束光学叠加。接下来，使用偏振图像，在数据查看器选项卡中将载物台移动至绿色框内的富含胶原区域。在“网格”选项卡下定义区域，然后在“数据查看器”选项卡中，于指定的绿色框内长按鼠标左键绘制矩形，以选择富含胶原的区域。单击“确认新扫描区域”，将所选区域设置为测量区域。设置反馈回路的参数。将I增益设为50赫兹，P增益设为0.001。然后将设定点设为1纳牛。根据所研究材料的力学性能和悬臂的刚度选择相对设定点值。设定合适的基线以正确拟合力曲线。然后根据样品表面形貌选择Z轴方向上悬臂的移动长度。将Z轴移动设置为恒定持续时间。将延伸时间设置为1秒，延伸和回缩延迟均设为0。采样率设置为5,000赫兹。在Z闭环前打勾，以在测量过程中自动调节样品与悬臂针尖之间的距离。然后取消选中“engage”按钮，以解除电动载物台的控制。打开激光器，使悬臂接近样品。点击“开始扫描”以采集力-距离曲线。使用开源软件 AtomicJ 分析采集的数据。通过点击“处理力曲线和力图”图标，将力曲线加载到程序中。然后在处理助手界面中，通过点击“添加”按钮，将待分析的力图添加进去。加载地图后，点击下一步。在下一个窗口中指定处理设置。若要使用一组拟合曲线参数自动估算样品与悬臂之间的接触点，请使用接触点的自动估算功能。通过经典的聚焦网格法确定悬臂与样品之间的接触点。选择估计方法为模型无关法，以基于所测力曲线的质量获得最佳接触点判定，该方法需在数据处理优化过程中通过经验确定。使用经典模型（如用于模型拟合的经典L2模型）对力-压痕曲线进行拟合。设置模型对回撤曲线的拟合。对于肝脏等软组织，建议将泊松比设为0.45。使用基线阶数为3、接触阶数为1来设置曲线拟合。根据曲线与模型偏差的程度调整多项式拟合的阶数。选择Sneddon模型作为拟合力-距离曲线的模型。将球形探针的半径填写为2.9微米。通过启用读取功能，从数据文件中加载弹簧常数和invOLS，然后点击完成。数据分析后，逐一检查力曲线，排除悬臂梁接近肝脏切片表面时出现错误的力曲线。这些曲线具有较高的噪声和异常的形状。此后，数据可被复制或导出。在本研究中，采用原子力显微镜（AFM）检测了对照小鼠以及通过注射四氯化碳诱导产生轻度和重度纤维化的小鼠所获得的轻度固定的肝组织切片。在对照组小鼠肝脏中，分析了靠近中央静脉的区域，这些区域通常对应于四氯化碳处理小鼠中胶原纤维形成的部位。在对照组肝脏的不同区域以及单个肝脏切片内的富含胶原区域，杨氏模量的分布具有一致的可重复性。在四氯化碳处理的小鼠中，对应于胶原沉积周围中央区域的刚度图显示，其杨氏模量值显著高于对照组小鼠相应区域。此外，随着处理时间的延长，杨氏模量的数值显著增加。还评估了肝组织切片长期储存对其胶原纤维力学性能的影响。原子力显微镜（AFM）测量结果显示，储存三个月的切片在胶原富集区域的杨氏模量值显著低于两周内测量的切片。肝脏切片的固定时间在很大程度上决定了肝脏切片的力学特性。我们建议必须严格遵守本方案中规定的时间间隔。在对方案进行一定优化后，该方法也可用于其他表现出显著胶原沉积的软组织，此类沉积可通过偏振显微镜检测到。该技术为研究人员提供了一种统一且便捷的方案，用于研究肝脏在健康与疾病状态下的机制。

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科研

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Biology

生物学

使用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝硬度

细胞外基质的刚度显著影响黏附细胞的多种行为。基质刚度在组织内存在空间上的差异，并在多种疾病状态下发生改变。本文中，我们建立了利用原子力显微镜微压痕技术来表征正常及纤维化小鼠肺组织中刚度空间变化的方法。...

利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

我们提供了从小鼠分离主动脉并利用原子力显微镜测量其弹性模量的详细实验方案。...

测量刚度 离体 利用原子力显微镜检测小鼠主动脉

本方案描述了一种增强型超声技术的使用方法，用于无创性地观察和量化非酒精性脂肪性肝病啮齿类动物模型中肝组织的变化。...

超声与剪切波弹性成像在非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型中的应用

量化原子力显微镜（AFM）探针尖端与样品表面之间的接触面积及施加的力，可实现纳米尺度力学性能的测定。本文讨论了在空气或液体环境中，对软质和硬质样品实施基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术以测量弹性模量或其他纳米力学性能的最佳实践方法。...

基于原子力显微镜悬臂的纳米压痕技术：在空气与液体环境中进行纳米尺度力学性能测量

本研究的目的是开发一种用于肝纤维化早期诊断的新型三维数字模型，该模型包含患者肝脏中每个体素的硬度信息，因此可用于计算患者肝脏在不同纤维化阶段的分布比例。...

基于磁共振弹性成像的肝纤维化早期诊断三维数字模型

我们近期发现视网膜毛细血管硬化是糖尿病相关视网膜功能障碍的一种新范式。本实验方案详细阐述了从小鼠视网膜毛细血管及视网膜内皮细胞培养物中分离视网膜毛细血管及其内皮下基质的步骤，随后介绍了利用原子力显微镜测量其硬度的技术方法。...

使用原子力显微镜测量小鼠视网膜毛细血管及其内皮下基质硬度的分离方法

本文旨在指导读者使用集成的原子力-光学成像显微镜对培养中的活细胞进行机械刺激操作。文中提供了一步一步的操作方案，并展示了一组典型的实验数据，用以显示活细胞对机械刺激的响应。...

活细胞对机械刺激响应的集成光学与原子力显微镜研究

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

了解原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝组织弹性模量的方法。该技术可精确定位胶原富集区域，为研究肝纤维化机制提供可靠手段，并可推广至其他软组织研究。

利用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝脏硬度

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